加速色谱工艺开发：基于高通量自动化等温特性的疏水相互作用柱模型混合方法

《Journal of Chromatography A》：Accelerating Chromatography Process Development: A Hybrid Approach to Model Hydrophobic Interaction Column Based on High-throughput Automated Isotherm Characterization

本研究提出一种结合机制模型与数据驱动方法的HIC混合建模框架，通过自动化高通量实验平台（如TECAN slurry plates和Hamilton micropipette tips）生成pH和盐浓度二维参数空间的吸附等温线数据，有效缩短了工艺开发周期。模型预测准确，对总蛋白、目标单体及高分子量聚集物的均方根误差分别为0.45、3.66和0.03 mg/mL，验证了其在工业应用中的可行性。

　　

Mohammadreza Aghaaminiha | Marta Suazo | Steven Benner | Gabriele Bano | Kevin Brower | Christian Airiau | Amos Lu

过程建模与数据科学，赛诺菲公司，马萨诸塞州弗雷明汉

摘要

在工业环境中，开发用于蛋白质纯化的疏水相互作用色谱（HIC）过程通常耗时且资源密集，需要大量的实验来优化特定蛋白质-树脂系统的条件。本研究提出了一个混合建模框架，可用于商业色谱过程开发以应对这些挑战。该混合模型整合了力学原理（包括来自集总速率模型的流体动力学和质量传递）以及使用高通量实验平台得出的数据驱动的结合等温线。完全自动化的系统（如浆料板和微吸管尖端）被用来表征单克隆抗体在pH值和盐浓度二维参数空间中的结合等温线。通过将模拟色谱图与目标单克隆抗体（mAb）和高分子量聚集体（HMW）的实验数据进行比较，验证了该模型的预测准确性。对于所有蛋白质、目标单体和HMW物种，均获得了0.45、3.66和0.03 mg/mL的平均平方误差。

引言

蛋白质纯化在生物制药的研发和制造中起着核心作用，确保提供安全有效的治疗产品[1,2]。下游处理，特别是色谱法，对于获得监管批准和市场接受所需的高纯度和产量至关重要[3]，然而，色谱分离的过程开发可能非常耗资源，需要大量的时间、材料和实验工作来优化特定蛋白质-树脂系统的条件[4]。高通量技术的出现使得参数空间的探索速度加快[5]，但蛋白质与树脂之间的相互作用复杂性仍然导致实验数量庞大。应对这些挑战需要创新的方法来简化并改进这一领域的过程开发。

建模方法已成为解决下游过程开发中色谱复杂性的宝贵工具。其中，力学模型因其能够描述对流、扩散、分散和在不同条件下的结合动力学等基本过程而被广泛应用。这些基于第一性原理方程的模型为色谱法提供了有价值的见解和预测能力。力学建模已广泛应用于离子交换色谱（IEX），其中像立体质量作用（SMA）模型这样的等温线方程非常成熟。成功的应用实例包括预测洗脱曲线[6,7]、优化mAb纯化的结合和洗脱条件[8]、开发IEX的结合等温线[9]、预测多模态色谱系统的性能[10]、研究多组分分离[11,12]以及制备色谱中的尺度依赖效应[13]。

相比之下，由于HIC本身的复杂性，对其建模的研究较少[14]。虽然IEX依赖于公认的静电原理，但HIC涉及更复杂的相互作用，这些相互作用受到蛋白质水合、配体疏水性和疏水表面上水分子结构的影响[14,15]。早期的HIC建模工作，如Melander和Horvath关于盐效应的理论框架[16]，随后是结合热力学方法和优先相互作用模型来描述盐依赖性蛋白质吸附的研究[17,18]。改进的Langmuir等温线及相关模型试图解决这些复杂性问题，考虑了蛋白质脱水和结合过程中水分子释放等变量[14,19,20]。HIC的力学模型通常需要大量的实验数据来参数化系统特定的方程[21]。尽管这些模型可能为过程理解提供了坚实的理论基础，但在工业环境中，由于材料、资源和时间的限制，往往无法生成大量实验数据（及其相关的分析表征），或者无法花费大量时间进行模型开发、校准和验证工作。

更广泛地说，力学建模的局限性不仅限于HIC。这些模型严重依赖于关于平衡条件和结合机制的具体假设[22,23]，而这些假设在不同类型的色谱、树脂和生物分子之间可能有很大差异。这种特异性通常需要耗费大量劳动力的实验来表征每个新系统的结合等温线[24,25]。此外，这些模型可能无法解释生物制药过程中的固有变异性，例如原材料性质的变化[22]、具有非线性相互作用的多组分系统[26]，或不断变化的过程条件[27]。

鉴于这些挑战，混合建模作为一种多功能解决方案应运而生，它结合了力学模型的物理洞察力和数据驱动方法的灵活性。这种方法避免了繁琐的结合等温线表征需求，使其适用于更广泛的色谱类型，包括IEX、HIC和混合模式系统。通过利用高通量实验平台，在显著较短的时间内探索更大的参数空间，对行业有益，混合模型能够解决IEX和HIC系统的复杂性，同时保持通用性和预测准确性[28,29]。

多项研究展示了混合建模在色谱学中的潜力[[38], [39], [40], [41]]。例如，研究人员通过将机器学习技术融入传统建模框架来优化蛋白质纯化过程[30]。Narayanan等人特别强调了混合模型通过使用神经网络补充力学方程来预测不同条件下的色谱性能的能力[31]。这种集成使得对结合动力学的理解更加深入，并提高了模型准确性。

Creasy等人提供了一个应用于色谱学的混合建模的有力示例[32]。该研究展示了使用数据驱动方法来表征蛋白质纯化的结合等温线，利用手动进行的高通量实验和微型管生成数据。这种方法成功地对不同盐浓度下的蛋白质-树脂相互作用进行了建模，为更广泛的应用奠定了基础。然而，尽管这项工作具有基础性，但通过引入更多变量和更先进的实验技术，仍有进一步扩展其适用性的空间。

本研究通过引入几个之前未探索的关键领域，扩展了Creasy等人的混合建模框架。首先，我们将参数空间扩展到包括pH值和盐浓度，捕捉它们对蛋白质-树脂相互作用的综合影响。其次，我们不再依赖于使用微型管的手动高通量实验，而是使用TECAN和HAMILTON系统生成的自动化数据。具体来说，我们比较了使用TECAN和HAMILTON系统的浆料板的性能，从而揭示了自动化方法的适用性。第三，当前研究在更详细的集总速率模型中解决了包括单体和HMW在内的多组分系统。第四，我们探讨了HIC的混合建模适用性，由于疏水树脂和盐-蛋白质相互作用的复杂性，HIC较少采用力学建模。

本文提出的混合建模方法旨在增强和加速工业环境中的色谱过程开发。当前的商业过程开发通常依赖于实验方法而非力学建模，因为认为其风险较低。我们提出的混合方法旨在提供一种简约的建模方法，平衡预测能力和减少的数据及专业知识要求，使其适用于工业应用。

本研究的结构如下：首先，比较了使用三种高通量技术（浆料板、微吸管尖端和微型管）生成的等温线。其次，确定表现最佳的等温线技术，并相应地校准柱子和模型参数。第三，根据未见过的实验结果评估校准模型的准确性。最后，探讨了所提出的混合模型在工业重要抛光步骤中的适用性，并进行了简要讨论。

数学方法

在本研究中，我们提出了一种混合建模方法，用于预测色谱过程的动态。该方法使用数据驱动技术来表征结合等温线，而不完全依赖于传统的基于柱子的实验。

树脂、缓冲液和原料

本研究中使用的HIC树脂是CaptoPhenyl High Sub（Cytiva公司，马萨诸塞州）。缓冲液是通过混合50 mM醋酸和5 M氯化钠制备的，其浓度和pH值根据每个独特实验的DoE定义的具体条件进行调整。

作为目标蛋白质使用的mAb是在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中生产的。它经过了初始纯化过程，包括细胞培养澄清和随后的Protein A捕获色谱。

柱实验

所有

等温线模型表征

为了表征本研究中优化目标mAb纯化过程中HIC柱所需的结合等温线模型，比较了三种高通量技术。每种方法都有其独特的优点和局限性。第一种方法是使用TECAN Freedom EVO系列自动化的浆料板。第二种技术使用HAMILTON自动化系统进行微吸管尖端操作。这两种系统都能快速生成大量数据集，便于过程

结论

本研究强调了高通量实验平台（TECAN和HAMILTON）在表征HIC柱结合等温线方面的有效性，以及它们在混合建模框架中的集成。我们的结果表明，使用TECAN自动化的浆料板（孔径为500 μL）生成的结合等温线与参考微型管生成的等温线相当，验证了自动化方法在结合等温线开发中的可靠性。

混合模型结合了

贡献

Mohammadreza Aghaaminiha：方法论、软件、实验工作、数据管理、正式分析、撰写——原始草稿。Marta Suazo：实验工作、正式分析、撰写——审阅和编辑。Steven Benner：概念化、方法论、撰写——审阅和编辑、监督。Amos Lu：方法论、撰写——审阅和编辑、监督。Gabriele Bano、Kevin Brower和Christian Airiau：撰写——审阅和编辑、监督。

缩写

HIC，疏水相互作用色谱；mAb，单克隆抗体；HMW，高分子量；SEC，尺寸排阻色谱。

CRediT作者贡献声明

Mohammadreza Aghaaminiha：撰写——原始草稿、软件、方法论、研究、正式分析、数据管理。Marta Suazo：撰写——审阅与编辑、研究、正式分析。Steven Benner：撰写——审阅与编辑、监督、方法论、概念化。Gabriele Bano：撰写——审阅与编辑、监督。Kevin Brower：撰写——审阅与编辑、监督。Christian Airiau：撰写——审阅与编辑、监督。Amos Lu：撰写——审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：

Amos Lu与赛诺菲公司存在关系，包括就业和股权或股票。Gabriele Bano与赛诺菲公司存在关系，包括就业和股权或股票。Kevin Brower与赛诺菲公司存在关系，包括就业和股权或股票。Christian Airiau与赛诺菲公司存在关系，包括就业和

致谢

本研究得到了赛诺菲美国公司的支持。我们感谢Erika Carragher、Thomas Liao和Naomi Bowles在实验方面做出的宝贵贡献。我们还要衷心感谢Russel Rondeau、Brian Murray、Diya Bhat、Akshat Mullerpatan、Olivia Amundsen和Thomas Wasylenko提供的有益讨论和建设性反馈。同时，我们也感谢Lijuan Li的建议和修订，这些都对提高研究的清晰度做出了重要贡献。