用于检测麝香鸭细小病毒和鹅细小病毒的双重晶体数字PCR与qPCR检测方法的开发与比较

《Poultry Science》：Development and Comparison of Duplex Crystal Digital PCR and qPCR Assays for the Detection of Muscovy Duck Parvovirus and Goose Parvovirus

　　刘慧欣|史开创|尹彦文|冯淑萍|冯龙|司洪斌|向斌|杨亮宇
中国云南省昆明市云南农业大学兽医学院，邮编650201

**摘要**
莫斯科鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）是具有高度传染性的水禽病毒，对家禽产业造成严重危害。本研究设计了针对MDPV和GPV非结构基因组的引物和探针，并优化了定量聚合酶链反应（qPCR）和双链晶体数字聚合酶链反应（dPCR）的扩增条件。结果表明，双链晶体dPCR方法具有很强的特异性，能够检测到MDPV和GPV而不与其他水禽病毒发生交叉反应。敏感性测试显示，qPCR的最低检测限为11.5拷贝/μL，而双链晶体dPCR的最低检测限显著降低至0.3拷贝/μL，表明dPCR在检测MDPV和GPV方面的灵敏度比qPCR高约38.3倍。该方法重复性良好，变异系数低于8.0%。在来自广西的52个临床样本中，MDPV和GPV的阳性率分别为15.38%和23.08%，其中有一个样本同时感染了这两种病毒。本研究证实，双链晶体dPCR是一种特异性强、灵敏度高的技术，尤其适用于检测病毒浓度较低的样本。

**引言**
水禽细小病毒（WPV）属于细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒亚科（Parvovirinae）和细小病毒属（Parvovirus）（Fan等人，2017；Walker等人，2021）。WPV具有约5 kb的线性单链DNA基因组，该基因组包含两个开放阅读框，两侧分别有5’和3’端的反向末端重复序列（ITR）（Chu等人，2001；Zadori等人，1994）。这些序列编码三种衣壳蛋白（VP1、VP2和VP3）和两种非结构蛋白（NS1和NS2）（Zadori等人，1995）。无包膜的病毒衣壳直径为20-22纳米，由32个衣壳颗粒组成（Wozniakowski等人，2012）。WPV对雏鹅和莫斯科鸭尤其具有威胁性，1周龄以下的雏鹅和鸭苗死亡率可达100%，随着年龄增长，死亡率逐渐下降（Hoekstra等人，1973；Yu等人，2016a）。此外，WPV具有垂直传播给后代的潜力（Derzsy，1967；Hoekstra、Smit和Van Brakel，1973）。根据抗原特性和宿主偏好，WPV被分为两大基因组群：莫斯科鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）（Fan等人，2017；Zadori等人，1995）。这两组病毒在形态、物理化学性质、培养特性和基因组结构上存在相似性，但在致病性和抗原性方面存在显著差异（Chen等人，2021）。近年来，发现了一种名为NGPV的GPV变种（Bian等人，2019）。2015年在中国东部报告了一种与NGPV和GPV相关的喙萎缩和侏儒综合征（BADS），其死亡率较低（Li等人，2016）。GPV和MDPV均为单链线性DNA病毒，长度分别约为5106 nt和5132 nt（Chu等人，2001；Zadori等人，1995）。GPV和MDPV的基因组序列同源性在79.6%至85.0%之间，两者之间存在交叉免疫保护作用（Chu、Pan和Cheng，2001）。主要区别在于宿主范围：鹅对MDPV感染具有免疫力，而这两种病毒均可导致莫斯科鸭严重疾病。GPV以高死亡率、水样腹泻、嗜睡、厌食、虚脱和体重下降为特征，可能导致Derzsy病（Huo等人，2023；Sallam等人，2022）；MDPV则表现为腹水、肠炎、心肌炎、肝炎、高死亡率和发病率，主要影响3周龄以下的幼鸟（Glavits等人，2005）。临床实践中常见MDPV和GPV的混合感染，这些病毒的症状非常相似，仅凭症状进行诊断较为困难，需要实验室确认（Dong等人，2019）。此外，GPV和MDPV在基因水平上的高度相似性可能导致在检测莫斯科鸭时因MDPV污染而出现假阳性（Wan等人，2019a）。因此，早期区分这两种病毒对于有效管理疾病至关重要。开发快速、特异性强且灵敏的分子检测方法对于GPV和MDPV的检测具有重要意义。现有的病毒检测技术如RT-PCR、RT-LAMP和实时定量RT-PCR存在局限性（Bustin等人，2005；Karthik等人，2014；Zhu等人，2020）。TaqMan探针专门设计用于结合目标DNA的特定区域，提高了区分具有高度核苷酸相似性的密切相关菌株的特异性（Gadkar和Filion，2014；Navarro等人，2015；Zhang等人，2010）。数字聚合酶链反应（dPCR）是一种先进的基因检测方法，可以解决这些问题（Quan等人，2018）。通过使用TaqMan探针，dPCR利用泊松分布直接量化目标基因的绝对拷贝数，无需标准样品校正（Deng等人，2017）。该方法对低模板浓度的样本具有出色的灵敏度和准确性（Hindson等人，2011；Pinheiro等人，2012）。近年来，晶体dPCR应运而生，结合了传统RT-PCR的定量能力和数字PCR的高灵敏度和准确性。其主要优势在于能够将样品分成数千个微小的反应单元，并将它们集成到一个芯片上，每个单元独立进行PCR扩增，从而在检测低丰度基因或罕见突变时具有更高的灵敏度（Huggett和Whale，2013）。Stilla Technologies开发的Naica?晶体dPCR利用微流控芯片和荧光显微镜技术实现核酸分子的精确定量检测（Madic等人，2016；Tan等人，2023）。尽管MDPV和GPV的基因组核苷酸高度相似，但由于NS基因区域的显著变化，特异性检测仍可能导致假阳性（Wan等人，2018）。然而，NS基因在MDPV和GPV中保持保守，基于NS基因的PCR检测方法显示出更高的特异性（Wan等人，2018）。本研究重点探讨了晶体dPCR的优势，并设计了针对MDPV和GPV非结构（NS）基因组的引物对和探针，优化了qPCR和双链晶体dPCR检测的扩增反应溶液组成和比例。通过建立液滴生成和PCR扩增步骤的工作条件，开发了一种同时检测MDPV和GPV的双链晶体dPCR方法，为预防这两种病毒提供了有效的技术解决方案。

**材料与方法**
**病毒株和临床组织样本**
取200 μL的MDPV疫苗株（FM株）和GPV疫苗株（GD株）病毒液，使用Ex-DNA/RNA病毒核酸提取试剂盒提取总DNA。同样，使用相同的试剂盒提取200 μL的Tambusu鸭病毒（DTMUV）疫苗株（FX2010-180P株）、H5亚型禽流感病毒（AIV）疫苗株（Re-12株）、H7亚型AIV疫苗株（Re2株）、H9亚型AIV疫苗株（JY株）、NDRV分离株（GX-2020株）、MDRV疫苗株（CA株）、蛋 drop综合征病毒（EDSV）疫苗株（HSH23株）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）疫苗株（B87株）和鸭瘟病毒（DEV）疫苗株的病毒液进行DNA/RNA提取。提取的DNA和逆转录后的cDNA储存在-20°C以备后续使用。所有病毒均来自我们的实验室。

**引物和探针**
本研究基于MDPV（GenBank登录号：MT450871.1）和GPV（GenBank登录号：MH444513.1）的NS基因序列，作为引物和探针设计的参考。具体来说，我们比较了MDPV和GPV的NS基因序列，以确定具有高特异性的序列区域，从而降低交叉反应的风险。利用保守区域的碱基序列，使用Oligo7.0软件确保符合TaqMan实时定量PCR的标准要求。该过程优化了Tm值、GC含量、二聚体形成等参数，确保引物的理论退火温度相当。随后使用BLAST分析最有前途的引物-探针组合以确认其特异性。引物和探针（详见表1）由Invitrogen（北京，中国）合成。

**表1. 本研究使用的引物和探针**

**核酸提取和逆转录**
从水禽的气管、肺、肝、脾、肾、胸腺和法氏囊中收集0.5 g的组织样本。将这些样本与无菌钢珠一起放入2 mL的灭菌离心管中，加入1 mL生理盐水后用研磨器研磨至细碎。然后进行离心，收集200 μL的上清液。使用Ex-DNA/RNA病毒试剂盒（天龙，西安，中国）提取DNA/RNA以备后续使用。病毒RNA按照TaKaRa（大连，中国）提供的说明书使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录。逆转录（RT）的总体积为20 μL，包括4 μL 5×缓冲液、1 μL dNTP混合物（10 mmol/μL）、8 μL RNA模板、1 μL随机六核苷酸引物（50 μmol/μL）、0.5 μL核糖核酸酶抑制剂（40 U/μL）、1 μL逆转录酶（200 U/μL）和4.5 μL无菌核糖核酸酶蒸馏水。反应过程包括室温孵育10分钟，随后在30°C孵育60分钟，最后在95°C孵育5分钟，然后冰冻保存。

**重组质粒的构建**
根据设计的引物构建了MDPV和GPV重组质粒。提取病毒DNA后进行PCR扩增和电泳。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳分离，目标DNA片段使用MiniBEST Agarose Gel DNA提取试剂盒（TaKaRa，大连，中国）纯化。随后将PCR纯化的产物连接到pUC18-T载体（TaKaRa，大连，中国）上，然后转化到DH5α感受态细胞（TaKaRa，大连，中国）中，接种在氨苄青霉素LB平板上并在37°C下过夜培养。使用MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 4.0（TaKaRa，大连，中国）从1.5 mL细菌溶液中提取质粒，并用酶消化。通过测序确认重组质粒的身份。质粒命名为pMDPV和pGPV，其浓度通过纳米分光光度计在260 nm和280 nm处测量紫外吸光度来确定。根据先前建立的公式计算质粒浓度（Liu等人，2023；Shi等人，2022）。

**qPCR条件优化和标准曲线**
以重组质粒为模板，在25 μL反应体系中使用特定引物和TaqMan探针进行qPCR扩增。通过矩阵法确定引物和探针的浓度（分别为25 pmol/μL和0.1-0.6 μL）。扩增条件包括95°C预热15秒，随后在QuantStudio 6实时PCR中以56-61°C进行特异性退火。通过实验优化获得了TaqMan荧光定量PCR的最佳反应条件。将重组质粒标准品进行10倍梯度稀释后，在最佳条件下进行TaqMan实时荧光定量PCR。通过测量每个循环结束时的荧光信号确定Ct值，从而确定每个样本中的质粒浓度。

**双链晶体dPCR条件优化和标准曲线**
将质粒浓度设定在晶体dPCR的可检测阈值范围内，即10^3拷贝/μL。向Sapphire芯片中加入25 μL混合物，其中包括引物、探针、重组质粒/样本cDNA和无RNase的水。按照制造商的说明，推荐的探针浓度是引物的2-4倍（Liu等人，2023）。NaicaTM系统需要12.5 μL PerfeCTa qPCR Tough UNG（Quantum Biosciences，Gaithersburg，MD）酶和2.5 μL荧光素钠盐（Apexbio Biotechnology，北京，中国），以确保所有液滴的充分成像。然后将Sapphire芯片转移到Nacia Prism 3仪器中，在每个孔中生成油滴。液滴由液滴发生器在1.15 atm的压力下产生，并均匀分布在芯片上。一旦选择了荧光通道和芯片位置，仪器会自动捕捉每个芯片的图像，并使用三色检测器和Droplet Bio Reader及Crystal Mine软件包（Stilla Technologies，法国）扫描每个孔中的单个液滴以进行数据分析。通过应用负液滴簇最高点的荧光幅度阈值，可以区分含有PCR扩增产物的阳性液滴和阴性液滴。在液滴生成和PCR扩增步骤中，会生成18,000到25,000个可分析的液滴，理论动态范围为5个对数级别，从0.2拷贝/μL到20,000拷贝/μL。每个样本的绝对浓度是使用NaicaTM Prism3（Stilla Technologies）分析仪器根据泊松分布计算阳性液滴与总液滴的比例自动确定的。反应条件的优化涉及改变探针浓度（200至500 nm）、引物浓度（600至1600 nm）和退火温度（56°C至61°C）。未使用模板对照（NTC）作为阴性对照。Duplex crystal dPCR的程序设置与qPCR相同，除了循环次数增加到45次。经过实验优化后，确定了理想的crystal dPCR反应条件。最初，重组质粒标准品被稀释10倍，模板浓度为1.15×10^3拷贝/μL，并在优化的退火温度、引物浓度和探针浓度下进行crystal dPCR。NaicaTM Prism3自动提供了每个样本的绝对浓度，可读阳性液滴的数量表示样本中阳性质粒的绝对数量。这些值随后是根据计算机程序生成的标准曲线计算得出的。

**duplex crystal dPCR的特异性、灵敏度和重复性分析**
crystal dPCR消除了对重组质粒标准品作为阳性对照的需求。相反，它直接使用MDPV和GPV的DNA，以及DTMVU、H5亚型AIV、H7亚型AIV、H9亚型AIV、MDRV、NDRV、EDSV、IBDV、DEV或cDNA的总DNA。这些样本被稀释10,000倍，每种使用2.5 μL作为模板。无RNase的双蒸水（NTC）作为阴性对照，实验在优化的反应条件下进行。溶液的制备是将pMDPV和pGPV的阳性标准品稀释至1.15×10^5拷贝/μL，然后再次稀释10倍至1.15×10^4拷贝/μL。随后，每种溶液使用2.5 μL作为qPCR检测和评估的模板，以确定duplex crystal dPCR的灵敏度并建立每种质粒的检测限（LOD）。pMDPV和pGPV的标准品被稀释至1.15×10^2拷贝/μL，然后再次稀释10倍至1.15×10^0拷贝/μL。组内和组间重复性测试各进行了三次。

**使用duplex crystal dPCR检测临床样本**
从中国广西沿海地区收集了52个疑似临床样本（Wang等人，2024a；Yin等人，2023）。这些样本被重新悬浮在pH值为7.2的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，涡旋后以12,000×g在4°C下离心5分钟。使用MiniBEST RNA/DNA提取试剂盒从组织上清液中提取总RNA或DNA。提取的遗传物质被逆转录成cDNA，并进行qPCR和crystal dPCR检测。然后计算了MDPV和GPV两种检测方法之间的符合率。

**重组质粒标准品的构建**
使用常规PCR，设计了特定的引物来扩增110 bp的MDPV片段和102 bp的GPV片段。随后，将扩增的DNA片段连接到pMD-18质粒载体上，然后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。筛选阳性菌落进行富集和质粒提取。构建的质粒命名为pMDPV和pGPV，并通过PCR和DNA测序进行确认。

**qPCR的最佳反应条件**
qPCR的制备使用了12.5 μL的Premix Ex TaqTM、各0.3 μL的MDPV上游和下游引物（25 pmol/μL）、0.2 μL的探针（20 pmol/μL）、各0.4 μL的GPV上游和下游引物（25 pmol/μL）、2.5 μL的重组质粒标准品pMDPV和pGPV作为模板，以及灭菌的双蒸水来补足体积。扩增程序包括在95°C下初始变性20秒，然后在95°C下变性40个循环，每个循环5秒，59°C下退火34秒，并收集荧光信号。

**duplex crystal dPCR的最佳反应条件**
经过优化实验后，分析了生成的液滴数量、液滴密度和前向流体的荧光信号高度。结果表明，理想的优化系统应在荧光幅度上显示出最显著的差异、最多的阳性液滴数量以及最小的液滴分散（Liu等人，2023）。图1A显示，选择59°C的退火温度可以获得最多的阳性液滴和总液滴数量。

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图1. cdRT-PCR反应条件的优化。该图显示了在不同退火温度（A）和不同引物/探针浓度（B）下，最终浓度为1.15×10^3拷贝/μL的pMDPV和pGPV质粒的扩增结果。N：阴性对照。
在各种引物和探针浓度组合中，图1B-C中的通道11因其具有最高的荧光信号值、最佳的液滴密度、负溶液和正溶液之间的清晰荧光信号区分度以及较低的分散液滴比例而脱颖而出。这个修改后的通道有效地区分了负溶液和正溶液的荧光信号值，同时保持了较低的中等分散液滴比例。因此，确定反应系统由PerfeCTa qPCR ToughMix UNG（2×）12.5μL、荧光素钠盐（10μM）2.5μL、600nM MDPV-F、600nM MDPV-R、200nM MDPV-P、1200nM GPV-F、1200 nM GPV-R、400 nM GPV-P和无RNase的双蒸水组成，总体积为25 μL。crystal dPCR的最佳反应程序包括在95°C下预变性15秒，然后在95°C下变性45个循环，每个循环5秒，59°C下退火34秒，最后在25°C下释放压力。扩增后，将PCR反应溶液加入蓝宝石芯片孔中，然后转移到NaicaTM Geode Dropper Generation and Amplification系统中。数据收集利用了NaicaTM Prism 3仪器上的晶体液滴阵列技术，预设参数为曝光时间65 ms。扩增后，将蓝宝石芯片从NaicaTM网格中取出并水平放置在NaicaTM Prism 3上进行识别。所有测试结果均通过NaicaTM系统报告。

**duplex crystal dPCR和qPCR的灵敏度和标准曲线**
重组质粒被稀释10倍，并使用qPCR和duplex crystal dPCR进行分析。评估标准设定为35个循环阈值（ct）值或3个有效阳性液滴（Shi等人，2022）。qPCR标准曲线分析显示，pMDPV的标准曲线由方程y=-3.454x+43.887表示，R2值为0.999；pGPV的标准曲线由方程y=-3.385x+41.372表示，R2值为1。qPCR的最低检测限确定为1.15×10^1拷贝/μL（图2A）。随后，将crystal dPCR的结果转移到Excel表格中。通过分析检测到的阳性液滴数量，将测量pMDPV和pGPV获得的平均拷贝数的对数值（Log10）绘制在y轴上，与阳性标准品的初始浓度的对数值（Log10）绘制在x轴上。这一过程生成了图2B中显示的标准曲线，其中pMDPV的标准曲线表示为y=0.9384x - 13.39，R2值为1；pGPV的标准曲线表示为y=0.9044x - 13.846，R2值为1。duplex crystal dPCR的最低检测限确定为0.3拷贝/μL。

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图2. 标准曲线和灵敏度实验。（A）是qPCR的标准曲线和最低灵敏度限。（B）是duplex crystal dPCR的标准曲线和最低灵敏度限。
比较测试结果表明，duplex crystal dPCR的检测灵敏度大约是qPCR的38.3倍。表2中的数据显示，duplex crystal dPCR的检测灵敏度优于qPCR。此外，通过将测量浓度的对数值与起始浓度的对数值进行绘图，实现了定量相关性。使用液滴数字PCR的分析显示MDPV和GPV的R2值为1。同样，从液滴数字PCR测试获得的Ct值与起始浓度进行比较，并使用对数值图建立定量相关性。相比之下，qPCR检测的MDPV和GPV的R2值分别为0.999和1，表明两种方法获得的结果具有极好的线性。

**表2. qPCR和dPCR的灵敏度比较测试数据**
| 质粒浓度（拷贝/μL） | qPCR | duplex crystal dPCR |
|-------------|--------|-----------------|
| pMDPV | 1.15×10^4 | 23.24 |
| pGPV | 1.15×10^3 | 20.84 |
| | 12 | 26.28 |
| | 1.15×10^3 | 24.88 |
| | 13 | 61.38 |
| | 1.15×10^2 | 29.95 |
| | 11 | 28.13 |
| | 11 | 19.71 |
| | 1.15×10^1 | 13.37 |
| | 12 | 12.81 |
| | 1.15×10^0 | 未检测 |
| | 1.03 | 1.03 |
| | 1.15×10^-1 | 未检测 |

**duplex crystal dPCR的特异性和重复性**
使用优化方法进行检测，结果显示该技术通过利用不同颜色的液滴成功识别了MDPV和GPV。其他模板测试结果为阴性，未观察到与不同病毒的交叉反应（图3）。本研究中使用的duplex crystal dPCR表现出高特异性，而使用NaicaTM的duplex crystal dPCR系统被证明是准确的。

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图3. 使用duplex crystal dPCR对不同病毒进行了特异性分析。图中显示了（A）MDPV通道和（B）GPV通道中的阳性液滴结果。NTC表示阴性对照。
使用三种浓度的重组质粒作为模板来评估其重复性。结果表明，同一组内的变异系数（CV）在1.92%到7.96%之间，不同组间的CV在1.53%到3.94%之间，表明具有高重复性（见表3）。

**表3. duplex crystal dPCR的重复性**
| 浓度 | MDPV | GPV |
|------------|--------|---------|
| | 10 | 116.87±6.16 |
| | 11 | 5.27 |
| | 11 | 15.47±2.01 |
| | 12 | 2.23±2.35 |
| | 12 | 1.92 |
| | 10 | 2.23±1.84 |
| | 10 | 1.53 |
| | 11 | 12.90±0.46 |
| | 12 | 3.57 |
| | 12 | 2.44±0.49 |
| | 12 | 3.94 |
| | 12 | 1.96 |
| | 12 | 2.88±0.54 |
| | 10 | 1.13±0.09 |
| | 7.96 |
| | 1.10±0.04 |
| | 3.64 |
| | 1.12±0.08 |
| | 7.14 |
| | 1.11±0.05 |

**duplex crystal dPCR和qPCR对临床样本的分析**
本研究使用duplex crystal dPCR和qPCR技术分析了从广西沿海地区临床患病鸭子中获得的52个组织样本。表4和表5的结果显示，qPCR方法识别出8个MDPV阳性样本和10个GPV阳性样本，所有样本的Ct值均低于35。此外，还有2个样本疑似GPV阳性，Ct值分别为35.45和36.13。另一方面，duplex crystal dPCR检测出8个MDPV阳性样本和12个GPV阳性样本。检测到的最低核酸浓度为0.18拷贝/μL（来自3个液滴）。通过统计分析阳性液滴数量，结果被认为是阳性的，MDPV和GPV的阳性率分别为15.38%和23.08%。此外，同时感染MDPV和GPV的情况占1.92%，并且两种方法都能检测到（图4显示了同一芯片上MDPV和GPV的共感染）。duplex crystal dPCR和qPCR之间的MDPV检测结果一致性率为100%，Kappa一致性值超过0.75。同样，GPV检测结果的一致性率为96%，Kappa一致性值也大于0.75，表明两种方法的结果具有很高的一致性。总之，duplex crystal dPCR的灵敏度高于qPCR，能够更清晰地区分阳性液滴和由杂质污染引起的假阳性，从而提高了检测低拷贝样本的准确性和可靠性。

**表4. duplex crystal dPCR和qPCR之间的一致性**
| 检测方法 | qPCR（ct≤35） | crystal dPCR（滴数≥3） |
|------------|-----------|-----------------|
| 病毒 | MDPV | GPV |
| MDPV+GPV | | |
| 正性数量 | 8/52 | 10/52 |
| 怀疑数量 | 0 | 0 |
| 负性数量 | 44 | 42 |
| | 5 | 44 |
| | 0 | 5 |

**表5.**通过多重qPCR检测临床样本。
收集日期：
地理位置：
品种：
样本类型：
qPCR检测到的阳性样本数量：
晶体dPCR检测到的阳性样本数量：

MDPV
GPV
MDPV+GPV
MDPV
GPV
MDPV+GPV

2019.10 中山
绿头鸭
组织样本
50
0
0
0

2020.08 北海
麝香鸭
组织样本
40
10
0
10

2020.08 昆州
鸳鸯
组织样本
60
40
0
50

2020.11 合州
麝香鸭
组织样本
32
0
0
20

2020.12 龙岩
绿头鸭
组织样本
40
0
0
0

2021.01 昆州
麝香鸭
组织样本
61
21
11
31
20

2021.01 柳州
麝香鸭
组织样本
40
10
0
10

2022.05 龙岩
麝香鸭
组织样本
30
10
0
10

2022.12 东兴
麝香鸭
组织样本
51
0
0
10

2023.01 昆州
麝香鸭
组织样本
72
0
0
20

2023.05 南宁
鸳鸯
组织样本
21
0
0
10

2023.10 南宁
绿头鸭
组织样本
11
0
0
10

总计：
528
101
81
21

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图4. 该图显示了共感染样本中的阳性滴液，绿色代表MDPV，红色代表GPV，黄色代表MDPV+GPV。

**讨论**
近年来，肉鸭和肉鹅产业快速发展，给商业水禽养殖带来了更多挑战。法国（Palya等人，2009年）、匈牙利（Tatar-Kis等人，2004年）、瑞典（Jansson等人，2007年）、英国（Irvine等人，2008年）、美国（Glavits等人，2005年）和中国（Chen等人，2016年）都报告了WPV的流行情况。WPV在肉鸭及其繁殖群体中尤为严重，导致全球水禽生产遭受重大经济损失（Glavits等人，2005年；Wozniakowski等人，2009年）。影响水禽的细小病毒，如MDPV和GPV，属于Dependovirus属和Parvoviridae科（Zadori等人，1995年）。GPV感染通常会导致腹泻和瘫痪，死后检查可见特征性的肠道栓塞（Brown等人，1995年；Chen等人，2015年；Derzsy，1967年）。另一方面，MDPV可导致腹泻、喘息和蹄部软化（Maurin-Bernaud等人，2014年；Yen等人，2015年；Yu等人，2016b年；Zhu等人，2014年）。GPV在各种压力下持续进化，扩大了宿主范围并发展出多种致病性（Bian等人，2019年；Li、Li、Chen和Liu，2016年；Palya等人，2009年）。由于MDPV和GPV在病毒形态、物理和化学性质以及基因组结构上的相似性，它们的基因组高度同源，具有共同的抗原，因此鉴定和检测较为困难（Wan等人，2018年）。尽管针对鹅的Derzsy病和麝香鸭的3-w病采取了预防措施，但这些感染仍对水禽生产构成威胁。这些疾病之间的密切关系体现在基因组的核苷酸和氨基酸序列上（Le Gall-Recule和Jestin，1994年；Zadori、Erdei、Nagy和Kisary，1994年）。快速准确的诊断对于管理这两种疾病至关重要（Wozniakowski等人，2012年）。已经开发了多种传统方法来检测MDPV和GPV，包括在雏鹅或鸭胚胎中分离病毒（Chen等人，2015年）、使用PCR-HRM区分MDPV和GPV（Dong等人，2019年）、ELISA进行检测、传统PCR检测GPV（Zhang等人，2010年）、双重PCR检测两种病毒（Limn等人，1996年；Wan等人，2019b年）、RFLP检测MDPV（Yu和Li，2016年）以及环介导的MDPV检测（Ji等人，2010年）。然而，这些方法在特异性和敏感性方面存在局限性，尤其是在具有核苷酸变异的混合感染中区分MDPV和GPV时。分子检测方法，如PCR和LAMP，虽然具有特异性，但无法量化病毒载量，而这在病因学和流行病学研究中至关重要（Ji、Xie等人，2010年；Limn等人，1996年）。本研究提出的技术更快且劳动强度更低，还能提供定量数据，用于详细的病理机制和流行病学分析，这是其他技术无法实现的。TaqMan荧光定量PCR的灵敏度通常可达10^1拷贝/μL，结果通过观察扩增曲线确定（Yu等人，2023年）。目前，单重实时qPCR可以检测到低至10拷贝的GPV，而MDPV和GPV的双重检测灵敏度可达1.6×10^1拷贝/μL（Wozniakowski等人，2012年）。

本研究开发了特定的上游引物、下游引物和TaqMan探针，利用MDPV和GPV的保守NS基因组区域来扩增这两种病毒。通过优化反应条件（如引物和探针浓度、退火温度等），建立了荧光定量PCR方法和双重晶体dPCR方法，以同时识别和检测GPV和MDPV。两种测试结果的比较显示，qPCR的最低检测限为1.15×10^1拷贝/μL，而晶体dPCR的最低检测限为0.3拷贝/μL，其灵敏度约为qPCR的38.3倍。本研究中的双重晶体dPCR表现出更好的灵敏度，阳性滴液通过NaicaTM 3系统（荧光显微镜）可视化，并通过成像进行分析以防止双重qPCR中的假阳性。本研究达到的检测限超过了现有方法。在后续实验中，双重晶体dPCR对其他鸭源病原体（如DTMUV、H5亚型AIV、H7亚型AIV、H9亚型AIV、NDRV、MDRV、EDSV和DEV）显示出更高的特异性，这些病原体均未检出。双重晶体dPCR测试还表现出良好的重复性，组内CV范围为1.92%至7.96%，组间CV范围为1.53%至3.94%，表明其检测结果可靠。需要注意的是，尽管本研究的特异性验证范围广泛，但并未涵盖所有常见的水禽交叉反应病原体，如细菌（大肠杆菌、Riemerella anatipestifer、Pasteurella multocida）和其他DNA病毒（如环状病毒、腺病毒）。本研究使用的病毒株来自广西动物疾病控制与预防中心（CADC），该机构具有权威性，确保了病毒株的来源清晰和真实性。对于RNA病毒，在检测前将其逆转录为cDNA，所有样本均呈阴性，证明没有非特异性扩增。此外，对表1中列出的引物和探针序列进行BLAST分析后，未发现与上述细菌或其他DNA病毒的基因组有显著同源性，从而提供了支持该方法特异性的计算机证据。尽管如此，我们完全同意，包括特征明确的细菌分离株和更多DNA病毒株在内的更全面的验证将进一步加强这一结果。随着这些分离株在实验室中的可用性，我们承诺在未来的研究中进行更广泛的特异性评估。

通过对广西沿海地区52份临床样本的分析，双链晶体dPCR被验证为MDPV和GPV的快速检测和诊断工具。MDPV和GPV的阳性率分别为15.38%和23.08%，表明这些病毒在广西沿海地区的水禽中虽然零星存在，但较为普遍。这种流行可能与广西独特的地理环境、养殖方式等因素有关。中国已引入疫苗来预防和控制这两种病毒，包括从MDRV的CA株和GPV的syg41-50株衍生的减毒活疫苗。然而，广西沿海地区主要由中小型养殖户经营，这有利于水禽的引入和运输（Liu等人，2018年）。此外，后续的疫苗接种工作和其他相关流程受到WPV的影响。GPV和MDPV分为两个不同的分支，GPV进一步分为经典GPV（C-GPV）和新GPV（N-GPV），每种类型又包含三个亚组，突显了GPV的显著遗传多样性。重组分析发现了11次重组事件，表明存在C-GPV、N-GPV和MDPV的共感染。基于系统地理学分析，本研究指出中国是GPV的重要输出国，贸易可能是传播途径（Huo等人，2023年）。关于广西WPV感染的研究在国际文献中较少报道；然而，值得注意的是，广西与越南北部接壤。2022年，越南报告称从北部几个省份/城市的130份混合组织样本中，有26份检测出细小病毒感染，其中38个农场中有14个（36.84%）检测出WPV基因组阳性（Dong等人，2022年）。这些发现与本研究观察到的检测率一致。2022年和2024年关于越南GPV流行病学的研究报告记录了从患有短喙和侏儒综合征（SBDS）的鸭子中分离出GPV，并对其NS和VP1基因序列进行了系统发育分析（Hoan等人，2022年；Huang等人，2024年）。这些分析表明越南分离的病毒株与中国病毒株有密切关系。此外，迁徙鸟类被认为是广西疾病传播的重要因素。研究表明，与东亚-澳大利亚（EAA）迁徙路线相关的GPV流行株可以在迁徙鸟类的粪便中检测到（Wang等人，2024b）。广西的热带和亚热带季风气候为这些迁徙鸟类提供了关键栖息地。中小型养殖户常在偏远河流附近建立养殖场，增加了接触迁徙鸟类携带的病原体的可能性。一些研究探讨了GPV和MDPV感染之间的关系，重点关注年龄、临床症状和病毒DNA拷贝数（Wozniakowski等人，2012年）。然而，由于研究机构的特殊性，所有收集的样本均来自农民送往处理设施的患病和死亡动物，导致关于年龄的准确和完整注册信息缺乏。此外，死亡时间显著影响病毒拷贝数，进一步增加了样本来源的复杂性。

值得注意的是，本研究使用2D散点图和微阵列技术报告的MDPV/GPV共感染率为1.92%。研究表明，适应性进化和基因组重组是由于WPS变异株的点突变和共感染导致的（Shen等人，2015年；Wang等人，2015年；Wang等人，2016年）。这表明病毒共感染不仅可能加速新变异株的产生，还可能促进免疫逃逸并增强病毒的传播能力。鉴于这些发现，密切监测病毒突变、优化疫苗策略并加强病毒共感染研究对于水禽疾病预防和控制至关重要。

结果显示，dPCR和qPCR在MDV检测方面的一致性达到100%，Kappa系数超过0.75。同样，GPV检测的一致性率为96%，Kappa系数为0.885，超过了0.75的阈值。这些发现突显了dPCR在检测低浓度样本方面的优越灵敏度和准确性。双重晶体dPCR的视觉芯片扫描结果在区分阳性和假阳性滴液方面具有显著优势，进一步提高了低拷贝样本的检测准确性。研究表明，虽然qPCR被广泛使用，但双重晶体dPCR在检测复杂样本（尤其是低核酸浓度样本）时更为可靠和一致。总体而言，这项研究提供了一种精确可靠的病原体检测方法，特别适用于需要高灵敏度和准确性的应用，如早期诊断、定量分析和这些病原体的流行病学监测。

大多数养殖场已实施疫苗接种措施来预防WPS，但在广西沿海地区仍会发生疫情。先前的研究表明，尽管在商业鹅和鸭群中广泛使用细小病毒疫苗，但适应性进化和基因组重组增加了预防和控制的复杂性（Chen等人，2016年；Lin等人，2019年；Wang等人，2017年；Wang等人，2015年；Wang等人，2016年；Wang等人，2013年）。WPS变异株的点突变积累和共感染加剧了这一挑战，使得疾病净化变得更加复杂。此外，通过繁殖蛋、蛋箱和运输途径，WPV可能污染孵化场，导致鸭子和鹅的早期感染。有效免疫和孵化鸭子和鹅、优先进行现场消毒以及在引入雏鸟前彻底消毒环境至关重要。双重晶体dPCR凭借其卓越的灵敏度，能够全面监测环境中的病毒颗粒。这项技术可以指导农场消毒测试，定性和定量分析疑似感染样本，并增强对家禽产品繁殖、运输、病毒感染和携带状态的监测。研究表明，dPCR技术在病毒载量低或样本复杂的样本中具有显著优势。这种技术对于动物疾病的早期诊断特别有益，尤其是那些影响水禽的疾病，尤其是在感染尚未表现出明显临床症状时。dPCR能够提供高度准确的信息，并具有很高的检测灵敏度，这对于疫苗接种后的病毒监测以及接种前评估病毒载量至关重要。通过能够敏感地检测到低浓度的病毒，dPCR可以帮助农场及时识别潜在的感染源，并采取有针对性的流行病预防措施，以防止病毒在整个群体中的传播，从而减轻经济损失。尽管dPCR相关的设备成本相对较高且操作复杂，但技术的不断进步和设备的逐渐普及预示着其在临床和动物疾病检测中的广泛应用前景。例如，在资源有限的地区，随着市场需求的增加，dPCR技术和设备的成本可能会下降，相关的技术培训和支持服务也可能变得更加完善。对于大型农场或实验室来说，dPCR仍然是一种具有显著应用价值的高灵敏度检测方法。总体而言，尽管在临床应用中面临一些挑战，但dPCR的灵敏度和准确性使其成为疾病监测、早期诊断和疫苗效果评估的重要补充技术。未来，随着技术的成熟和设备的普及，dPCR有望成为一种更广泛的病毒检测工具，特别是在复杂环境和病毒浓度较低的情况下，从而发挥越来越重要的作用。

**结论**
本研究开发了一种精确且灵敏的双链晶体dPCR方法，用于MDPV和GPV的差异检测和定量，显示出高特异性和重复性。该方法对这两种WPV病原体具有显著的灵敏度，每种病原体的检测限（LOD）为0.3拷贝/μL。这种特定、灵敏且准确的双链晶体dPCR方法在检测样本中的低浓度病毒方面特别有效，是MDPV和GPV检测的宝贵工具。值得注意的是，这是首次报道开发用于MDPV和GPV差异检测和绝对定量的双链晶体dPCR方法，表明其在中国作为WPV检测的有效替代方法以及在MDPV和GPV同时流行的地区作为诊断工具的潜力。

**作者贡献**
刘慧欣：概念构思、数据管理、正式分析、初稿撰写；史开创：资金获取、数据管理、数据可视化；尹彦文：资金获取、研究、数据可视化；冯淑萍：正式分析、方法学研究；冯龙：软件开发；司洪斌：研究工作；向斌：监督；杨亮宇：正式分析、资金获取、审稿与编辑。

**CRediT作者贡献声明**
刘慧欣：初稿撰写、正式分析、数据管理、概念构思。
史开创：数据可视化、资金获取、数据管理。
尹彦文：数据可视化、研究工作、资金获取。
冯淑萍：方法学研究、正式分析。
冯龙：软件开发。
司洪斌：研究工作。
向斌：监督。
杨亮宇：审稿与编辑、资金获取、正式分析。