FTO–CHRM3轴调控多发性骨髓瘤的进展：基于机器学习的识别方法

《Annals of Hematology》：FTO–CHRM3 axis regulates multiple myeloma progression: a machine learning-based identification

　　摘要
背景
脂肪质量与肥胖相关（FTO）与多发性骨髓瘤（MM）的进展有关，但其作用机制尚不明确。

方法
通过机器学习和相关性分析，识别出具有一致表达模式的基因作为FTO相关基因。此外，通过免疫组化验证了FTO及其相关基因在MM组织中的表达水平。通过免疫浸润分析评估了FTO相关基因表达对MM免疫微环境的影响。单细胞RNA测序（scRNA-seq）阐明了细胞表达模式。

结果
发现FTO在MM中显著上调，并与不良预后相关。鉴定出四个潜在的FTO相关基因（CHRM3、GINS3、RRM2和SHCBP1）。相关性和免疫组化分析进一步聚焦了FTO-CHRM3轴。功能富集分析显示FTO和CHRM3参与了“DNA复制”和“细胞周期”。在高FTO/CHRM3表达组中，M2巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的浸润发生了改变。scRNA-seq突出了MM中SLC8A1在钙信号通路中的单核细胞特异性表达。

结论
FTO-CHRM3轴通过钙信号通路的失调促进MM的进展，探索其潜在机制为针对MM的干预提供了见解。

引言
多发性骨髓瘤（MM）是第二常见的血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓内恶性浆细胞的克隆性增殖。过去几十年中，通过引入蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、单克隆抗体、CAR-T疗法和自体干细胞移植，MM的治疗格局发生了革命性变化。这些进展显著提高了患者的生存率和临床结果[1]。然而，耐药性的出现和疾病复发仍然构成重大临床挑战，MM仍然是一种无法治愈的疾病。越来越多地认识到，MM的进展是由多种因素驱动的，主要涉及遗传异常、骨髓微环境的重塑和表观遗传改变[2]。尽管如此，MM的病因仍不清楚，这突显了继续研究其分子机制和发现新的治疗靶点的必要性。

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最丰富和保守的内部RNA修饰，尤其是在高等真核生物中。过去几十年中，m6A介导的生物学功能越来越多地被证实与各种肿瘤类型的进展有关[3]。它由甲基转移酶（“写入者”）和去甲基化酶（“擦除者”）如脂肪质量与肥胖相关（FTO）和ALKBH5动态调节[4]。FTO基因最初通过2007年的全基因组关联研究与人肥胖相关，后来被确定为由于内含子变异而成为主要的遗传风险因素[5]。最近的研究表明，FTO在MM患者中高度表达，其过表达与不良临床结果相关。机制上，FTO通过YTHDF2依赖性调节HSF1/HSP信号通路来增强恶性细胞的增殖、迁移和侵袭，从而在MM中起致癌作用[6]。此外，FTO在耐药性MM细胞中高度表达，它以m6A依赖的方式下调SOD2，导致细胞内活性氧（ROS）的显著积累，从而激活经典的NF-κB信号通路并促进耐药性[7]。m6A去甲基化酶FTO与MM的进展密切相关，但其作用机制尚未完全阐明。

在这项研究中，结合了一系列先进的生物信息学方法和公共数据库资源来筛选FTO相关基因。该研究全面阐明了FTO及其相关通路在疾病进展中的机制作用，为理解MM的发病机制提供了新的视角。

材料与方法
数据收集和研究设计
GSE118985（GPL570）作为训练队列1，包含750个骨髓组织转录组数据样本（682个MM样本和68个对照样本）。此外，MMRF-COMMPASS数据集（Illumina）来自UCSC Xena平台（https://xenabrowser.net/），作为训练队列2，包含859个MM骨髓样本及其相应的临床特征和随访信息。数据集GSE118985、GSE24870、GSE24080和GSE124310从基因表达组学（GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）获取。具体来说，数据集GSE24870（GPL571）和GSE24080（GPL570）分别作为验证队列1和2，包含43个（MM：对照=23:20）和559个（全部为MM样本）骨髓组织转录组数据（表S1）。scRNA-seq数据集GSE124310（GPL16791）包含32个人类骨髓组织样本，分为9个对照样本和23个MM样本。图S1是本研究方法的流程图。

统计分析
所有分析均在R版本4.4.1中进行，组间差异使用Wilcoxon检验或log-rank检验进行评估，显著性水平设定为P<0.05。具体方法请参阅补充材料1。

结果
FTO基因表达水平及其分子机制对MM的影响
首先，在训练队列1和验证队列1中检查了FTO基因的表达模式。结果表明MM组和对照组之间存在显著的表达差异，MM组表现出上调趋势（图1A）。这表明FTO可能在MM的发展和进展中起关键作用。KM曲线显示，高FTO表达患者的生存概率显著低于低表达患者（图1B）。通过分析FTO表达水平与患者结果之间的相关性以及相关生物通路，揭示了FTO表达在塑造患者预后中的关键作用。进一步的研究发现FTO表达水平与患者年龄（>65岁或≤65岁）和疾病阶段（I~III期）之间存在显著差异（图1C）。此外，卡方检验显示高FTO表达组和低FTO表达组在年龄和阶段亚型分布上存在显著差异（图1D）。药物敏感性分析显示高FTO表达组和低FTO表达组对189种药物的敏感性存在显著差异（adj.P<0.05，表S2）。值得注意的是，如喜树碱、长春碱和顺铂等药物表现出不同的敏感性，表明FTO表达水平可能影响对这些药物的治疗反应。

图1
关于脂肪质量与肥胖相关（FTO）的相关研究。箱形图显示了MM和对照组之间FTO的表达差异。左侧面板代表训练集1，右侧面板代表验证集1。B 高FTO表达组和低FTO表达组的Kaplan-Meier（KM）曲线。C 分析临床特征中FTO基因表达水平的差异。D 高FTO表达组和低FTO表达组之间的临床特征亚组分布。E FTO的基因集富集分析（GSEA）。F 高FTO表达组和低FTO表达组之间的基因集变异分析（GSVA）。ns，无显著性；* P<0.05；** P<0.01；**** P<0.0001

为了阐明FTO参与MM的分子机制，我们进行了GSEA分析。该分析确定了15个与FTO表达显著相关的通路，包括“细胞周期”、“泛素介导的蛋白水解”、“错配修复”和“剪接体”（图1E）。随后的GSVA分析进一步深入了解了高FTO表达组中多个生物通路的激活和抑制。值得注意的是，“自噬调节”、“氨基酰-tRNA生物合成”、“核苷酸切除修复”和“肌醇磷酸代谢”等通路被激活，而“细胞因子-细胞因子受体相互作用”、“补体和凝血级联”、“MAPK信号通路”和“趋化因子信号”通路则被抑制（图1F，表S3）。

甲基化相关基因的鉴定和功能探索
在训练队列2中，对FTO两组进行差异分析，鉴定出320个DEGs，包括112个上调基因和208个下调基因（图S2A）。进一步的相关性分析确定了36个FTO相关基因（图S2B）。为了阐明这些甲基化相关基因的分子功能和机制，进行了富集分析。GO富集分析产生了224个条目，其中170个在生物过程（BP）中显著富集，14个在细胞组分（CC）中富集，40个在分子功能（MF）中富集。主要富集的条目包括“DNA代谢过程的正向调节”、“G蛋白偶联肽受体活性”、“C-C趋化因子受体活性”和“蛋白质定位到过氧化物酶体”（图S2C）。KEGG富集分析突出了10个显著富集的通路，包括“胰岛素分泌”、“细胞粘附分子”和“病毒性心肌炎”（图S2D）。这些通路涉及细胞信号传导、代谢调节和免疫反应，可能将甲基化与MM联系起来。为了直观展示这些FTO相关基因之间的相互作用，构建了PPI网络，包含36个节点和16个蛋白质相互作用对。RRM2和MKI67观察到与其他蛋白质有多个相互作用对（置信度得分≥0.4）（图S2E）。

鉴定四个潜在的关键FTO相关基因
为了鉴定MM的关键FTO相关基因，对36个甲基化相关基因进行了单变量Cox回归分析和PH假设检验，确定了27个与生存相关的基因（图2A，表S4）。进一步分析显示，四个基因在训练队列1和验证队列1中表现出显著的表达差异和一致的趋势。具体来说，CHRM3在MM中上调，而GINS3、RRM2和SHCBP1下调（图2B）。KM曲线显示CHRM3、GINS3、RRM2和SHCBP1在高表达组中的生存概率较低（图2C-F）。为了验证这些基因的可靠性，使用了101种不同的机器学习算法组合构建预测模型，RSF+CoxBoost被确定为最佳模型（图2G）。所有基因均通过筛选，并被确认为关键FTO相关基因，包括CHRM3、GINS3、RRM2和SHCBP1。

图2
鉴定潜在的FTO相关基因。对36个FTO相关基因进行单变量Cox回归分析。B 在训练集1和验证集1中，四个基因在MM和对照组之间显示出显著差异。C-F。这四个基因的KM曲线。G. 机器学习组合筛选出最佳模型，这些基因被选为潜在的关键FTO相关基因。* P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001；**** P<0.0001

确定MM中的FTO-CHRM3轴
鉴于CHRM3和FTO之间的正相关（cor=0.355），以及CHRM3在MM中的上调，研究了FTO-CHRM3轴影响MM的潜在机制。为此，使用免疫组化技术检查了MM患者骨髓活检中CHRM3和FTO的蛋白质表达水平。我们的发现表明，与正常对照组相比，CHRM3和FTO在MM组织中均显著上调（图3）。

图3
MM和对照组之间CHRM3和FTO的免疫组化结果。A MM和对照组之间CHRM3的免疫组化结果。B MM和对照组之间FTO的免疫组化结果。***, P<0.001

FTO-CHRM3轴的临床相关性和功能分析
进一步研究了CHRM3表达水平与临床特征之间的联系。结果确定CHRM3的表达水平在年龄和疾病阶段组之间存在显著差异（图4A）。卡方检验结果还确定CHRM3表达组在年龄和阶段亚组中的比例存在显著差异（图4B）。药物敏感性测试显示，包括喜树碱、长春碱和顺铂在内的多种药物对CHRM3表达组的敏感性存在显著差异（图4C，表）。

图4
CHRM3的功能研究。A 分析不同临床特征中CHRM3表达水平的差异。B 高FTO表达组和低FTO表达组之间的临床特征亚组分布。C CHRM3的药物敏感性分析。D CHRM3的GSEA。E 高FTO表达组和低FTO表达组之间的GSVA。ns，无显著性；* P<0.05；** P<0.01

值得注意的是，GSEA显示CHRM3在“DNA复制”、“剪接体”、“嘧啶代谢”和“细胞周期”中富集（图4D）。通过GSVA进一步探索了CHRM3不同表达组之间的通路。在CHRM3高表达组中，多个通路被激活，包括“核苷酸切除修复”、“DNA复制”、“蛋白酶体”和“RNA聚合酶”。同时，也有多个通路被抑制，包括“补体和凝血级联反应”、“产生IgA的肠道免疫网络”以及“核糖体”（图4E）。这些发现为理解CHRM3在多发性骨髓瘤（MM）中的生物学功能提供了重要证据。

为了更好地理解FTO-CHRM3轴的功能和联系，进行了GeneMANIA网络分析。该网络包含总共20个相互作用基因和167个相互作用对。具体来说，CHRM3与ENTPD3共定位，并与JAKMIP1和MAGED2有物理相互作用。此外，FTO与TMEM147有物理相互作用，并与HTR7共表达。在“突触后信号转导”、“G蛋白偶联胺受体活性”和“乙酰胆碱受体信号通路”中观察到富集（图S3A）。为了进一步了解FTO和CHRM3在细胞内的具体亚细胞定位，使用HPA进行了亚细胞蛋白定位分析。FTO主要定位于细胞质中，可能也存在于囊泡中，而CHRM3则定位于细胞膜上（图S3B）。在高置信度条件下，CHRM3在1596、2507、2797和4936位点有四个甲基化位点（图S3C）。

FTO对CHRM3的调控影响钙信号通路。在训练队列2中，KM曲线显示FTO+CHRM3+组和FTO-CHRM3-组之间的显著性水平最高（P<0.001），因此选择了这两个组进行差异分析（图5A）。在发现的983个差异表达基因（DEGs）中，有518个基因上调，465个基因下调（图5B）。为了进一步了解这些DEGs的生物学作用，进行了富集分析。GO富集分析得到了1588个条目，其中1326个在生物过程（BP）中显著富集，118个在细胞组分（CC）中显著富集，144个在分子功能（MF）中显著富集（图5C）。KEGG通路富集分析揭示了62个显著富集的通路，包括“细胞因子-细胞因子受体相互作用”、“Th1和Th2细胞分化”以及“IL-17信号通路”（图5D）。GSEA进一步表明CHRM3包含在钙信号通路中（图5E，表S5）。因此，选择钙信号通路作为后续深入分析的关键通路。

FTO-CHRM3轴中差异表达基因（DEGs）的富集分析。A FTO-CHRM3不同表达组的KM曲线。B FTO+CHRM3+组和FTO-CHRM3-组之间DEGs的火山图。C DEGs的基因本体论（GO）富集分析。BP：生物过程；MF：分子功能；CC：细胞组分。D DEGs的京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。E GSEA中的钙信号通路。

全尺寸图像

scRNA-seq分析揭示了MM中FTO-CHRM3-钙信号通路轴的基因表达模式。为了更好地理解FTO-CHRM3轴在MM中的单细胞水平上的作用机制，分析了GSE124310数据集。数据过滤后，共获得了22,837个细胞和20,849个基因（图S4A）。随后，筛选出了变异最大的前2,000个基因，并基于这些高度变异的基因提取了前30个主成分（图S4B-C）。通过聚类分析，这些细胞最终被划分为12个不同的细胞簇（图S4D）。通过与已知标记基因的比较，成功注释了七种类型的细胞，即T细胞、单核细胞、NK细胞、红细胞、B细胞、浆细胞和树突状细胞（图S5A）。确定细胞类型后，重点转移到了FTO基因、CHRM3基因以及与关键通路（钙信号通路）相关的基因上（表S6），这些基因被认为是通过后续分析揭示其特定细胞功能的关键基因。其中，六个基因（CACNA1B、CACNA1E、ERBB4、ATP2B2、GRM1和MYLK2）在数据集中不存在，最终保留了17个关键基因进行进一步深入研究。为了全面了解这些关键基因在不同细胞类型中的表达模式，可视化了它们在各种细胞中的表达和分布。结果表明，这些关键基因在不同细胞类型中都有表达（图S5B），其中ATP2B4和PRKX在NK细胞中表达。进一步分析不同组之间关键基因的表达差异时，发现只有SLC8A1基因在单核细胞组中表现出显著的表达差异（图S5C）。基于这一发现，单核细胞被确定为伪时间分析的关键细胞类型，以探索细胞随时间的动态变化。分析结果显示，细胞分化过程可以分为三个阶段。比较了对照组和MM组的分化轨迹，主要差异出现在第二阶段（图S5D）。通过分析时间轨迹上关键基因的表达，发现这些关键基因在MM样本的单核细胞分化早期（阶段1）的表达水平相对较高（图S6A）。随着细胞分化的进行，这些关键基因在中后期（阶段2和阶段3）也有表达，且在分化后期（阶段3）的表达更为显著（图S6B）。此外，还分析了细胞之间的相互作用（图S6C）。与对照组相比，发现MM组中单核细胞和树突状细胞之间的相互作用增强，而NK细胞和T细胞之间的相互作用减弱，这为理解它们的MM作用机制提供了新的视角。

讨论

MM是一种由遗传异常和骨髓微环境重塑驱动的常见血液系统恶性肿瘤。FTO是一种依赖Fe2?和α-酮戊二酸（2-OG）的双加氧酶，属于RNA去甲基化酶家族。其主要功能是催化RNA分子中m6A的去甲基化，通过氧化将m6A转化为hm6A，最终还原为腺苷，从而动态调节m6A的修饰水平[8, 9]。在MM中，FTO的过表达通过减少癌基因（如MYC）的m6A修饰来增强其表达稳定性，促进肿瘤增殖和耐药性[8]。针对FTO的抑制剂可以恢复m6A修饰水平，抑制MM细胞增殖并诱导细胞凋亡[10]。此外，MM细胞与骨髓微环境（例如BMSCs、脂肪细胞）之间的相互作用表明，FTO可能通过调节参与谷氨酰胺和脂肪酸代谢的基因表达来影响MM细胞的营养利用效率，从而增强耐药性和生存能力[11]。因此，我们认为FTO作为m6A修饰的关键调节因子，通过“去甲基化介导的癌基因稳定”这一核心机制促进了MM的恶性进展。

通过相关性和免疫组化分析识别出FTO-CHRM3轴后，功能富集显示它们共同参与了细胞周期通路。细胞周期通路是一个调节从一个细胞分裂完成到下一个细胞分裂过程的分子网络。m6A修饰参与细胞周期控制[12]。在脂肪生成的G2阶段，敲低FTO已被证明可以延缓细胞周期进展[13]。在MM中，由于遗传和表观遗传改变，这一通路发生紊乱[14]。值得注意的是，FTO和细胞周期通路在MM中具有共同的致病机制。从遗传-微环境协同作用的角度来看，骨髓微环境中的IL-6/IGF-1激活PI3K-Akt-GSK3β轴以稳定Cyclin D1，而染色体异常（如t(11;14)）也会驱动Cyclin D1的过表达。这些机制与FTO的表观遗传调控协同作用，放大了细胞周期信号[15]。总之，作为m6A去甲基化酶的FTO在MM的发病机制中充当“细胞周期调节器”。通过同时削弱p21并稳定MCL-1，FTO促进了MM细胞中细胞周期的紊乱进展。因此，针对FTO可能代表了一种抑制MM细胞增殖的治疗策略。

我们的分析表明，CHRM3和FTO在MM组织中同步且显著上调，表明FTO-CHRM3轴在该疾病的发病机制中起着关键作用。CHRM3（胆碱能毒蕈碱受体3）是毒蕈碱乙酰胆碱受体的M3亚型，属于G蛋白偶联受体家族，主要介导乙酰胆碱（ACh）的副交感神经信号传导。其激活通过Gαq/11蛋白触发下游信号级联反应。现有研究表明，CHRM3在各种实体瘤中表现出致癌功能[16, 17]。尽管MM是一种与实体瘤发病机制不同的血液系统恶性肿瘤，但CHRM3已被证明通过自分泌ACh-CHRM3信号传导促进增殖并抑制MM细胞凋亡。此外，它还与骨髓基质重塑协同作用，促进耐药性和归巢[18]。其高表达与患者生存期缩短显著相关，支持其作为新型预后生物标志物和治疗靶点的潜力。

基于GSEA结果，本研究进一步确定了涉及CHRM3的钙信号通路作为m6A修饰相关的核心通路。钙信号通路是一种关键的细胞内信号转导机制，通过调节细胞质Ca2?浓度的变化来调节各种生理过程，如增殖、分化、凋亡和迁移。在MM中，FTO的过表达通过稳定CHRM3 mRNA导致CHRM3的持续高表达[19]，随后通过激活Gq/11–PLC–IP?轴触发细胞内储存的大量Ca2?释放[20]。异常激活的钙信号通过下游通路（如CaMKII–NF-κB/NFAT）驱动骨髓瘤细胞的增殖、存活和迁移[20, 21]，同时通过增强破骨细胞活性和抑制骨形成加剧骨破坏。因此，它是MM发生和进展的关键驱动因素。FTO–CHRM3–钙信号通路被认为通过异常激活钙信号促进了MM的发病和进展（图S7）。总之，我们确定了一个新的FTO-CHRM3调控轴作为MM进展的驱动因素。我们的工作表明，FTO介导的CHRM3表观遗传失调破坏了钙信号传导，揭示了MM发病机制中一个先前未被认识的机制，并将这一轴确立为有前景的治疗干预靶点。然而，这项研究存在局限性，例如缺乏实验验证（如基因敲除/通路测定），从而将结论限制在相关性而非因果关系上。由于公共数据库的限制，本研究无法完全纠正临床混杂因素、控制肿瘤纯度和大量骨髓样本中的原发性癌症含量，也无法消除多平台数据集之间的批次/平台效应。本研究未进一步调查CHRM3与甲基化之间的关联，FTO-CHRM3轴的具体调控效应和下游信号通路仅基于相关性分析推断，其确切的功能模式仍有待后续实验研究验证。此外，免疫组化验证使用的样本量相对较小（3:3），需要更大样本量的进一步研究来确认这些结果。在探索性单细胞分析中，未观察到FTO和CHRM3在细胞类型中的显著差异表达。这一结果可能受到样本异质性、技术检测阈值和细胞注释准确性等因素的影响。未来，我们将通过增加样本量、优化实验和分析策略来进一步验证这一点。