高精子活力鹅的内分泌-代谢支持及轴丝组装能力的增强：通过scRNA-seq技术揭示睾丸细胞异质性的见解

《Poultry Science》：Enhanced endocrine–metabolic support and axonemal assembly in high-sperm-motility geese: insights from testicular cellular heterogeneity by scRNA-seq

　　何川王|柯欣聪|贾欣音|柯江|云诺刘|肖芳任|英张|盛军刘
黑龙江八一农业大学动物科学与兽医医学院，大庆，163319，中国

**摘要**
精子活力是决定雄性生育能力的关键因素，受精子发生微环境中协调相互作用的影响。为了研究鹅精子活力差异的机制，我们对60只精子活力在生理范围内的公鹅进行了排序，将排名前10%和后10%的公鹅分别归为高活力（H）组和低活力（L）组（每组6只）。比较了两组之间的精液特征、睾丸组织学以及血浆中的内分泌、抗氧化和代谢指标。对于单细胞RNA测序，从每组中选取了3只公鹅进行睾丸分析。与L组相比，H组的精子活力、精液量、睾丸重量、睾丸实质面积、生精上皮厚度、生精小管直径以及血浆中的睾酮、黄体生成素、总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、白蛋白和高密度脂蛋白胆固醇水平显著更高，而睾丸间质面积、血浆中的催乳素、皮质酮、丙二醛、H2O2和葡萄糖水平显著较低。单细胞转录组分析确定了主要的睾丸细胞类型，并表明精子活力差异与圆形精细胞、延长型精细胞、塞尔托利细胞和莱迪希细胞密切相关。在H组中，圆形精细胞在与轴丝和纤毛组织、氧化磷酸化以及蛋白质折叠和翻译相关的通路中表现出富集，这与精子结构成熟增强一致。塞尔托利细胞显示出增强的紧密连接、糖酵解和谷胱甘肽代谢特征，表明其屏障完整性和氧化还原缓冲能力得到改善，并存在支持发育中生殖细胞的乳酸相关代谢途径。莱迪希细胞则表现出与类固醇生成、线粒体呼吸和氧化还原稳态相关的增强通路。相比之下，L组中的延长型精细胞保留了更广泛的线粒体、细胞骨架和蛋白质质量控制特征，表明其终末成熟过程延迟或效率较低。总体而言，这些发现表明鹅的高精子活力可能与体细胞微环境中的内分泌-代谢支持以及精细胞晚期成熟过程中轴丝组装相关程序的增强有关，为早期成熟公鹅的生育能力变异提供了单细胞层面的见解。

**引言**
鹅是全球家禽产业的重要组成部分，世界各地养殖鹅的主要目的是获取蛋、肉、鹅肝和羽毛（Akhtar等人，2021年）。与鸡和鸭相比，鹅在繁殖效率方面面临挑战，尤其是精子活力较低且个体间差异较大（Hu等人，2025a；Yan等人，2025年）。这种差异体现在实际配种比例上：鸡约为1:12（Chen等人，2025年），鸭约为1:6（Nickolova等人，2004年），而鹅仅为1:4（Shi等人，2025年）。这主要表现为自然生育能力下降（Akhtar等人，2021年）。在睾丸中，生殖细胞和体细胞共同作用，形成对精子发生及其调控过程至关重要的支持性微环境（Estermann等人，2021年；Guo等人，2025年）。在鸟类生殖细胞-体细胞微环境中，精细胞逐渐组装出运动装置，而周围的体细胞提供结构、代谢和内分泌支持。在鸟类精子发生过程中，鞭毛生物发生始于圆形精细胞，此时中心粒形成新的轴丝并为其后续运动奠定基础；因此，这一阶段的扰动可能会影响后期的精子运动（Aire，2014年）。在延长型精细胞阶段，尾部结构进一步成熟，线粒体重塑为中间段，形成支持精子能量的典型鸟类中间段结构；相应地，对鸣禽的研究发现中间段特征和/或细胞内ATP含量与精子游动能力相关（Rowe等人，2013年）。同时，鸟类塞尔托利细胞形成细胞间紧密连接，构成血-睾丸屏障（BTB），并帮助组织生精上皮；此外，鸡的塞尔托利细胞在体外分泌乳酸，表明其在睾丸微环境中的代谢供应作用（Guibert等人，2011年）。最后，黄体生成素（LH）刺激鸟类莱迪希细胞（LCs）合成睾酮（T），体外实验已证实LH诱导的T分泌（Opalka等人，2004年），突显了内分泌对鸟类精子发生的调控作用。为阐明鹅精子活力个体间差异的机制，以往的研究从多个层面进行了探讨，包括遗传因素、内分泌信号传导和氧化还原稳态。比较高活力和低活力鹅的大规模转录组及蛋白质组分析一致指出，与精子活力直接相关的通路包括Wnt信号传导（如PLCB1、WNT11、LRP6）可能通过Ca2+-依赖性磷酸化级联影响精细胞分化和相关信号传导；ECM-受体相互作用和MAPK信号传导（如SPAG6、NEK2、SERF1A）与精子发生和鞭毛组装相关；Apelin信号传导（如PRKAG3、ADCY8、GNB3）可能调节维持ATP依赖性鞭毛运动的cAMP介导和能量感知程序（Hu等人，2025a；Liu等人，2024年；Hao等人，2024年）。此外，循环生殖激素（Penfold等人，2001年；Sabater等人，2025年）、抗氧化状态（Akhlaghi等人，2014年；Li等人，2020年）以及精液相关代谢特征（Li等人，2025年）的差异进一步表明，高精子活力依赖于系统的支持性环境和分子及生理层面的协调调控。尽管精子活力还可能受到环境和管理条件的影响，但明确其细胞类型特异性的分子基础是进行稳健生育能力评估和后续应用优化的必要步骤。此外，精子发生和精子成熟过程表现出显著的细胞多样性和动态异质性（Ramn等人，2014年），使得传统的批量RNA测序无法详细解析精细的细胞分化状态和细胞类型特异性转录调控（Kolodziejczyk等人，2015年）。重要的是，批量转录组和蛋白质组方法平均了异质细胞群体的信号，从而掩盖了稀有细胞状态、短暂转录程序和对于精子功能成熟至关重要的细胞间协调调控作用（Tzec-Interián等人，2025年）。因此，尽管先前的鹅的大规模组学研究（包括Hu等人（2025a）和Liu等人（2024年）已经确定了与精子活力相关的通路，但关于这些通路变化在鹅睾丸中的细胞起源和阶段特异性仍存在关键知识空白：目前尚不清楚这些变化是源自特定生殖细胞阶段、不同类型的体细胞支持细胞，还是关键过渡状态相对丰度的变化。相比之下，单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够高分辨率地表征细胞组成、发育轨迹和细胞类型特异性分子程序（Potter，2018年）。迄今为止，scRNA-seq已广泛应用于哺乳动物睾丸中精子发生的细胞景观分析和关键调控通路的鉴定（Hermann等人，2018年；Green等人，2018年）。然而，尽管在鹅的研究中取得了重要进展，但鹅睾丸内精子活力变异的细胞类型特异性基础仍不明确。具体而言，尚不清楚哪些生殖细胞阶段和体细胞群体导致了观察到的通路变化，以及相关差异主要反映在转录状态改变、细胞组成变化还是两者的结合。在此，我们使用scRNA-seq系统地分析了与鹅精子活力变化相关的睾丸细胞类型。我们的目标是在早期成熟公鹅中以单细胞分辨率描绘与精子活力相关的细胞状态和调控程序。这些数据为未来的生育能力评估和繁殖管理提供了机制框架，并提出了候选的细胞类型特异性生物标志物和调控节点。

**材料与方法**
**伦理批准**
黑龙江八一农业大学科学技术伦理委员会批准了这项研究（许可证编号：DWKJXY2025069）。所有实验操作均按照相关指南并在监督下进行。在动物参与研究之前，已从所有动物主人处获得了书面知情同意。

**动物管理、精子活力评估和样本收集**
齐鹅（Anser cygnoides）是黑龙江省广泛饲养的代表性本地品种，适应当地生产环境（Wang等人，2025年）。本研究选取了60只7个月大的齐鹅公鹅，年龄约为30周，据报道该年龄段公鹅已达到性成熟（Hu等人，2025b），2025年3月至5月在面积为80平方米的半开放式禽舍中饲养，每天光照时间为11.9–12.5小时（中国黑龙江四白鹅生态农业公司；北纬46°30’，东经125°26’，海拔147.8米）。所有公鹅均可自由饮水，并喂食统一的基礎饲料，其成分和营养组成见表1。3月份，使用背部按摩技术对公鹅进行了精液采集训练。在预筛选过程中，排除了精子活力异常低或病理性的个体（可能是由于暂时性健康状况、压力、精液污染或采集失败），以确保样本组具有典型的精液质量并避免非生理异常的干扰。4月份每隔三天采集一次精液，共进行了四次连续采集。精液采集后立即在配备全自动加热平台的显微镜（Sunny Optical Technology，浙江）下进行活力评估，加热平台温度保持在37°C。活力定义为表现出向前运动的精子百分比，每个样本在三个独立显微镜视野中评估，每个视野至少评估100个精子。根据四次采集的平均精子活力，将公鹅分为高精子活力（H）组和低精子活力（L）组。精液量作为额外的表型参数用于组间比较。

**表1. 基础饲料的成分和营养水平（干基）**
| 成分 | 含量（%） |
|------------|-------------|
| 玉米 | 58.0 |
| 豆粕 | 19.0 |
| 小麦麸皮 | 18.0 |
| 粗纤维 | 3.13 |
| 碳酸氢钙 | 1.5 |
| 预混料 | 1.0 |
| 中性洗涤纤维 | 15.32 |
| 石灰石 | 1.0 |
| 植物油 | 1.0 |
| 钠氯化物 | 0.4 |
| 钾 | 0.50 |
| DL-Met | 0.1 |
| 总计 | 100.0 |

预混料每公斤饲料提供以下营养成分：VA 10000 IU，VD3 1400 IU，VE 100 IU，Mn 85 mg，Zn 80 mg，Fe 70 mg，I 0.7 mg，Se 0.6 mg。AME为计算值；其他所有数值基于化学分析。EE：醚提取物；CF：粗纤维；NDF：中性洗涤纤维；ADF：酸洗涤纤维。

最后一次精液采集后24小时内完成组织取样。公鹅在取样前一天20:00开始禁食12小时。次日早上8:00从臂静脉采集静脉血样本。然后将H组和L组的每组6只公鹅转移到解剖设施，并通过吸入1.5–3.0%异氟醚进行麻醉。确认失去意识后，通过切断颈动脉实施安乐死。切除两侧睾丸，称重，并在安乐死后5分钟内取样。用于组织和定量分析的组织取自右侧睾丸的中央实质区域，避开附睾和输精管。为了确定scRNA-seq组，从每组中选取3只代表性公鹅（每组3只）；对于这些个体，从同一解剖区域采集对侧（左侧）睾丸，并立即浸入4°C预冷的MACS组织储存溶液（Miltenyi Biotec，德国北莱茵-威斯特法伦）。这些程序旨在最小化死后缺氧/缺血并保持睾丸细胞的原始转录组状态。样本在4°C下保存，并在12小时内进行组织解离和单细胞悬浮液制备。

**苏木精和伊红（H&E）染色及组织学评估**
睾丸组织在室温下用Bouin溶液（Powerful Biology，湖北）固定超过72小时，通过分级乙醇系列脱水，然后用二甲苯透明处理，最后嵌入石蜡。石蜡包埋的样本切成5-μm切片，并用H&E染色。使用Pannoramic MIDI II数字扫描仪（3DHISTECH，匈牙利布达佩斯）获取全切片数字图像。使用SlideViewer（版本2.5.0）对图像进行拼接、重建和可视化。使用Fiji（版本2.16.0）（Schindelin等人，2012年）量化组织学参数，包括睾丸实质（TP）面积、睾丸间质（TI）面积、生精上皮厚度（SET）和生精小管直径（STD）。每只公鹅分析三个非连续切片，每个切片选择三个视野进行量化。计算每个实验组所有个体的这些组织学参数的平均值。

**系统内分泌和抗氧化-代谢谱评估**
检测血浆中的睾酮（商品编号YJ327045；批次编号202504）、卵泡刺激激素（FSH；商品编号YJ641258；批次编号202504）、黄体生成素（LH；商品编号YJ620399；批次编号202504）、催乳素（PRL；商品编号YJ640701；批次编号202504）和皮质酮（CORT；商品编号...）的浓度。YJ106452；批次号202504）是使用商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒确定的，每个试剂盒都经过制造商认证，可用于鹅样本，并按照制造商的说明进行操作（元聚生物公司，上海，中国；在450纳米处测量吸光度）。每个血浆样本对每个分析物进行了三次测量。所有分析物的 intra- 和 inter-assay 变异系数均 < 15%，符合制造商的规格。总抗氧化能力（T-AOC，ABTS 方法，目录号 A015-2-1）、超氧化物歧化酶（SOD，WST-1 方法，目录号 A001-3-1）、过氧化氢酶（CAT，钼酸盐方法，目录号 A007-1-1）、丙二醛（MDA，TBA 方法，A003-1-1）和过氧化氢（H2O2，钼酸盐方法，目录号 A064-1-1）是使用商业抗氧化测定试剂盒量化的，按照制造商的说明进行操作（建城生物工程研究所，江苏，中国）。总胆固醇（TC，酶法，目录号 G0909W）、甘油三酯（TG，酶法，目录号 G0910W）、葡萄糖（GLU，GOD-POD 方法，目录号 G1214W）、白蛋白（ALB，BCG 方法，目录号 G1208W）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C，均相酶法，目录号 G1221W）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C，均相酶法，目录号 G1222W）是使用商业生化测定试剂盒分析的，按照制造商的说明进行操作（Grace Biotechnology，江苏，中国）。所有测量都是使用配备 SoftMax Pro（版本 7.1.2）的 SpectraMax ABS 微孔板读取器（Molecular Devices，美国加州）进行的。

组织解离和单细胞悬浮液的制备
保存的睾丸组织转移到培养皿中，并用预冷的 1× PBS（Biosharp，北京，中国）洗涤以去除残留的血液和脂质。将组织切成 0.5 mm2 的小块，并在含有 0.35% 胶原酶 IV、2 mg/mL 巴蛋白酶和 120 U/mL DNase I 的解离溶液中孵育 20 分钟，在 37°C 的水浴振荡器中（100 rpm）。通过加入含有 10% 胎牛血清的 1× PBS 来终止消化（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国）。细胞悬浮液通过 40-μm 细胞过滤器过滤，并在 4°C 下离心（300×g，5 分钟）。离心后，将沉淀物重新悬浮在红细胞裂解液中（Miltenyi Biotec，北莱茵-威斯特法伦，德国），并在 4°C 下再次离心（300×g，5 分钟）。使用死细胞去除试剂盒（Miltenyi Biotec，北莱茵-威斯特法伦，德国）去除死细胞，并通过 MS 标柱（Miltenyi Biotec，北莱茵-威斯特法伦，德国）去除死细胞和残留的试剂。收集的细胞在 4°C 下离心（300×g，5 分钟），然后重新悬浮在含有 0.04% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× PBS 中（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国），然后洗涤两次（每次在 4°C 下，300×g，5 分钟）。最终的细胞悬浮液重新悬浮在含有 0.04% BSA 的 100 μL 1× PBS 中，以生成单细胞悬浮液。使用台盼蓝排除法评估细胞活力，阈值 > 85%。使用 Countess II FL 自动细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国）进行细胞计数，并将浓度调整到 700–1200 细胞/μL。

单细胞转录组文库构建和测序
单细胞悬浮液使用 Chromium Single Cell 3′ Reagent Kit v3.1（10x Genomics，美国加州）加载到 Chromium 芯片上（10x Genomics，美国加州），根据制造商的协议捕获约 8,000 个细胞。cDNA 扩增和文库构建按照标准协议进行。文库在 NovaSeq 6000 平台上使用 150-bp 成对末端读取进行测序（Illumina，美国加州）。

单细胞转录组数据的预处理
使用 bcl2fastq（版本 5.0.1）对测序数据进行解复用并转换为 FASTQ 格式。使用 Cell Ranger（版本 9.0.1）进行样本解复用、条形码处理和单细胞 3’ 基因计数，然后将 scRNA-seq 读取与鹅参考基因组（GCF_040182565.1）（Zhao 等人，2024）对齐（由国家生物技术信息中心托管）。排除检测到的基因少于 500 个或线粒体转录本超过 25% 的细胞，并使用 DoubletFinder（版本 2.0.6）（McGinnis 等人，2019）识别和去除潜在的双胞胎细胞。

单细胞转录组数据的下游分析
使用 Seurat（版本 4.1.1）（Hao 等人，2021）进行下游分析。首先去除低质量细胞和潜在的双胞胎细胞，然后使用 NormalizeData 函数对数据进行标准化。使用 FindVariableFeatures 函数识别高度变异基因（HVGs），然后使用 ScaleData 函数进行缩放。然后使用 RunPCA 函数将 HVGs 作为输入进行主成分分析（PCA）以降低维度。使用 FindNeighbors 和 FindClusters 函数进行细胞聚类，并使用 DimPlot 函数通过均匀流形近似和投影（UMAP）可视化结果。

伪时间和 RNA 速度推断
使用 Monocle 3（版本 1.3.7）（Cao 等人，2019）从 Seurat 对象构建伪时间轨迹。将整合的 Seurat 对象转换为 cell_data_set，并对预定义的 HVGs 进行 PCA、k-最近邻（kNN）图构建和 Leiden 聚类，使用统一的 UMAP 嵌入。由于精子发生是一个没有循环拓扑的连续过程，因此禁用了基于分区的学习和循环闭合（参数：use_partition = FALSE；close_loop = FALSE）。使用 learn_graph 函数学习主图，将 SSC 聚类指定为根节点，并使用 order_cells 函数计算伪时间。伪时间值用于组间比较和伪时间感知的差异表达分析。通过使用 plot_cells 函数将主图边缘叠加到 UMAP 嵌入上来生成分化轨迹图，标注分支点和终端（叶）节点。

RNA 速度分析
使用 velocyto（版本 0.17.17）（La Manno 等人，2018）和 scVelo（版本 0.2.4）（Bergen 等人，2020）进行 RNA 速度分析。使用 velocyto 函数从 Cell Ranger 生成的 BAM 文件中提取剪接和未剪接的转录本计数，并为每个样本导出 loom 文件。然后将 loom 文件合并并导入到 Scanpy（版本 1.11.4）（Wolf 等人，2018）的 AnnData 对象中。标准化和选择 HVGs 后，使用 pp.moments 函数估计二阶矩以平滑邻域信息，并在 PCA 空间构建 kNN 图。在随机和动态模型下进行速度推断：随机模型提供了局部速度场的初始估计，而动态模型使用 tl.recover_dynamics 函数拟合基因水平的转录动力学，并推断稳态和非稳态之间的转换。使用 tl.velocity 和 tl.velocity_graph 函数分别获得速度向量和图，然后使用 tl.velocity_embedding_stream 函数在统一的 UMAP 上可视化速度流线，以描绘细胞状态转换的方向。

通过逆转录-定量 PCR（RT-qPCR）验证 scRNA-seq 结果
根据制造商的协议，使用 AG RNAex Pro Reagent（Accurate Biology，湖南，中国）提取总 RNA。简要来说，将 1.2 mL 的 AG RNAex Pro Reagent、研磨珠和组织样本加入无 RNase 的试管中，并使用 KZ II 高速组织匀浆器（Servicebio Technology，湖北，中国）进行匀浆。匀浆后，样品在室温下孵育 5 分钟，然后在 4°C 下离心（12,000×g，5 分钟）。收集上清液，与 240 μL 的氯仿彻底混合，在室温下孵育 5 分钟，然后在 4°C 下离心（12,000×g，15 分钟）。将得到的上清液转移到新的试管中，与 600 μL 的异丙醇彻底混合，在室温下孵育 10 分钟，然后在 4°C 下离心（12,000×g，10 分钟）。丢弃上清液后，将 RNA 沉淀物用预冷至 -20°C 的 80% 乙醇洗涤两次，在室温下空气干燥，然后重新悬浮在无 RNase 的水中。

使用 Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR Ver. 2（Accurate Biology，湖南，中国）根据制造商的协议进行逆转录。简要来说，将 1 μg 的总 RNA 加入含有无 RNase 水、2 μL 的 gDNA Clean Reaction Mix 和 4 μL 的 5×Evo M-MLV RT Reaction Mix 的 20-μL 反应混合物中。在 Biometra TOne 96G 热循环仪（Analytik Jena，图林根，德国）中按照以下条件进行逆转录：37°C 下 15 分钟，85°C 下 5 秒，然后在 4°C 下保持。

为选定的差异表达基因（DEGs）设计特异性引物（Primer3Plus，版本 3.3.0）（Untergasser 等人，2012）（表 2）。使用 SYBR Green Premix Pro TaqHS qPCR Kit III（Low Rox Plus）（Accurate Biology，湖南，中国）根据制造商的协议进行定量实时 PCR（qPCR）。简要来说，将 2 μL 的 cDNA 模板加入含有无 RNase 水、2 μL 的 2×SYBR Green Pro TaqHS Premix III 和 0.2 μM 的正向和反向引物的 20-μL 反应混合物中。在 QuantGene 9600 荧光定量检测系统（BIOER Technology，浙江，中国）上按照以下程序进行扩增：95°C 下 1 分钟；40 个循环，每个循环 95°C 下 5 秒和 60°C 下 30 秒；然后在 95°C 下进行熔解曲线分析 15 秒，60°C 下 1 分钟，95°C 下 1 秒以确认扩增特异性。每个样本进行三次技术重复。使用 HPRT1 作为内参基因（Zhang 等人，2021），并使用 2?ΔCt 方法（Connerton 等人，2018）计算目标基因的相对表达水平。

表 2. 用于 RT-qPCR 的引物序列。
基因符号 引物序列（5’–3’） 产物长度（bp）
CFAP418 FTCCAGTGTACCTGGGTGGAA 141
RTCACAGGACTGATCCCAGATGCPT 1
BFACCCCCGAGGGCTTAGATTT 255
RGTAGCTCAGGAGTTGGCTCT 1
CYP11A1 FCCTCATGCACATCCTGGAGAAC 108
RAGCGTCAGGTAGATGGGTTTGT 266
RTGGACATTTGCCAGAGCGAA HSPA2
FTGTCATCACAGTGCCTGCTT 110
RCTGCTGTGGGCTCGTTGATAM PC1
FATGGCCCACTTGAACAGCAC 171
RTGGCTGCACTTTGTAGGCA APIWIL1
FCACCCCCTGGTACTGTTGTT 98
RGGGTGCAACACAGCCATT PSMB1
FGACTGTGTTGGCGATTGCTG 281
RAAGGGAAGAAACGTCGGGAG SOD1
FGCGGCTTGTCTGATGGAG 80
RAGCACCTGCACTGGTACAT CSOX9
FAAGTGCTCAAGGGCTACG 102
RTGAAGGCGTTCATGGGTCT SPAR
CFGGGAGTTTGAGGAACCC 110
RCGAGTTGTTGTCGTCC STAR
FGAGCTGGTGGACAACATGGA 130
RCAATGTTTCCGGGGGT ATEKT3
FCCAACGAGATGTGGAACC 289
RTCATCGAGTTCGTGGACCT XN2
FACCTTGCCATTGAGTACGAG 70
RTCCACAACGTCTCC GGT
STAR FGAGCTGGTGGACA 1
RGTTGAAAGGTCATCCCC FAP418，纤毛和鞭毛相关蛋白 418；CPT1B，肉碱棕榈酰转移酶 1B；CYP11A1，细胞色素 P450 家族 11 亚家族 A 成员 1
DDX4，DEAD-box 解旋酶 4；HSPA2，热休克蛋白家族 A（Hsp70）成员 2；MPC1，线粒体丙酮酸载体 1；PIWIL1，piwi 类 RNA 介导的基因沉默 1；PSMB1，20S 蛋白酶体亚基 beta 1；SOD1，超氧化物歧化酶 1；SOX9，SRY-box 转录因子 9；SPARC，分泌蛋白酸性且富含半胱氨酸；STAR，类固醇生成急性调节蛋白；TEKT3，tektin 3；TXN2，硫氧还蛋白 2；HPRT1，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶 1。F：正向引物；R：反向引物。星号表示内参基因。

统计分析
使用 FindMarkers 函数中的 Wilcoxon 秩和检验进行差异表达分析。基于 P ≤ 0.01 和 |log2 倍数变化（log2 FC）| ≥ 0.26（相当于 1.2 倍数变化）识别 DEGs，并且这些基因在至少 10% 的细胞中表达。使用 clusterProfiler（版本 4.12.6）（Wu 等人，2021）对 DEGs 进行基因本体（GO）、京都基因组与基因组百科全书（KEGG）和基因集富集分析（GSEA），P 值通过 Benjamini–Hochberg 方法进行调整。对于 GSEA，如果 |标准化富集得分（NES）| > 1，名义 P 值（NOM. P）< 0.05，且假发现率（FDR）q < 0.25，则认为显著富集。NOM. P 表示通过排列检验估计的富集显著性，而 FDR q 反映多重检验调整后的错误率。使用 jamovi（版本 2.6.45.0）计算精液活力和睾丸组织学参数的描述性统计，结果表示为平均值 ± 标准差。使用双尾 Student’s t 检验评估组间差异。统计显著性定义如下：P < 0.05，显著；P < 0.01，非常显著；P < 0.001，极其显著；P < 0.0001，极其极其显著。数据可视化使用 R（版本 4.5.0）进行。

结果
精液质量和睾丸组织的比较分析
如图 1A–C 所示，H 组的精液活力、精液量和睾丸重量显著高于 L 组（P < 0.05）。H&E 染色的睾丸切片显示两组之间的组织结构大致相似（图 1D，E）。然而，H 组的 TP 面积较大，TI 面积较小（P < 0.05；图 1F，G）。此外，H 组的 SET 和 STD 显著高于 L 组（P < 0.05；图 1H，I）。

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图 1. H 组和 L 组的精液质量、睾丸特征和睾丸组织形态测量。（A）条形图显示 H 组和 L 组之间的精液活力（n = 6）。（B）条形图显示 H 组和 L 组之间的精液体积（n = 6）。（C）条形图显示 H 组和 L 组之间的睾丸重量（n = 6）。（D）H 组的 H&E 染色睾丸切片；（E）L 组的 H&E 染色睾丸切片；（F）条形图显示 H 组和 L 组之间的 TP 面积（n = 6）；（G）条形图显示 H 组和 L 组之间的 TI 面积（n = 6）；（H）条形图显示 H 组和 L 组之间的 SET（n = 6）；（I）条形图显示 H 组和 L 组之间的 STD（n = 6）。统计结果以平均值±标准差（mean ± SD）的形式呈现。“****”表示组间差异极显著（P < 0.0001），“***”表示组间差异非常显著（P < 0.001），“**”表示组间差异显著（P < 0.01），“*”表示组间差异有统计学意义（P < 0.05）。

两组公鹅的系统内分泌和抗氧化-代谢特征分析显示：T、LH、T-AOC、SOD、CAT、ALB和HDL-C在H组中显著高于L组（P < 0.05），而PRL、CORT、MDA、H2O2和GLU在H组中显著低于L组（P < 0.05）。此外，两组之间的FSH、TC、TG和LDL-C差异不显著（P > 0.05）。

表3. 两组公鹅的血清内分泌、抗氧化和代谢参数。

| 项目 | H组 | L组 | P值 |
|-------------|----------|----------|-----------|
| T (pg/mL) | 624.19±96.31 | 254.11±41.66 | < 0.001 |
| FSH (ng/mL) | 105.52±8.96 | 108.03±11.24 | 0.924 |
| LH (ng/mL) | 259.12±12.32 | 146.54±5.71 | < 0.001 |
| PRL (ng/mL) | 92.59±3.47 | 104.46±7.50 | 0.006 |
| CORT (ng/mL) | 310.13±12.96 | 365.84±39.88 | 0.009 |
| T-AOC (TEAC) | 0.679±0.03 | 0.617±0.01 | 0.005 |
| SOD (U/mL) | 76.35±7.51 | 60.45±4.76 | 0.001 |
| CAT (U/mL) | 13.00±3.08 | 9.17±1.54 | 0.021 |
| MDA (nmol/L) | 3.04±0.49 | 3.89±0.37 | 0.007 |
| H2O2 (mmol/L) | 16.02±3.20 | 21.97±1.71 | 0.002 |
| TC (mmol/L) | 4.49±0.43 | 4.90±0.63 | 0.214 |
| TG (mmol/L) | 4.44±0.46 | 5.10±0.69 | 0.082 |
| GLU (mg/mL) | 1.78±0.11 | 2.01±0.15 | 0.013 |
| ALB (g/L) | 17.51±0.74 | 15.11±1.08 | 0.001 |
| HDL-C (mmol/L) | 3.50±0.30 | 2.83±0.31 | 0.003 |
| LDL-C (mmol/L) | 1.87±0.59 | 1.82±0.56 | 0.874 |

不同字母表示组间差异显著（小写字母：P < 0.05；大写字母：P < 0.01）。n=6。

UMAP嵌入和标记基因表达谱揭示了睾丸细胞的身份。scRNA-seq数据集的整体质量很高（表S1），每个样本的读数范围为3.20×10^8至3.54×10^8，平均每个细胞的测序深度为24,328至38,000个读数。映射到基因组的读数比例在84.1%到92.9%之间，细胞内的读数比例在71.7%到85.1%之间。经过质量控制后，保留了66,032个细胞，并识别出31个无监督簇，它们的无偏投影在UMAP嵌入图中可视化（图2A）。根据已建立的标记基因和DEGs对簇进行注释，以定义每种睾丸细胞的分子身份：精原干细胞（SSCs）、精原细胞（SPGs）、粗线期精细胞（P.SPCs）、双线期精细胞（D.SPCs）、R.SPEs、E.SPEs、SCs、内皮细胞（ECs）和免疫细胞（ICs）（图S1A-K，表S2）。UMAP嵌入显示从SSC阶段到E.SPE阶段的连续精子发生轨迹，中间经过SPG和精细胞阶段，而体细胞类型形成了不同的簇（图2B）。

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图2. scRNA-seq揭示的细胞类型注释和差异分布：(A) UMAP图显示scRNA-seq数据的无监督簇；(B) UMAP图显示scRNA-seq数据的注释细胞类型；(C) 条形图显示样本间注释细胞类型的比例；(D) 条形图显示组间注释细胞类型的比例；(E) 热图显示组间注释细胞类型的Ro/e值（Ro/e > 1：“+++”，0.8 < Ro/e ≤ 1：“++”，0.2 ≤ Ro/e ≤ 0.8：“+”，0 < Ro/e < 0.2：“±”，Ro/e = 0：“-”；(F) 点图显示标记基因在注释细胞类型中的表达情况。“ns”表示组间无显著差异（P > 0.05）。

六个睾丸样本的细胞组成存在个体间差异，R.SPE在所有样本中始终是主要细胞群体（图2C）。此外，十种注释的细胞类型在H组和L组之间没有显著差异（P > 0.05，图2D）。观察值与预期值（Ro/e）的比率分析进一步明确了组间的细胞类型特异性变化。H组中E.SPEs显著富集，其次是SSCs、P.SPCs、D.SPCs和LCs。相比之下，L组中SPGs和R.SPEs显著富集，E.SPEs几乎消失（图2E）。这些细胞类型分配和组间变化得到了相应簇内谱系特异性标记基因富集的支持（图2F）。

Monocle 3伪时间和scVelo RNA速度图揭示了精子发生谱系的动态。在同一UMAP嵌入图中，Monocle 3重建了一个分支轨迹，将细胞从早期SSCs通过SPG和SPC阶段（P.SPC→D.SPC）排列到晚期精细胞（R.SPE→E.SPE），沿着几条不同的路径（图3A）。当叠加伪时间时，颜色梯度沿此路径单调增加：早期群体（SSCs/SPGs）位于伪时间低端，中间阶段（P.SPC/D.SPC）位于过渡区，晚期群体（R.SPE/E.SPE）聚集在伪时间高端，表明有一个连续且方向一致的时间进程（图3B；表S3）。在动态层面上，scVelo在动态和随机模型下推断的网格化RNA速度场在宏观方向上高度一致。总体而言，向量指向发育轴的末端，没有大规模的逆流或循环。随机模型表现出更大的局部分散，而动态模型显示出更平滑的方向一致性和更均匀的场强分布（图S2A，S2B）。

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图3. Monocle 3伪时间和scVelo RNA速度揭示的精子发生谱系动态。(A) UMAP图显示初步的Monocle 3轨迹重建；(B) UMAP图显示带有Monocle 3轨迹叠加的伪时间梯度；(C) 散点图显示伪时间相关基因的表达动态；(D) UMAP图显示scVelo动态模型的RNA速度流线；(E) UMAP图显示scVelo动态模型的细胞级RNA速度投影。

可视化前六种伪时间相关基因显示了明显的阶段依赖性模式。ACR和RABL2B沿伪时间增加并在晚期达到峰值，而GOLGB1和LOC136790012在晚期伪时间整体下降。相比之下，NME6和SHANK3在中晚期伪时间表现出适度上调。这些表达动态共同描绘了沿重建的精子发生谱系的阶段特异性转录程序（图3C）。

基于动态模型的流线追踪进一步显示，速度流线沿主轴从早期连续连接到晚期，这与Monocle 3轨迹一致（图3D，图S2C）。细胞级速度投影表明在阶段转换区（P.SPC、D.SPC和R.SPE）内向量幅度较大且方向更均匀。相比之下，在最终分化阶段（E.SPE），向量缩短且场强减弱，表明在晚期成熟过程中动力学稳定（图3E，图S2D；表S4）。空间定位、时间排序和速度方向共同支持了精子发生的连续、单向进展模型，并为伪时间解析的阶段特异性差异表达和通路调控提供了时间和动态基础。

**R.SPEs的差异表达和通路富集**
如图4A和表S5所示，H组和L组R.SPEs的差异表达分析发现了1,143个DEGs，包括473个上调基因和670个下调基因。基于R.SPE生理学的运动相关DEGs在图4B和4C中突出显示。例如，H3-3B、ODC1和TSSK2在H组R.SPEs中显著上调且表达更高，而DNALI1、ATP5IF1和PDE6D在L组R.SPEs中显著下调且表达更高。GO分析显示微管细胞骨架组织、轴丝组装、纤毛组装、线粒体电子传递、细胞色素c到氧以及含有伴侣蛋白的T复合体等术语显著富集（图4D，图S3A，表S6）。KEGG分析显示内质网蛋白处理、氧化磷酸化、马达蛋白、泛醌和其他萜类醌生物合成以及肌动蛋白细胞骨架调控等通路显著富集（图4E，图S3B，表S7）。GO术语的GSEA显示伴侣因子依赖的蛋白质重折叠、翻译和单原子离子运输显著富集（图4F，表S8），而KEGG通路的GSEA显示核苷酸切除修复和核糖体显著富集（图4G，表S9）。

**E.SPEs的差异表达和通路富集**
如图5A和表S5所示，H组和L组E.SPEs的差异表达分析发现了594个DEGs，包括21个上调基因和573个下调基因。基于E.SPE生理学的运动相关DEGs在图5B和6C中突出显示。例如，SNIP1、UBE2J2和CASQ1在L组E.SPEs中显著下调且表达更高。GO分析显示脂肪酸β-氧化（使用酰基-CoA脱氢酶）、蛋白质插入线粒体内膜、细胞呼吸、轴丝和微管复合体组装等术语显著富集（图5D，图S3C，表S6）。KEGG分析显示自噬-动物、磷脂酰肌醇信号系统、泛素介导的蛋白酶体、内质网蛋白处理和马达蛋白等通路显著富集（图5E，图S3D，表S7）。

**SCs的差异表达和通路富集**
如图6A和表S5所示，H组和L组SCs的差异表达分析发现了1,155个DEGs，包括333个上调基因和822个下调基因。基于SCs生理学的运动相关DEGs在图6B和6C中突出显示。例如，CLDN11、RPSA和AKAP7在H组SCs中显著上调且表达更高，而LSP1、COQ7和NDUFB2在L组SCs中显著下调且表达更高。GO分析显示糖酵解过程、ATP依赖的蛋白质折叠伴侣、细胞氧化还原稳态、肌球蛋白II复合体和响应氧化应激等术语显著富集（图6D，图S3E，表S6）。KEGG分析显示糖酵解/糖异生、吞噬体、肌动蛋白细胞骨架调控和电压门控钙通道等通路显著富集（图6E，图S3F，表S7）。GO术语的GSEA分析显示，三羧酸循环、线粒体呼吸链复合体I组装和线粒体内膜相关基因显著富集，而 focal adhesion、钙离子跨膜转运和电压门控钙通道复合体相关基因则显著减少（图7F，表S8）。KEGG通路的GSEA分析显示，氧化磷酸化、柠檬酸循环（TCA循环）和谷胱甘肽代谢相关基因显著富集，而MAPK信号通路、ErbB信号通路和ECM-受体相互作用相关基因显著减少（图7G，表S9）。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像

图7. 单细胞转录组景观和通路富集情况。（A）条形图显示LCs中上调和下调DEGs的数量；（B）火山图显示基于LC生理学选择的影响精子运动能力的DEGs；（C）散点图显示基于LC生理学选择的影响精子运动能力的DEGs的表达变化；（D）点图显示LC DEGs中富集的前20个GO术语；（E）点图显示LC DEGs中富集的前20个KEGG通路；（F）GSEA图显示LCs中排名基因的代表性GO术语富集情况；（G）GSEA图显示LCs中排名基因的代表性KEGG通路富集情况。

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图8. 选定的与运动能力相关的基因和睾丸细胞类型标记基因的RT-qPCR验证。（A）条形图显示各组间MPC1的相对表达；（B）条形图显示各组间CPT1B的相对表达；（C）条形图显示各组间HSPA2的相对表达；（D）条形图显示各组间PSMB1的相对表达；（E）条形图显示各组间TEKT3的相对表达；（F）条形图显示各组间CFAP418的相对表达；（G）条形图显示各组间SOD1的相对表达；（H）条形图显示各组间TXN2的相对表达；（I）条形图显示各组间DDX4的相对表达；（J）条形图显示各组间PIWIL1的相对表达；（K）条形图显示各组间SOX9的相对表达；（L）条形图显示各组间SPARC的相对表达；（M）条形图显示各组间STAR的相对表达；（N）条形图显示各组间CYP11A1的相对表达。统计结果以平均值±标准差表示。“****”表示组间差异极显著（P < 0.0001），“***”表示组间差异非常显著（P < 0.001），“**”表示组间差异显著（P < 0.01），“ns”表示组间无显著差异（P > 0.05）。RT-qPCR验证结果与scRNA-seq推断的表达变化一致。

RT-qPCR验证证实了scRNA-seq的结果，对八个选定的与运动能力相关的基因和六个代表性的细胞类型标记基因进行了检测。MPC1、CPT1B、HSPA2、PSMB1、TEKT3、CFAP418、SOD1和TXN2在H组中的表达显著高于L组（P < 0.05；图8A-H），而DDX4、PIWIL1、SOX9、SPARC、STAR和CYP11A1在各组间无显著差异（P > 0.05；图8I-N）。总体而言，RT-qPCR结果与scRNA-seq数据基本一致（表S5）。

**讨论**

在这项研究中，我们主要采用了单细胞转录组学方法，并结合了组织学分析和血浆生理学分析，以阐明鹅精子运动能力的细胞和分子机制。具有高精子运动能力的公鹅表现出较高的血浆生殖激素水平（Penfold等人，2001；Sabater等人，2025）、增强的抗氧化能力（Akhlaghi等人，2014；Li等人，2020）以及有利的代谢特征，这些都有利于精子的发生。组织学分析进一步表明，这些公鹅的睾丸结构良好，生精小管直径较大，生殖细胞数量较多，这与精子发生增强和精液质量改善有关（Hu等人，2025a；Xie等人，2025）。在单细胞水平上，据我们所知，我们首次生成了鹅睾丸的单细胞转录组图谱，系统地识别了主要的睾丸细胞类型及其标记基因，并发现了高精子运动能力和低精子运动能力公鹅之间的细胞组成和基因表达的显著差异。UMAP聚类结合标记基因分析描绘了不同发育阶段的生殖细胞及其支持的体细胞微环境（Tao等人，2025）。基于这些细胞在精子功能中的核心作用，选择了R.SPEs、E.SPEs、SCs和LCs进行差异表达分析（Fu等人，2018；Zhou等人，2019），发现了与精子发生改善和精子运动能力提高相关的系统生理状态和睾丸局部细胞及转录特征的协调差异。

H组中的R.SPEs表现出向线粒体电子传递、氧化磷酸化、内质网蛋白处理和伴侣蛋白介导的蛋白质重折叠的协调转录变化。这种模式表明，H组中的晚期精细胞分化发生在更有利于ATP产生、蛋白质折叠和产生运动精子所需的结构重塑的条件下（Du等人，2022；Guo等人，2023）。与此解释一致的是，先前的家禽转录组学研究也将精子运动能力的变异与氧化磷酸化、纤毛结构和细胞骨架组织以及代谢相关调控程序联系起来（Du等人，2022；Hu等人，2023），而最近在鹅中的研究进一步支持了睾丸和附睾转录组调控在精子运动能力差异中的重要性（Hu等人，2025a）。我们的内分泌数据进一步支持了一个多层次的调控框架，因为H组的T和LH水平较高，而CORT和PRL水平较低。这一模式与鸟类研究结果一致，即雄性生殖性能的提高可能与较高的T水平和较低的垂体PRL活性有关，而CORT的挑战会损害精液质量和精子的运动能力（Bartman等人，2021；Iyasere等人，2022）。然而，关于PRL的发现应谨慎解读，因为PRL与鸟类精液特征之间的关系并不总是负相关的。例如，最近的一项鸟类研究表明，血浆PRL与精子DNA完整性呈正相关，而不是对精液质量有普遍的负面影响（Sabater等人，2025）。在代谢水平上，H组中TC、TG和LDL-C没有显著差异，而HDL-C较高，L组中GLU水平较高，这表明精子运动能力的差异可能与系统代谢状态的差异有关，而不是循环脂质的普遍增加。这一解释得到了鸟类研究的支持，这些研究表明血液中的GLU与公鸡的精子运动能力呈负相关（Jarinkovi?ová等人，2012），而老年公鸡的精液质量改善可能与血清HDL-C升高和更有利的脂质谱有关（Barbarestani等人，2024；Asghari-Moghadam等人，2025；Behboodi等人，2026）。然而，由于一些家禽研究观察到精液质量的改善并未伴随血清脂质的显著变化，因此循环脂质指标应被视为相关的系统标志物，而不是精子运动能力的决定性因素（Abbaspour等人，2019）。相比之下，L组中R.SPEs中几个与纤毛和鞭毛相关的结构转录本的较高表达不应被解释为鞭毛组装的直接证据，因为家禽研究多次将精子运动能力的差异与涉及纤毛结构和动力蛋白功能的调控模块联系起来（Guo等人，2023；Hu等人，2023）。一个更合理的解释是，这些转录本反映了精细胞阶段转录时间的差异、转录清除的延迟或对组装缺陷的补偿反应；然而，这一解释需要在蛋白质和超微结构水平上进行验证。

与R.SPEs相比，E.SPEs表现出明显的不对称差异表达模式，H组中只有少数基因上调。这一模式与鸟类精子发生的生物学过程一致，在此过程中，晚期精细胞经历了显著的核浓缩和广泛的结构重塑（Aire，2014）。最近的鸡单细胞数据进一步表明，精子发生通过连续的阶段进行：R.SPE、核浓缩、泛素化、E.SPE和成熟精子（Guo等人，2025）。因此，H组中E.SPEs中几乎没有上调基因，这表明与高精子运动能力相关的转录特征可能在最终伸长阶段之前就已经建立，可能是在早期精细胞阶段。相比之下，L组中的E.SPEs保留了与线粒体代谢、鞭毛和细胞骨架组织以及蛋白质质量控制相关的基因和通路的较高表达，这表明低运动能力的精细胞可能在伸长阶段继续进行补偿性调整，而不是以完全优化的状态进入这一阶段。这一解释得到了鸟类研究的支持，这些研究表明晚期精细胞的成熟不仅伴随着染色质浓缩，还伴随着线粒体和微管的重组（Zakariah等人，2024）。此外，鸡的研究表明，泛素介导的蛋白质周转在晚期精细胞中仍然活跃，可能有助于精子发生过程中的蛋白质重塑（Agell和Mezquita，1988），而自噬标志物如LC3和Atg7主要定位于中期和晚期精细胞中，其中LC3在E.SPEs中尤为丰富（Haseeb等人，2019）。最近在鸭子中的单细胞转录组分析发现，核糖体相关、内质网蛋白处理和自噬通路在生殖细胞分化过程中具有阶段特异性富集，并将TSSK2和TSSK3与E.SPE形成联系起来（Tao等人，2025）。总的来说，这些鸟类发现支持这样的观点：L组中E.SPEs中线粒体、鞭毛/细胞骨架和蛋白质质量控制特征的持续存在可能反映了晚期的延迟或补偿性成熟，尽管这一解释仍然是推论性的，而非直接证据。

H组中的SCs表现出与增强屏障完整性和增强精子发生相关的代谢和氧化还原支持一致的转录程序。CLDN11的上调，以及紧密连接、双细胞紧密连接、连接蛋白复合体和肌动蛋白细胞骨架调节的富集，表明H组中SCs的连接组织得到增强。这一解释得到了鸟类研究的支持，这些研究表明claudin-11定位于支持细胞之间的连接处，并作为雉鸡睾丸中基底屏障（BTB）的结构成分（Park等人，2011）。在日本鹌鹑中，claudin-11、occludin和ZO-1主要定位于SCs和基底部分，这与它们作为鸟类BTB的主要成分的角色一致（Molele等人，2022）。除了屏障组织外，糖酵解过程、糖酵解/糖异生和谷胱甘肽代谢的富集表明，H组中的SCs可能为发育中的生殖细胞提供更有效的代谢缓冲和氧化还原保护。这一解释得到了鸟类研究的支持，这些研究表明鸡的SCs在代谢程序上存在显著差异，包括LDHA的表达和活性以及线粒体代谢（Faure等人，2017），以及公鸡的数据表明，生育能力降低与睾丸乳酸含量降低和SC–E.SPE关联改变有关（Weil等人，1999a）。然而，由于本研究中未直接测量乳酸水平和单羧酸转运，因此提出的SCs与生殖细胞之间的代谢耦合仍应被视为推论性的。血浆中的GLU和ALB可能作为全身能量和转运状态的间接指标，这可能影响SCs的功能环境。在家禽中，血浆GLU与精液特征有关（Jarinkovi?ová等人，2012；Ommati等人，2018），而血清ALB是参与营养和激素转运的主要鸟类血浆蛋白（Jiang等人，2022）。因此，H组中较低的GLU和较高的ALB更适当地解释为潜在更有利的代谢环境的系统相关因素，而不是SC介导的营养转移的直接证据。除了代谢支持外，H组中的SCs还表现出增强的细胞保护特征。ATP依赖性蛋白质折叠伴侣活性的上调、对氧化应激的反应和谷胱甘肽代谢表明，这些细胞可能更好地维持了生精上皮内的蛋白质稳态和氧化还原平衡。在鸡中，热应激会诱导睾丸氧化应激和内质网应激，降低抗氧化酶活性，并破坏生殖功能，而抗氧化干预可以缓解这些效应（Xiong等人，2020）。同样，老年公鸡中抗氧化能力的提高伴随着更好的T状态、线粒体功能和精液特征（Gao等人，2022）。相比之下，L组的精原细胞（SCs）表现出与细胞外基质重塑（ECM）和应激相关反应相关的基因表达更高。在鸟类睾丸中，ECM是组织发育和重组的一个公认组成部分（Huh等人，2013年），而氧化损伤已被证明与公鸡生精上皮完整性的下降有关（Escorcia等人，2020年）。因此，L组的精原细胞可能反映了更不稳定且与应激更相关的生精微环境，这可能不利于生殖细胞的发育。L组还表现出与运动能力相关的差异，这些差异将全身内分泌变化与局部通路水平的变化联系起来。我们的数据显示，H组的循环T细胞和LH水平较高，表明精子运动能力的差异伴随着支持睾丸功能的内分泌环境的差异。在鸟类中，LH是刺激L细胞合成T细胞的主要因素，而血浆中LH和T细胞水平的降低与老年公鸡的生育能力下降有关（Weil等人，1999b年）。与这种内分泌背景一致，单细胞数据表明H组的L细胞表现出更有利于精子发生的有效内分泌支持的通路特征。总体而言，这些通路水平的变化表明类固醇生成相关的信号增强、线粒体能量代谢更高效以及氧化还原稳态得到改善。这一解释得到了最近一项家禽研究的支持，该研究表明公鸡初级L细胞中的T细胞分泌伴随着线粒体生物发生和线粒体膜电位的增强（Chang等人，2025年）。此外，对公鸡的研究表明，T细胞合成的抑制伴随着细胞内cAMP信号和CREB磷酸化的减少，这表明cAMP/CREB相关通路参与了L细胞的类固醇生成调节（Xu等人，2021年）。相比之下，L组的L细胞表现出与线粒体代谢活性较弱、抗氧化维持能力降低以及间质对内分泌调节的支持作用较差相关的通路特征。这一解释与鸟类观察结果大体一致，即公鸡生育能力的下降伴随着间质成分的结构改变、功能性活跃L细胞数量减少以及血浆雄激素水平降低（Rosenstrauch等人，1998年；Weil等人，1999b年）。总体而言，这些结果表明，L细胞对鹅精子运动能力变化的贡献涉及类固醇生成相关信号、线粒体代谢、氧化还原稳态和间质微环境支持的协调差异。综合来看，目前的发现支持了一个综合性的框架，尽管仍然是推断性的，该框架认为鹅精子运动能力的差异与全身内分泌状态、代谢环境和睾丸局部细胞类型特异性分子程序的协调变化有关。在这个框架内，循环生殖激素和代谢指标的差异可能会影响体细胞支持环境，特别是L细胞的类固醇生成和线粒体功能，以及精原细胞的屏障、氧化还原缓冲和营养支持作用。这些体细胞变化又与发育中的生殖细胞的转录程序改变有关，尤其是在R.SPEs和E.SPEs中识别出的结构、生物能量和成熟相关通路，从而为最终精子运动能力的差异提供了合理的多层次解释。然而，由于这一框架主要基于单细胞转录组数据，并辅以组织学和血浆表型分析，因此应将其解释为生物学上一致的关联模型，而不是直接的机制证据。此外，尽管尽量减少了缺血时间和冷保存时间，安乐死程序和随后的组织处理仍可能引入与缺氧或缺血相关的短暂应激特征。尽管体内灌注可能进一步减少此类伪影（Kerr等人，2025年），但在活细胞scRNA-seq背景下将其应用于大型鸟类模型在技术上仍然具有挑战性。此外，我们的血浆测量反映了全身内分泌和代谢状态，而scRNA-seq数据捕获了睾丸局部的细胞和转录程序；因此，本研究主要支持循环激素或代谢物与特定睾丸通路之间的关联，而不是直接的因果关系。未来的研究需要结合靶向验证、代谢物分析和功能扰动来确定因果关系。

结论
本研究表明，鹅精子运动能力的差异可能与体细胞环境中增强的内分泌-代谢支持以及与晚期精子细胞成熟期间更强的轴丝组装一致的转录程序有关。在高运动能力组中，塞尔托利细胞表现出与增强的屏障功能和代谢/氧化还原支持一致的特征，莱迪希细胞显示出更强的线粒体-内分泌特征，圆形精子细胞富含与精子成熟相关的结构和生物能量程序。相比之下，低运动能力组中的延长精子细胞保留了更广泛的重塑和应激相关特征，表明末端分化效率较低（图9）。由于这些发现基于单细胞转录组分析，因此需要进一步的目标功能研究来验证推断的细胞相互作用和调节机制。

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图9. 与鹅睾丸中精子运动能力差异相关的细胞类型解析框架示意图。实线箭头表示主要的解释流程，虚线箭头表示支持性或推断性联系，而不是直接的因果关系。

CRediT 作者贡献声明
王鹤川：方法学、正式分析、撰写-原始草稿、调查、可视化、验证；
丛凯欣：数据管理、正式分析、调查、验证；
尹佳欣：调查、数据管理；
姜凯：正式分析、调查；
刘云诺：正式分析、调查；
任晓芳：项目管理；
张颖：监督、资金获取；
刘胜军：概念化、资源、撰写-审阅与编辑、资金获取。

资助
本研究得到了黑龙江省生物育种产业创新与发展项目“籽鹅经济性状的基因组范围关联研究”（编号2024-515）、国家自然科学基金（编号32202664）和黑龙江省自然科学基金（编号LH2022C067）的资助。

补充材料
与本文相关的补充材料可以在在线版本中找到，网址为doi:X。

数据可用性
本研究中生成的原始scRNA-seq数据已存放在GEO数据库中，访问号为GSE324222。

未引用的参考文献
Huh和Jung，2013年；Nickolova，2004年；Tzec-Interián等人，2025年

CRediT 作者贡献声明
王鹤川：撰写-原始草稿、可视化、方法学、调查、正式分析、验证；
丛凯欣：调查、正式分析、数据管理、验证；
尹佳欣：调查、数据管理；
姜凯：调查、正式分析；
刘云诺：调查、正式分析；
任晓芳：项目管理；
张颖：监督、资金获取；
刘胜军：撰写-审阅与编辑、资源、资金获取、概念化。