《Advanced Science》：ETV4 Promotes Colorectal Cancer Progression by Reprogramming Asparagine Metabolism to Remodel the Stromal Microenvironment
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为了解决结直肠癌（CRC）肝转移及肿瘤微环境（TME）重塑的机制问题，研究人员聚焦转录因子ETV4，开展了一项主题为“信号转导、代谢重编程与基质重塑三者耦合”的研究。研究发现，HGF/MET通过ERK1/2–p65轴诱导ETV4表达，ETV4继而转录激活MET与天冬酰胺合成酶（ASNS），形成正反馈环。肿瘤细胞产生的天冬酰胺（Asn）作为旁分泌代谢信号，诱导肝星状细胞（HSCs）向炎症性癌症相关成纤维细胞（iCAF）样活化，进而分泌HGF反哺肿瘤。该研究揭示了“HGF/MET → ETV4 → MET/ASNS → Asn → iCAFs → HGF”的完整环路，为晚期CRC中HGF/MET与Asn代谢通路联合靶向治疗提供了新策略。
结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率主要源于肿瘤向远处器官的转移，其中肝脏是最主要的转移靶点。当癌细胞“远航”至肝脏，它们并非单打独斗，而是迅速与当地的“土壤”——肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）建立联系。在这个微环境中，癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）扮演着关键角色，它们像建筑工人一样，通过分泌各种生长因子和炎症介质，为肿瘤细胞的“殖民”和扩张营造一个“支持性生态位”。在肝脏中，这些CAFs的一个重要来源是肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）。然而，肿瘤细胞究竟是如何“策反”肝脏中的HSCs，让它们“倒戈”为自己服务的？这个过程中，肿瘤细胞自身发生了什么变化？这些问题的答案，对于理解并最终阻止致命的肝转移至关重要。
传统的观点认为，癌细胞的恶性行为主要源于其内部的基因突变和信号通路异常，例如众所周知的HGF（肝细胞生长因子）/MET受体酪氨酸激酶通路，就是驱动肿瘤侵袭和血管生成的关键“引擎”。另一方面，癌细胞为了满足快速增殖的需求，还会对自身的代谢进行“重编程”，比如大量消耗和合成某些氨基酸。近年来，天冬酰胺（Asparagine, Asn）这种非必需氨基酸在乳腺癌转移中的关键作用被揭示，引起了广泛关注。但一个更深层的问题是：肿瘤细胞异常的代谢活动，是否不仅仅是满足自身“口粮”，还能作为一种“信号”，去影响和改造周围的微环境？这两大“引擎”——异常的信号传导和代谢重编程——是如何被协同“启动”并“耦合”在一起，共同驱动转移的？这中间似乎缺少一个关键的“指挥中枢”。
为了回答这些问题，研究人员在《Advanced Science》上发表了一项研究，将目光聚焦于一个名为ETV4的转录因子。转录因子像是细胞的“总指挥”，能够整合上游信号，并决定下游哪些基因被“打开”。研究发现，ETV4正是连接HGF/MET信号、天冬酰胺代谢和肿瘤微环境重塑的核心枢纽。它自身被HGF/MET信号激活，反过来又强力“推动”MET和天冬酰胺合成酶（ASNS）的表达，形成一个自我强化的“正反馈环”，导致肿瘤细胞内天冬酰胺水平飙升。更重要的是，这些被大量分泌到细胞外的天冬酰胺，并非简单的代谢废物，而是化身为一类新型的“代谢信号分子”（可称为“代谢因子”），直接作用于肝脏中的HSCs，诱使它们转变为具有促炎特性的炎症性CAFs（iCAFs）。这些被“策反”的iCAFs随即大量分泌HGF，反过来滋养和刺激那些依赖MET信号的肿瘤细胞，形成一个完整的、自我维持的恶性循环。基于这一机制，研究团队在动物模型中验证，同时抑制HGF/MET信号和天冬酰胺代谢，能够产生“1+1>2”的强大抗肿瘤效果，为治疗晚期结直肠癌提供了极具前景的联合治疗新策略。
研究人员综合运用了多种关键技术来揭示这一复杂机制。在临床样本分析层面，他们利用来自武汉大学中南医院等机构的患者结直肠癌组织、配对癌旁组织以及组织芯片（TMA），通过RNA测序、免疫组化、靶向代谢组学等方法，验证了ETV4、ASNS、MET的表达及其与患者预后的关联。在细胞与分子机制探索中，通过构建ETV4、ASNS、MET的稳定敲低或过表达的结直肠癌细胞系，结合RNA-seq、染色质免疫共沉淀（ChIP）、双荧光素酶报告基因实验，明确了ETV4对MET和ASNS的直接转录调控。在微环境互作研究方面，使用了人肝星状细胞系LX-2、从患者肿瘤新鲜分离的原代CAFs，通过制备肿瘤条件培养基、共培养体系、酶联免疫吸附试验（ELISA）等，阐明天冬酰胺对HSCs/CAFs的活化作用及其后续的HGF分泌。在体内功能验证部分，通过皮下移植瘤、脾脏注射肝转移、以及免疫健全小鼠（C57BL/6）模型，并结合抗MET抗体（Onartuzumab）和L-天冬酰胺酶（ASNase）的药物治疗实验，证实了该通路在肿瘤生长、转移及治疗干预中的关键作用。单细胞RNA测序和空间转录组学分析则用于解析人结直肠癌肝转移样本中细胞亚群的组成、空间分布及细胞间通讯。
研究结果
2.1 ETV4在结直肠癌中频繁上调，并与侵袭性特征和不良预后相关
通过对配对的原发性CRC肿瘤和癌旁组织进行RNA测序，并结合公共数据库分析，发现ETV4是少数在转移灶中仍持续高表达的基因。在多个独立数据集和细胞系中验证了ETV4在mRNA和蛋白水平的高表达。生存分析显示，ETV4高表达与患者总生存期缩短显著相关。单细胞RNA测序和免疫组化证实，ETV4高表达主要定位于肿瘤上皮细胞。
2.2 ETV4在体内外增强CRC细胞的生长和转移能力
在RKO和HCT116细胞中敲低ETV4，或在DLD-1细胞中过表达ETV4，功能实验表明ETV4能促进CRC细胞的增殖、迁移、侵袭，抑制凋亡，并影响上皮-间质转化（EMT）表型。在裸鼠皮下移植瘤和脾脏注射肝转移模型中，ETV4敲低显著抑制了肿瘤生长和肝转移结节的形成，而过表达则产生相反效果。在免疫健全的C57BL/6小鼠MC38模型中也得到一致验证。
2.3 ASNS和MET是ETV4的直接转录靶点，并介导其致癌效应
对ETV4敲低细胞进行RNA-seq和生物信息学分析，结合公共ChIP-seq数据预测，发现天冬酰胺合成酶（ASNS）和受体酪氨酸激酶MET是ETV4的候选靶基因。通过双荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR实验证实，ETV4能直接结合并激活ASNS和MET的启动子。功能上，敲低ASNS或MET能模拟ETV4敲低的效果，抑制细胞恶性表型。在患者数据中，ASNS、MET的表达与ETV4水平呈正相关。
2.4 ETV4通过转录上调ASNS改变天冬酰胺代谢，从而促进CRC细胞增殖和迁移
代谢组学分析显示，ETV4敲低导致细胞内天冬酰胺水平下降，而过表达则使其升高。Western blot证实ETV4正向调控ASNS蛋白表达。挽救实验证明，回补ASNS或外源性添加天冬酰胺，可以逆转因ETV4敲低导致的细胞增殖、克隆形成和迁移能力的缺陷以及新生蛋白合成的抑制。
2.5 HGF/MET信号通过ERK1/2–p65依赖的机制激活ETV4表达，形成正反馈环
用重组HGF处理CRC细胞，能以剂量依赖的方式上调ETV4的mRNA、蛋白水平及启动子活性。机制研究发现，HGF/MET通过激活ERK1/2，进而磷酸化并激活转录因子NF-κB p65，最终诱导ETV4的表达。敲低p65或抑制ERK1/2，均可阻断HGF对ETV4的诱导作用。这与此前发现的ETV4转录激活MET相结合，构成了一个HGF/MET-ETV4-MET的正反馈放大回路。
2.6 天冬酰胺促进肝星状细胞在转移性结直肠癌微环境中向炎症性癌症相关成纤维细胞样活化
对结直肠癌肝转移患者样本的单细胞RNA测序分析发现，成纤维细胞是HGF的主要来源，并可被分为包括炎症性CAF（iCAF）和肌成纤维细胞性CAF（myCAF）在内的亚群，其中iCAF高表达HGF。空间转录组学显示肿瘤细胞与iCAF在空间上邻近。功能实验表明，外源性天冬酰胺或来自HGF预处理的肿瘤细胞的条件培养基，能特异性诱导LX-2细胞（人肝星状细胞系）高表达iCAF相关的炎症因子和表面标志物PDGFR-α，并促进其分泌HGF。而用天冬酰胺酶（ASNase）降解天冬酰胺可阻断此效应。共培养实验证实，被活化的LX-2细胞能通过分泌HGF，以依赖MET信号的方式促进CRC细胞的增殖和迁移。
2.7 天冬酰胺重编程患者来源的CAFs向炎症性、HGF分泌状态转化以促进CRC生长
从CRC患者组织中分离的原代CAFs，在基线状态下呈现myCAF表型（α-SMA+/FAP+）。天冬酰胺处理能下调其myCAF标志物（如ACTA2），上调iCAF炎症标志物（如IL6），并促进HGF的分泌。在体外，原代CAFs能通过分泌HGF，部分挽救ETV4敲低肿瘤细胞的增殖缺陷，此效应可被MET阻断抗体Onartuzumab抑制。在体内共注射模型中，原代CAFs能显著促进ETV4敲低肿瘤的生长，而Onartuzumab治疗可削弱CAF提供的生长优势。
2.8 联合靶向HGF/MET信号和天冬酰胺代谢在体内抑制CRC生长和转移
临床样本分析显示，ASNS和MET在CRC肿瘤中高表达，且与ETV4表达及肿瘤内高天冬酰胺水平正相关，高表达与患者不良预后相关。基于此，在动物模型中测试了联合靶向策略。在皮下瘤和肝转移模型中，相较于单药治疗，联合使用抗MET抗体Onartuzumab和天冬酰胺酶（ASNase）能更显著地抑制ETV4过表达肿瘤的生长和肝转移。
研究结论与意义
本研究系统阐明了ETV4在结直肠癌，特别是肝转移中的核心枢纽作用。它整合了上游的HGF/MET信号，通过转录同时激活MET和ASNS，不仅放大了自身的致癌信号（形成正反馈），还驱动了天冬酰胺的代谢重编程。研究最关键的发现是，肿瘤细胞产生的过量天冬酰胺，作为一种新型的旁分泌代谢信号，直接重塑肝脏转移微环境——它诱导肝星状细胞和原代CAFs向促炎、促肿瘤的iCAF表型转化，而这些活化的基质细胞随后分泌大量HGF，反哺肿瘤细胞，从而形成一个自我维持的恶性循环回路：“HGF/MET → ETV4 → MET/ASNS → 天冬酰胺 → iCAFs/iCAF样HSCs → HGF”。
这一机制的揭示具有多重重要意义。首先，在基础研究层面，它创新性地将经典的致癌信号通路（HGF/MET）、转录调控（ETV4）、代谢重编程（天冬酰胺合成）和微环境重塑（基质细胞活化）四个癌症研究的核心领域串联成一个完整的、动态的作用网络，深化了对肿瘤-微环境互作，特别是代谢信号介导的互作的理解。其次，在临床转化层面，该研究为克服MET单药靶向治疗常见的耐药问题提供了新思路，即同时靶向代谢依赖可能是一种有效策略。研究在临床前模型中成功验证了联合抑制HGF/MET和天冬酰胺代谢的协同抗肿瘤效应，为晚期结直肠癌，尤其是肝转移患者，提供了一种有潜力的联合治疗方案。最后，ETV4-ASNS/MET表达特征和肿瘤内天冬酰胺代谢水平，有望成为预测患者预后和筛选潜在获益人群的生物标志物。
总之，这项工作不仅描绘了一个驱动结直肠癌肝转移的精细分子图谱，更重要的是，它指出了打破这个恶性循环的治疗突破口，为从“生态系统”角度治疗转移性癌症提供了新的理论和实践依据。
