靶向核盘菌丙酮酸脱氢酶复合体X组分（SsPDHX）的RNAi技术为菌核病防控提供新策略

《Molecular Plant Pathology》：Sspdhx Related to the Development and Virulence of Sclerotinia sclerotiorum Represents a Potential RNAi Target for Controlling Sclerotinia Disease

【编者推荐】为解决菌核病传统化学防治面临的抗药性问题，研究人员聚焦于核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的毒力相关基因SsPDHX开展研究。通过基因敲除、转录组分析和RNAi技术，他们发现SsPDHX在病菌生长、菌核发育、侵染垫形成和毒力中起关键作用。外源施加靶向SsPDHX的双链RNA（dsRNA）及利用寄主诱导的基因沉默（HIGS）均能有效减弱病菌毒力。该研究为基于RNA的菌核病绿色防控策略确立了一个有潜力的新靶点。

　　

菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的一种毁灭性真菌病害，它能侵染油菜、大豆、向日葵等多种重要经济作物，造成巨大的农业损失。这种病菌依靠在土壤或病残体中长期存活的菌核度过不良环境，其防治主要依赖化学杀菌剂。然而，田间已出现抗药性菌株，使得防治愈发困难。因此，深入理解核盘菌的致病机制，寻找新的毒力相关基因，对于开发抗病品种、环境友好的生物防治策略及精准农业管理至关重要。在这一背景下，沉默毒力相关基因，特别是利用RNA干扰（RNAi）技术，成为了一种极具前景的病害控制新思路。然而，目前已验证的有效靶基因数量仍然有限。近日，发表在《Molecular Plant Pathology》上的一项研究，瞄准了核盘菌能量代谢中的一个关键组分——丙酮酸脱氢酶复合体X（Pyruvate dehydrogenase complex component X, PDHX），探索了其作为RNAi防控靶点的巨大潜力。

为了开展研究，作者主要运用了以下关键技术方法：1) 基因敲除与遗传互补：利用分裂标记技术构建了SsPDHX编码基因Sspdhx的纯合敲除突变体，并通过农杆菌介导的转化进行了遗传回补。2) 表型分析：系统比较了野生型、突变体及回补菌株在生长速率、菌核产量、胁迫耐受性（如H₂O₂、离子胁迫等）及在不同寄主植物（本氏烟、拟南芥、甘蓝型油菜）上的毒力差异。3) 代谢物检测：测定了菌丝中乙酰辅酶A（acetyl-CoA）和三磷酸腺苷（ATP）的水平。4) 转录组学分析：对野生型和突变体在营养生长阶段及侵染寄主（甘蓝型油菜）16小时后的样本进行了RNA-seq测序，分析差异表达基因（DEGs）及其富集通路。5) RNAi技术应用：包括体外合成靶向Sspdhx的双链RNA（dsRNA）进行喷雾诱导的基因沉默（SIGS）实验，以及构建RNAi载体进行寄主诱导的基因沉默（HIGS）实验，在本氏烟和拟南芥中评估其防控效果。

1. 核盘菌中丙酮酸脱氢酶复合体X的鉴定

研究人员从核盘菌实验菌株Sunf-M中鉴定出Sspdhx基因，其编码的SsPDHX蛋白包含一个脂酰结合域和一个外周亚基结合域（PSBD），这些结构域在子囊菌门真菌中高度保守。通过分裂标记技术成功构建了两个纯合敲除突变体（ΔSspdhx-19, ΔSspdhx-20）和一个回补菌株（Sspdhx-19C），并通过Southern印迹验证了敲除事件的单拷贝整合。

2. SsPDHX是致病性和侵染垫形成所必需的

表型分析发现，尽管菌落形态无显著差异，但ΔSspdhx突变体的生长速率降低了约14%，产生的菌核数量减少了约26.6%，干重降低了31.3%。更重要的是，突变体在本氏烟、拟南芥和甘蓝型油菜上的毒力显著减弱。无论是通过伤口还是完整叶片接种，突变体引起的病斑面积都显著小于野生型。进一步观察发现，突变体在玻片和拟南芥叶片上形成的侵染垫（感染初期用于穿透寄主角质层的关键结构）数量和面积均大幅减少，这直接影响了其穿透寄主的能力。

3. Sspdhx敲除降低了乙酰辅酶A和ATP水平

由于PDHX是丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）的关键组分，负责将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。检测发现，ΔSspdhx突变体中乙酰辅酶A水平降低了83.8%，ATP水平降低了43.2%。为了验证乙酰辅酶A缺乏是导致毒力下降的原因，研究人员在接种前对甘蓝型油菜叶片施加外源乙酰左旋肉碱。结果发现，该处理能部分恢复ΔSspdhx突变体的毒力，但对野生型和回补菌株无显著影响，表明乙酰辅酶A代谢缺陷是突变体毒力减弱的重要因素。

4. Sspdhx的敲除损害了多种胁迫条件下的耐受性

核盘菌在侵染过程中需要精细调控宿主的氧化还原环境。研究发现，ΔSspdhx突变体对外源H₂O₂的敏感性显著增加，同时对细胞壁扰动剂（刚果红）、膜胁迫剂（SDS）以及离子胁迫（CaCl₂, NaCl）也更敏感，表明SsPDHX在维持氧化应激和一般胁迫耐受性中起关键作用。

5. Sspdhx的敲除破坏了中枢代谢稳态

转录组分析揭示，在营养生长阶段，ΔSspdhx突变体有1038个差异表达基因，主要富集在碳水化合物代谢、催化活性和氧化还原酶活性等相关通路。在侵染阶段（16 hpi），有778个差异表达基因，与多糖结合、纤维素降解和膜功能等相关。KEGG通路分析显示，突变体中涉及氨基酸代谢、碳代谢、氧化磷酸化以及淀粉和蔗糖代谢的基因表达发生广泛重编程。同时，多个与毒力相关的基因，如那些参与侵染垫形成、草酸生物合成、细胞壁降解和效应子样功能的基因表达下调。

6. 外源施用Sspdhx-dsRNA降低了核盘菌的毒力**

为了评估Sspdhx作为RNAi靶点的可行性，研究人员在甘蓝型油菜叶片上预先施用体外合成的靶向Sspdhx的dsRNA。与施用清水或gfp-dsRNA的对照相比，施用Sspdhx-dsRNA能显著减小接菌后形成的病斑面积，并有效下调病菌体内Sspdhx的表达水平，证明了喷雾诱导的基因沉默（SIGS）策略的有效性。

7. Sspdhx的寄主诱导基因沉默（HIGS）增强了本氏烟和拟南芥的抗性

研究人员构建了靶向Sspdhx的RNAi载体，并分别在本氏烟中瞬时表达以及在拟南芥中稳定转化。结果表明，表达Sspdhx-RNAi的本氏烟和转基因拟南芥植株，在接种核盘菌后，病斑面积显著小于对照植株。RT-qPCR证实，在侵染过程中，病菌体内Sspdhx的表达被成功抑制。这为利用寄主诱导的基因沉默（HIGS）培育抗病作物提供了直接证据。

结论与意义

本研究系统阐明了核盘菌丙酮酸脱氢酶复合体X组分（SsPDHX）的重要生物学功能。Sspdhx的缺失通过破坏PDC完整性，导致乙酰辅酶A和ATP合成严重受阻，进而引发中枢碳代谢和氧化还原稳态失调。这种代谢紊乱最终表现为病菌生长减缓、菌核发育不良、胁迫耐受性下降、侵染垫形成缺陷以及毒力显著减弱。转录组数据进一步支持了这些表型变化源于广泛的转录重编程。

该研究的突出意义在于，不仅从基础研究层面揭示了一个关键代谢组分如何全局性影响病原真菌的致病力，更在应用层面取得了实质性突破。通过SIGS和HIGS两种技术路线，研究均证实沉默Sspdhx能有效削弱核盘菌的毒力。由于Sspdhx在病菌存活和致病中均扮演不可或缺的角色，且其同源序列在多种有益生防菌（如哈茨木霉、球孢白僵菌、盾壳霉）中未被有效靶向，表明其作为RNAi防控靶点具有高度的特异性与安全性。在传统化学杀菌剂面临抗性压力的背景下，此项工作为开发基于RNA干扰的新型、环保的菌核病防控策略，提供了一个极具前景的候选靶点，展现了“代谢干预”作为植物病害绿色防控新途径的巨大潜力。