利用比色RPA技术从粗叶提取物中检测秋葵花叶卷曲病毒（Okra enation leaf curl virus），该方法适用于野外采样环境

《Phytoparasitica》：Field-compatible detection of okra enation leaf curl virus using colorimetric RPA from crude leaf extract

本研究开发并验证了一种基于重组酶聚合酶扩增（RPA）的快速检测方法，用于特异性检测印度喜树的Enation叶curl病毒（OELCuV）。该方法在粗提物中表现出高灵敏度和特异性，无需复杂设备，30分钟内即可完成检测，并在90份田间样本中验证与PCR方法一致，适用于推广种植的可持续管理。

　　

摘要

秋葵（Abelmoschus esculentus L.）是一种重要的蔬菜作物，因其营养价值和药用特性而受到重视。由秋葵卷叶病毒（OELCuV；Begomovirus abelmoschusenation）引起的卷叶病严重影响了印度的秋葵生产，导致叶片卷曲、叶柄弯曲、生长受阻和产量下降。快速、灵敏且可在田间使用的诊断方法对于及时管理病毒病至关重要。在此，我们开发并验证了一种基于比色法的重组酶聚合酶扩增（RPA）检测方法，用于从秋葵叶片粗提物中特异性检测OELCuV。首先使用通用 begomovirus 和卷叶病毒特异性引物通过 PCR 对来自新德里 ICAR-IARI 的 15 个有症状样本进行了 OELCuV 的初步检测，随后通过滚环扩增（RCA）、克隆、测序和序列分析进行了确认鉴定。RPA 是一种快速、高灵敏度且用户友好的等温技术，能够在恒定温度下检测低浓度的 RNA 或 DNA 标本，即使在粗提物中也是如此。该技术具有设备要求低、检测时间短、多重检测能力强的优点，并且适合作为便携式和成本效益高的现场病毒检测平台，也可用于其他植物病毒的检测。我们设计了针对包膜蛋白（AV1）和前包膜蛋白（AV2）的两组引物，其中 AV1 引物具有高特异性，且不与其他秋葵病毒发生交叉反应。评估了九种提取缓冲液，发现磷酸盐缓冲液提供了最佳的模板效果。RPA 检测方法在 37°C 下运行 30 分钟，可检测低至 10^–9 的 OELCuV 浓度，并显示出比传统 PCR 更高的分析灵敏度。通过对来自印度六个地区的 90 个秋葵田间样本进行验证，发现所开发的 RPA 方法与 PCR 的检测效率相当，两种方法的结果一致。加入羟基萘酚蓝（HNB）后可实现可视化终点检测，无需使用琼脂糖凝胶分析或其他专用设备。对 RCA 扩增的完整 DNA-A 基因组片段进行序列分析后，发现其与全球 OELCuV 分离株（NCBI 登录号 PP236444）的核苷酸一致性为 91.5%–99.5%。这种成本效益高的检测方法为现场 OELCuV 检测提供了便携式平台，并可扩展用于其他病毒检测，有助于促进秋葵的可持续种植。

秋葵（Abelmoschus esculentus L.）是一种重要的蔬菜作物，因其营养价值和药用特性而受到重视。由秋葵卷叶病毒（OELCuV；Begomovirus abelmoschusenation）引起的卷叶病严重影响了印度的秋葵生产，导致叶片卷曲、叶柄弯曲、生长受阻和产量下降。快速、灵敏且可在田间使用的诊断方法对于及时管理病毒病至关重要。在此，我们开发并验证了一种基于比色法的重组酶聚合酶扩增（RPA）检测方法，用于从秋葵叶片粗提物中特异性检测 OELCuV。首先使用通用 begomovirus 和卷叶病毒特异性引物通过 PCR 对来自新德里 ICAR-IARI 的 15 个有症状样本进行了 OELCuV 的初步检测，随后通过滚环扩增（RCA）、克隆、测序和序列分析进行了确认鉴定。RPA 是一种快速、高灵敏度且用户友好的等温技术，能够在恒定温度下检测低浓度的 RNA 或 DNA 标本，即使在粗提物中也是如此。该技术具有设备要求低、检测时间短、多重检测能力强的优点，并适合作为便携式和成本效益高的现场病毒检测平台，也可用于其他植物病毒的检测。我们设计了针对包膜蛋白（AV1）和前包膜蛋白（AV2）的两组引物，其中 AV1 引物具有高特异性，且不与其他秋葵病毒发生交叉反应。评估了九种提取缓冲液，发现磷酸盐缓冲液提供了最佳的模板效果。RPA 检测方法在 37°C 下运行 30 分钟，可检测低至 10^–9 的 OELCuV 浓度，并显示出比传统 PCR 更高的分析灵敏度。通过对来自印度六个地区的 90 个秋葵田间样本进行验证，发现所开发的 RPA 方法与 PCR 的检测效率相当，两种方法的结果一致。加入羟基萘酚蓝（HNB）后可实现可视化终点检测，无需使用琼脂糖凝胶分析或其他专用设备。对 RCA 扩增的完整 DNA-A 基因组片段进行序列分析后，发现其与全球 OELCuV 分离株（NCBI 登录号 PP236444）的核苷酸一致性为 91.5%–99.5%。这种成本效益高的检测方法为现场 OELCuV 检测提供了便携式平台，并可扩展用于其他病毒检测，有助于促进秋葵的可持续种植。