一种综合的形态学-分子生物学方法揭示了外国船舶压载舱沉积物中甲藻 cysts 的多样性

《Marine Pollution Bulletin》：An integrated morpho-molecular approach revealed dinoflagellate cysts diversity in ballast tank sediments of foreign ships

本研究通过光镜与单囊PCR测序结合，分析五艘进港船只压载水沉积物中的甲藻休眠囊，鉴定出59个休眠囊（40种，19属），发现5个中国新记录种及9个有毒/赤潮种（如Gymnodinium catenatum），萌发实验揭示4个物种潜在危害，系统发育分析发现多个未分类物种及新核型，需加强入侵监测与管理。

　　

作者名单：岳彩霞、陶哲、柴照阳、李涛、冯振、吴阳云、胡张曦、刘宇阳、史硕、杨万里、田文、唐颖忠

南京海关辖区动植物与食品检验中心，中国南京，210000

摘要

自20世纪90年代以来，船舶的压载水已成为全球海洋生物扩散的主要载体。压载舱沉积物中的甲藻休眠囊具有显著的生态风险，因为它们可以存活数十年，并可能通过萌发产生“幼体”，从而引发有害藻华。尽管分子技术有所进步，但对压载舱沉积物中甲藻囊的多样性评估仍缺乏可靠的形态-分子方法作为依据。我们结合了光学显微镜观察和单囊PCR测序（LM-ScPCR测序）以及实验室萌发实验，对五艘抵达中国的国际船舶的压载舱沉积物中的甲藻囊进行了鉴定。主要发现包括：1）LM-ScPCR测序共鉴定出59个甲藻休眠囊（其中40个可精确到物种水平，19个可鉴定到属水平），属于35个甲藻物种。其中26个（74.3%）为已知的物种，包括5个在中国新记录的物种以及9种有毒或能引发有害藻华的物种（如Gymnodinium catenatum、Alexandrium ostenfeldii、A. insuetum）。值得注意的是，不同航线船舶上的甲藻物种多样性存在差异；2）囊萌发实验鉴定出4种甲藻物种（2种可精确到物种水平，2种可能是新物种），其中3种可能具有危害性，因为其同属物种的其他成员已被证明具有毒性；3）系统发育分析揭示了多个未分类的分类单元，可能代表新的物种，这些新物种可能带来新的外来物种入侵风险。我们的研究结果进一步表明，需要加强监测和管理措施，以更有效地应对这些入侵威胁。

引言

自19世纪70年代末以来，船舶压载水已成为远洋船舶控制吃水深度、稳定性和平衡的主要介质（Bailey, 2015）。随着全球航运业的发展，压载水的排放对接收区域的海洋生态系统造成了严重负面影响，甚至引发了严重的生态灾难（Bailey, 2015; Carlton, 1985）。压载水从附近港口或沿海地区抽取，其中含有大量浮游生物和悬浮颗粒物，在长途运输过程中这些固体颗粒物会沉积在底部，形成压载舱沉积物（Maglic et al., 2019）。虽然国际海事组织（IMO）实施了《压载水管理公约》以减少物种转移，包括开放海域压载水交换和船上处理系统等措施，但这些措施主要针对水柱中的生物（IMO, 2004）。然而，一个重要的但常被忽视的来源是压载舱沉积物。许多藻类细胞，包括甲藻，在运输过程中会沉积在这些沉积物中。在特定环境条件下（如营养限制、温度波动、缺氧或黑暗），它们会形成耐久的休眠囊。这些休眠囊能够在航行过程中的物理条件（温度差异、缺氧、黑暗等）以及标准处理方法中存活（Ellegaard and Ribeiro, 2018; Gollasch et al., 2015; Hallegraeff, 1998; Ribeiro et al., 2011），从而成为引入有害和非本地物种的持续直接途径，即使船舶的操作符合现行法规。当压载水和压载舱沉积物被排放到新港口时，沉积物的重新悬浮会促进这些休眠细胞的迁移，其中一些细胞可能在新的环境中定居并繁殖（Bolch and de Salas, 2007; Hallegraeff and Bolch, 1991; McMinn et al., 1997; Maglic et al., 2019; Paine et al., 2024; Valkovic and Obhodas, 2020; Xue et al., 2025）。

近年来，全球范围内有害藻华（HABs）的分布范围、发生持续时间和规模以及爆发频率不断增加（Anderson, 1989; Anderson et al., 2012; Tang et al., 2016; Yu et al., 2023），对渔业、旅游业、生态系统和公共卫生造成了严重影响（Anderson et al., 2012; Yu et al., 2023）。大约75%的所有海洋有害藻华事件由甲藻引起（Smayda, 1997），而在所有记录的有害藻华物种中，甲藻占44%（Jeong et al., 2021）。此外，在已知能产生毒素的170多种有害藻华物种中，甲藻占54%（Lin et al., 2019）。甲藻有害藻华的全球传播与其生命周期中的休眠囊形成策略密切相关（Figueroa et al., 2010; Tang et al., 2021）。甲藻营养缺乏、环境压力和其他不利条件下的营养体细胞会形成休眠囊，这些休眠囊能在沉积物中存活很长时间，然后在条件适宜时萌发，重新进入水柱（Anderson and Morel, 1979; Bravo and Figueroa, 2014; Grigorszky et al., 2006; Tang et al., 2021; Zonneveld and Susek, 2007）。休眠囊的形成有助于它们通过自然过程或人类活动（如贝类移植和船舶压载水/沉积物转移）进行传播（Hallegraeff and Bolch, 1991; Shang et al., 2019, Shang et al., 2024; Tao et al., 2025b）。特别是通过有性生殖形成的休眠囊，由于基因重组而具有高度遗传多样性（Bravo and Figueroa, 2014），能够在海洋沉积物中存活长达150年（深度156±27厘米）（Belmonte and Rubino, 2019; Ellegaard and Ribeiro, 2018; Delebecq et al., 2020），从而增强了它们对环境变化的适应能力，增加了它们作为入侵物种的可能性。因此，通过压载舱沉积物无意中引入甲藻休眠囊对沿海和河口生态系统、人类健康以及全球经济构成了重大风险（Casas-Monroy et al., 2011; Hallegraeff and Bolch, 1991; Shang et al., 2024; Tao et al., 2025b）。

鉴于甲藻休眠囊带来的重大生态风险，已进行了大量研究，通过形态学鉴定和萌发实验来调查压载舱沉积物中的甲藻囊多样性，尤其是有毒和有害物种。据估计，一艘抵达澳大利亚港口的船舶的压载舱中可能含有超过3亿个活的Alexandrium囊，其中一些在实验室中成功萌发了（Hallegraeff and Bolch, 1992）。Hallegraeff and Bolch（1991）发现，在进入澳大利亚港口的80艘船舶中，有40%含有活的甲藻囊。Hamer等人（2001）在抵达英国和威尔士港口的船舶压载舱沉积物中鉴定出48种甲藻，其中四分之一的样本中检测到了Alexandrium物种。然而，这些传统方法存在局限性，尤其是在鉴定形态相似或简单的休眠囊时（Shang et al., 2024; Shang et al., 2019）。随着分子技术的发展，高通量宏条形码分析已被用于检测海洋表面沉积物和压载舱沉积物中的甲藻囊物种多样性（Gao et al., 2019; Shang et al., 2019）。然而，宏条形码技术在野外沉积物中检测囊的可靠性仍存疑，因为该方法无法提供囊的形态信息或验证检测到的DNA序列是否来自囊而不是营养体细胞或细胞碎片。结合形态学和分子方法（之前已证明可用于鉴定浮游生物细胞）为海洋沉积物（Liu et al., 2023; Tao et al., 2025a）和压载舱沉积物（Shang et al., 2024; Zhang et al., 2020）中的甲藻检测提供了有前景的替代方案，因为它结合了光学显微镜观察（LM）和单囊分子鉴定，尽管其实用性受到耗时程序和相对较低的成功率的限制。

作为全球航运强国，中国的船舶维修行业经历了快速扩张。这一领先地位带来了重大的环境后果，据估计，超过60%的全球压载水沉积物（基于中国在全球船舶维修活动中的主导地位，因为压载舱沉积物主要在船舶维修和维护作业中清除，而不是日常作业）被排放到中国港口（Zhao et al., 2020），由于潜在的甲藻囊入侵，这构成了严重的生物安全威胁。为了评估潜在的生物入侵风险，特别是那些能引发有害藻华和有毒物种的风险，我们采用形态-分子方法（光学显微镜观察结合单囊PCR测序，LM-ScPCR测序）研究了抵达中国江阴港的外国船舶压载舱沉积物中的甲藻囊多样性。为了评估压载舱沉积物中甲藻囊的活力，我们还进行了萌发实验。值得注意的是，一些物种通过全面的rDNA测序和系统发育分析无法精确到物种水平，这些物种可能是新的。本研究为监测有害藻华和有毒甲藻以及防止外来甲藻物种入侵提供了参考。

样本采集与处理

收集了抵达江阴港的五艘船舶（“MARAN SUN”、“THETIS”、“CAPE NATALIE”、“WARIYA NAREE”、“XIN YANG PU”）的压载舱沉积物，它们的航线和采样日期见表1。沉积物样本用无菌勺子收集到无菌袋中，并在4°C的黑暗环境中储存，直到进一步处理。这些样本在上述实验室环境中储存了3-5年，然后进行单囊观察、萌发和单囊PCR检测

成功鉴定到物种水平的甲藻囊

通过对从浓缩的囊集合中单独分离出的囊进行单囊光学显微镜观察和PCR测序，成功对五艘船舶压载舱沉积物中的59个囊进行了测序。其中，13个囊来自CAPENATALIE，7个来自MARAN SUN，15个来自THETIS，12个来自WARIA NAREE，12个来自XINYANGPU。每艘船舶大约处理了等量的沉积物（约64克）用于囊的分离，表明成功测序的囊数量存在差异

讨论

以往对压载舱沉积物中甲藻囊的鉴定主要依赖于形态学方法，利用囊的形状、大小、细胞内容物、壁结构和孔结构等特征进行物种区分（Gu et al., 2011; Hallegraeff and Bolch, 1992; Tang et al., 2021）。虽然这种方法对具有明显形态特征的囊有效（例如Polykrikos kofoidii和Lingulaulax polyedra），但它存在局限性：

结论

在这项研究中，我们采用了LM-ScPCR测序（光学显微镜观察和单囊PCR测序），分析了抵达中国的五艘外国船舶压载舱沉积物样本中的甲藻囊物种多样性，成功获得了59个甲藻囊的形态图像和28S rDNA序列。我们的结果实现了40个囊的精确物种水平鉴定（67.8%），其余19个囊的属水平鉴定（32.2%），其中包括9个有毒物种

作者贡献声明

岳彩霞：撰写初稿、研究设计、资金获取、数据分析。陶哲：方法论设计、研究、数据分析。柴照阳：研究、资金获取、数据分析。李涛：研究。冯振：研究。吴阳云：研究。胡张曦：方法论设计。刘宇阳：方法论设计。史硕：验证。杨万里：验证。田文：撰写、审稿与编辑、概念构思。唐颖忠：撰写：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本研究得到了中华人民共和国海关总署研究项目（资助编号：2025HK047、2024HK042）、江苏省优秀博士后人才资助计划（资助编号：2025ZB121）、南京海关研究项目（资助编号：2025KJ25）、国家关键研发计划（资助编号：2024YFF0506901）以及国家自然科学基金（资助编号：42406210）的支持。