生物相容性交联水凝胶中营养物质扩散的测定：一种基于智能手机的分析方法

《Next Materials》：Determination of nutrient diffusion through biocompatible cross-linked hydrogels: A smart phone based analytical method

　　

水凝胶（Hydrogel）是含水的亲水性有机或无机聚合物网络。这类材料展现出多种可塑特性，能够针对特定需求进行设计，使其在生物医学工程、药物递送载体、生物传感器、色谱技术、生物修复过程、创伤愈合及再生医学等研究领域具有广泛应用价值。水凝胶的有效性取决于其物理化学性质，包括组成、交联度（Degree of Cross-linking）、机械强度和孔隙率等，这些因素均会影响溶质扩散、溶胀能力等性能。

明胶（Gelatin）作为胶原的天然衍生物，因其无毒性、低免疫原性、生物相容性、生物可降解性、热响应性及细胞黏附性等特性，成为多种水凝胶基应用的理想候选材料。其组成中富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等氨基酸，有助于维持结构完整性。由于明胶水凝胶机械稳定性较差，研究人员采用多种方法进行交联以改善其结构、形状保真度及适用性。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinamide, NHS）是常用的交联剂，可增强明胶的热稳定性、可调刚度及其他机械性能，且具有良好的细胞相容性，并已获得FDA批准。这些交联剂通过酯中间体在明胶单体的羧基和氨基之间形成零长度连接，该反应高度有序，不改变任何侧链，且反应条件温和。改性后的明胶水凝胶表现出优异的热抗性、强度和形状保持能力，这对三维生物打印（3D Bioprinting）和承重应用至关重要。

该研究的创新之处在于采用基于智能手机的分析方法来估算水凝胶中的扩散动力学。传统的弗朗茨扩散池（Franz Diffusion Cell）、光漂白后荧光恢复法（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）和紫外分光光度法等微观尺度扩散测量方法需要精密仪器、专业培训才能操作和分析，在资源有限条件下难以推广应用。与之相比，该研究采用的智能手机辅助技术操作简便、分析快速，即使在低成本和资源受限环境下，也能通过灰度分析建立水凝胶的宏观尺度扩散动力学。近期多项研究也采用了类似的水凝胶智能手机扩散测定方法，验证了该方法的可靠性。

文献中对水凝胶扩散的研究通常评估微观尺度分子扩散，其扩散系数范围在10^-11~10^-10 m²/s，这些数值通常对应单分子相互作用。而该方法计算的宏观尺度扩散系数在10^-5 m²/s量级，反映了溶剂通过水凝胶整体的传播过程，更符合细胞培养及其他生物学重要过程中的实际扩散动力学。该研究将交联优化、溶胀行为、流变学和基于图像的扩散评估整合为完整的工作流程，以明胶基水凝胶系统为模型，提供了一种整体化分析方法，能够加强中性设施中的分析能力。该方法使缺乏高级技术仪器条件下的人员也能快速筛选水凝胶。

水凝胶作为高度含水的三维聚合物网络，因其优异的生物相容性和可调控的物理化学特性，在生物医学领域展现出广阔的应用前景。然而，水凝胶的实际应用效能高度依赖于其组成、交联密度、机械强度及孔隙率等物理化学性质，这些因素直接影响溶质的扩散行为和营养物质的传输效率。目前，评估水凝胶扩散特性的传统方法如弗朗茨扩散池、光漂白后荧光恢复法和紫外分光光度法等，虽然精度较高，但普遍存在仪器设备昂贵、操作复杂、需要专业技术人员等局限，尤其在资源匮乏地区难以推广实施。因此，开发一种简便、经济且可靠的替代分析方法具有重要的科学意义和应用价值。

基于此研究背景，Sukanya Pati、Aseem Mishra等研究人员在《Next Materials》发表了题为"生物相容性交联水凝胶中营养物质扩散的测定：一种基于智能手机的分析方法"的研究论文。该研究旨在建立一种基于智能手机的图像分析方法，用于定量评估生物相容性明胶水凝胶中营养物质的宏观扩散动力学，并通过与流变学等物理表征手段相结合，系统探讨水凝胶网络结构与扩散性能之间的关联。研究最终筛选出具有最优综合性能的5C配方水凝胶，证实其不仅具有稳定的弹性固体特性和快速溶质传输能力，还能支持细胞三维球体培养，为生物打印和组织工程等应用提供了潜在的材料选择。

该研究主要采用了以下几项关键技术方法。研究人员首先利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）交联体系制备了不同交联密度的明胶水凝胶，并通过翻转管实验筛选出具有自支撑特性的合格样品。为实现对扩散过程的可视化监测，研究团队设计并三维打印了一种专用成像装置，该装置可固定普通智能手机（Redmi Note 10，1000万像素摄像头）和玻璃管，确保在整个实验过程中保持恒定的拍摄距离和焦距。扩散实验采用添加橙色食用色素的杜尔贝科改良鹰培养基（DMEM）作为示踪介质，在37℃细胞培养条件下进行。研究人员利用ImageJ软件对时间序列图像进行灰度强度分析，绘制沿凝胶轴向的强度分布曲线，并基于菲克第二定律（Fick's Second Law）的衰减模型拟合数据，计算得到扩散系数。此外，研究还采用自支撑稳定性评估、戳探测试和流变学测量对水凝胶进行了系统的物理表征，并通过人工挤出成型和细胞培养实验验证了材料的加工性能和生物相容性。

研究结果部分包含以下七个方面。

优化交联剂浓度方面，研究人员制备了不同明胶浓度（1%~10%）和交联剂浓度组合的系列水凝胶，通过翻转管实验评估其自支撑稳定性。结果显示，6B、3C、4C和5C四个样品具备良好的机械强度和适当的柔软度，符合后续分析要求。这一筛选过程确保了所选样品既不会因交联不足而在重力作用下流动，也不会因过度交联而过于坚硬。

溶胀行为分析方面，水凝胶的溶胀比（Swelling Ratio）定义为完全溶胀样品重量相对于初始干重的变化百分比。实验结果表明，6B样品溶胀率最高（约99.11%），而3C、4C和5C的溶胀率均超过70%。研究人员指出，交联度越低，网络密度越小，水动力学自由体积越大，从而导致更高的溶胀率和溶剂保留能力。所有样品的溶胀饱和时间相似，但溶胀速率存在差异。

染料示踪与图像分析方面，研究人员利用基于智能手机的成像系统追踪染料的宏观扩散过程。在扩散初期（0小时），染料溶液与水凝胶之间存在清晰的分界面，灰度强度曲线呈现出染料区低灰度值、界面区陡峭上升、透明凝胶区高灰度值的三段特征。随着扩散进行，染料前沿逐渐向凝胶内部移动，约在24小时内达到浓度均衡。扩散速率的排序为3C>4C>5C>6B（初始阶段），这与交联密度递增的顺序一致，即交联度越低，孔径越大，扩散越快。研究人员通过ImageJ软件对时间序列图像进行叠加分析，沿固定直线提取灰度强度分布，实现了对扩散前沿的定量追踪。

扩散动力学与扩散系数计算方面，研究人员依据菲克第二定律建立衰减模型：ln(C/C₀)=-x²/(2Dt)，其中C₀为初始灰度强度，C为t时刻在x像素点处的灰度强度，D为扩散系数。校准因子为1 mm=19像素。实验数据显示，所有样品的扩散系数范围为1.7×10^-8~2.5×10^-8 m²/s，与菲克扩散定律相符，证实了该方法测得的宏观体积扩散特性。其中5C样品的扩散系数最高（约2~2.5×10^-8 m²/s），6B次之（约2.0×10^-8 m²/s），3C和4C略低（约1.7~2×10^-8 m²/s）。三倍重复实验的误差条显示数据变异较小，证实了智能手机分析方法的重复性和可靠性。

流变学表征方面，研究人员采用平行板流变仪对水凝胶进行了振荡频率扫描测试（0.1~100 Hz，37℃，1%恒定应变）。储能模量（G'，Storage Modulus）表征材料的弹性固体响应，损耗模量（G''，Loss Modulus）表征粘性液体响应，损耗角正切（tan δ=G''/G'）反映粘弹性平衡，复数模量（|η*|，Complex Modulus）表示材料抵抗振荡形变的总阻力。结果显示，所有样品的G'均大于G''，表现为典型的凝胶粘弹性行为。6B的tan δ值最高（0.13），表明其粘性特征最明显，更像粘滞流体而非弹性凝胶；5C的tan δ值最低，表明其弹性固体特性最突出，具有最稳定的网络结构。在10 Hz频率下，复数模量从3C到5C递增，5C最为刚性，6B介于4C和5C之间。3C在高频下出现更多波动和尖峰，表明其网络结构不均匀，可能存在交联缺陷或局部结构损伤。

人工挤出稳定性验证方面，研究人员将预凝胶溶液装入2 mL注射器，配合1.63 mm直径的钝头针头，在细胞培养板上手工挤出三维交叉网格结构，并在37℃下用DMEM孵育。结果表明，3C和4C在实验过程中出现明显的结构畸变；6B可保持形态约16小时，但24小时后边缘开始软化模糊；唯有5C在整个实验期间及之后均保持结构完整。立体显微镜观察显示，5C网格在初始挤出和72小时完全溶胀后仍能维持清晰的晶格结构和稳定的溶胀边缘。

细胞培养与球体形成方面，研究人员将5C水凝胶铺展于24孔板，经紫外线照射2小时灭菌，并多次清洗去除未反应交联剂后，接种人胚肾293T细胞（HEK-293T），密度为48000细胞/孔（约20%汇合度），在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS）的DMEM中于37℃、5% CO₂条件下培养。结果显示，细胞从第1天即开始形成松散簇状结构，并逐渐生长为三维球体（Spheroid）。这些球体部分附着于水凝胶基底，既便于培养基更换和长期维持，又能在一定程度上保持结构完整性。从第1天到第7天，球体尺寸持续增大，形态清晰可辨。这一结果表明5C水凝胶具有良好的细胞相容性，可支持三维细胞聚集体的形成，为后续肿瘤 Yard

讨论与结论部分对本研究进行了深入总结。研究人员指出，生物相容性水凝胶的开发及其优化生化与物理特性在生物医学研究中具有重要意义，而理解水凝胶组成与扩散特性之间的相互作用是其中的关键课题。

在优化水凝胶方面，生物相容性表征需要在机械强度和营养物质渗透性之间取得最佳平衡。所选水凝胶样品表现出良好的机械和自支撑特性，不同样品间溶胀比的显著差异反映了交联密度和溶剂运动水动力学体积的差异。6B约99.11%的最高溶胀率表明其交联密度较低、水动力学自由体积较大；3C、4C和5C超过70%的适中溶胀率则足以支持溶质在网络中的移动。这一发现强调了交联密度与溶胀能力之间的反比关系，体现了机械强度与流体传输之间的平衡对功能性水凝胶表征的重要性。

在图像分析、菲克模型拟合与扩散动力学阐释方面，水凝胶基质内的扩散动力学取决于交联密度、电荷密度、孔隙率、溶剂性质、功能基团、酸碱度、离子浓度、渗透压和温度等多种因素。高精度方法和众多数学理论模型虽可用于测量凝胶系统中的扩散动力学，但往往难以普及，耗时耗资源，需要专业知识分析结果，且极端情况特异性强。

灰度值（Grayscale Value）对应于各颜色像素背景阈值范围的灰度阴影强度。低色素浓度区域灰度值较高，高浓度区域较低；但有色区域因色素对透射光的吸收而呈现较低灰度值，具体数值取决于透射光强度、色素浓度和相机图像设置。颜色到灰度的转换显著简化了所获信息并降低了不变性。扩散初期（0小时），染料掺杂的营养培养基与凝胶之间存在清晰的视觉分界面，表明尚未发生扩散。随着扩散的进行，灰度强度模式发生变化，不同时间点的强度变化可在图中验证。

为分析水凝胶的差异扩散，研究人员选择了凝胶中间区域（对应原始图中900像素）进行考察，该范围足以观察染料运动且避免了界面处突发扩散的干扰。由于扩散粒子尺寸相同，运动仅受凝胶孔径限制。交联度越低，孔径越大，扩散越快；扩散越快，信号（灰度值）的衰减关联越迅速，从而更快达到稳定状态。

扩散系数的图形表示详细展示了溶质通过水凝胶的宏观传输。在800、900和1000像素空间分辨率下计算扩散系数时，观察到了与菲克第二定律相符的渐进趋势，支持了通过水凝胶的表观体积传输。5C和6B表现出最高的扩散系数（2~2.5×10^-8 m²/s和2.0×10^-8 m²/s），3C和4C略低（1.7~2×10^-8 m²/s），这可能归因于较小的孔径和受限的溶剂传输。扩散层级递减顺序为5C>6B>3C>4C，在所有分析点和三倍重复中保持一致，证实了基于智能手机的扩散测定方法的可重复性。误差条中的微小变异可能源于光学灵敏度或水凝胶局部不均匀性，此类变异在其他光学方法中也有报道，被视为水凝胶系统的固有特征。

尽管不同交联浓度水凝胶中的染料扩散表现出明显差异，但所有样品均在6~8小时内出现灰度值衰减，约24小时达到稳定状态。这可能是因为各样品的孔径均远大于扩散分子尺寸，导致差异交联水凝胶中出现相似的染料扩散模式。最终结论认为，所有考虑的样品均理想适用于营养扩散，并表现出相似的扩散特性。各凝胶在800、900和1000像素处的扩散模式几乎相同且重叠，表明营养培养基通过所有凝胶的扩散速率近乎均匀。24小时内克服1.5 mL凝胶厚度的扩散速率，对生物应用而言是良好的培养基扩散速率；据此，毫米级厚薄凝胶可在一两小时内达到培养基平衡，确保持续的营养供应。

在流变学分析与机械刚度-扩散性能关联方面，储能模量和损耗角正切等粘弹性性质与水凝胶的孔径和结构密度相关，这些因素也影响扩散动力学。储能模量（G'）测量弹性或类固体响应，指施加应变时每周期储存和恢复的能量；损耗模量（G''）测量材料的粘性或类液体响应及以热形式耗散应力的能力，反映剪切测试中的变形能量即水凝胶刚度。

所有体系的储能模量均高于损耗模量，表明弹性凝胶行为。此外，G'和G''值随平行板间剪切频率 sweep 的增加而增加，对应更多能量耗散而非储存、更高的形变抗力、更精确的形状细节和更大的机械回弹性。G''对频率作图时，在多个频率点出现不同样品的离散尖峰，高频下G''的急剧增加表明粘度增大。4C和5C表现更平滑一致的数值，而3C相比其他水凝胶出现更多结构畸变，提示3C可能处于凝胶-溶胶转变阈值附近，原因可能为交联不足、局部网络损失、应变下结构相干性降低或不均匀性，不同于理想水凝胶的预期平滑曲线，可能源于非均质交联、物理缠结、空间不均匀性或凝胶体局部拓扑缺陷。

损耗角正切或阻尼因子（G''/G'）指示材料粘弹性的平衡。tan δ越低，类固体行为越好，利于承重应用；值越高，粘度越大，交联越少。6B在37℃具有最高的tan δ值（0.13），表明该制备物更像粘性流体而非凝胶，可能由于较高百分比的明胶和较弱的交联。这暗示尽管6B在给定温度下呈现凝胶外观并在筛选实验中表现出显著的自支撑特性，但其机械性质提示其不适合进一步应用。3C相对于4C较高的tan δ值表明前者网络稳定性较差，与先前讨论的结构畸变一致。4C较低的tan δ值表明弹性占优和更优的凝胶特性。

复数模量是水凝胶抵抗振荡形变阻力的度量，涵盖弹性和粘性行为。3C具有最低的复数模量，表明其为更弱、更流体样的水凝胶；4C和6B处于中等范围。四种样品中，5C具有最低的tan δ和最高的|η*|，可能是最佳的水凝胶制备物，表现为更像弹性固体样、稳定、坚固的结构，可能归因于均匀交联的网络。该特性可用于细胞培养基质、宏量和微流控系统、组织工程载体基质和生物打印等有趣的生物学应用。

尽管预期扩散速率与水凝胶刚度呈反相关，即交联度最低的凝胶扩散性最强，但实验数据表明最硬的水凝胶5C（从流变学推断）也具有最高的扩散系数。6B虽然粘度更大，却呈现中等扩散速率，可能由于局部不均匀性或更高的溶胀能力。这提示需要进一步详细研究水凝胶网络与分子传输之间的相互作用。

在生物相容性、细胞培养和潜在三维培养方面，明胶水凝胶是用于细胞生长的天然相容水凝胶之一，常模拟细胞外基质。球体通常通过悬滴法等复杂方法制造，需要熟练技能和实践经验才能妥善处理。但在该研究中，球体易于形成且部分附着于铺板水凝胶，便于更换培养基、维持细胞生长而不对形成的结构造成过多损伤或破坏。这种简便方法可进一步探索用于药物测试、微肿瘤模型生成或疾病建模等多种应用。

研究结论部分指出，该研究开发了一种经济有效、非侵入性、可重复且可靠的基于智能手机的分析方法，用于定量水凝胶中的扩散，特别适用于有限资源环境下的生物相容性水凝胶表征。该方法基于菲克扩散定律，利用灰度强度分析计算扩散系数。通过智能手机方法产生的灰度强度测量分析扩散动力学，揭示扩散系数在10^-8 m²/s范围内，从而证实了宏观体积扩散。这些数据确保了该方法对水凝胶表征的适用性，尤其在缺乏精密仪器的最小资源环境中。

所有实验中观察到的结果和趋势协调一致。5C是所有样品中最稳定的水凝胶，具有最高的机械稳定性、强弹性特征和最快的溶质传输能力，归因于其均匀网络。尽管6B粘性更大、交联度更低，但显示了良好的扩散速率，表明溶胀能力和网络中的非均质微域对体积传输至关重要。3C和4C的扩散系数较低，证实了溶剂迁移受限。文献报道表明水凝胶刚度与水动力学自由体积和明胶中分子运动相关。这些水凝胶在营养物质/药物的持续和缓慢释放方面具有优势。研究还证实，配方和凝胶化后的基质可被灭菌并长期储存后仍可使用，从而增加了其便携性。最终，表现出基本三维完整性的水凝胶被筛选出来，并发现具有细胞相容性。培养物支持细胞三维聚集体形成，表明球体形成的预阶段培养。这为在三维生物打印平台上简便创建微肿瘤模型系统提供了可能。其他无法维持基质打印的水凝胶可用于细胞包裹或夹层细胞培养评估。