一种基于功能差异化的DNA四面体结构的级联循环催化扩增检测方法，用于检测前列腺癌中的miR-21

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A functionally differentiated DNA tetrahedron-based cascaded cyclic catalytic amplification assay for detecting miR-21 in prostate cancer

前列腺癌中miR-21的高灵敏度快速检测方法研究。本研究开发了一种基于DNA四元代谢策略（TICA）的多功能检测系统，通过自持催化循环实现前列腺癌中miR-21的高灵敏度快速检测，线性范围达600 fM至100 nM，检测限低至400 fM，反应时间缩短至80分钟。

　　

郭婷婷|常佐|白萍|胡玲玲

中国重庆重庆市中医院，邮编400021

摘要

我们开发了一种新型的多功能DNA四面体基目标诱导级联循环催化扩增（TICA）检测方法，用于灵敏检测前列腺癌中的microRNA-21（miR-21）。该方法巧妙地将两种具有特定功能的DNA四面体（催化四面体（Cat-DT）和信号DNA四面体（Sig-DT）结合在一起，形成了一个自维持的扩增电路。当miR-21触发DNA酶活性链（E-DNA）的释放时，整个过程开始，该活性链将Cat-DT转化为三分支DNA纳米结构（TB-DNA）。每个TB-DNA都充当级联放大器，携带三个E-DNA单元，从而驱动更多催化位点的指数级生成。此外，该系统采用了一个巧妙的反馈循环：TB-DNA与Sig-DT的相互作用产生荧光信号，同时再生miR-21模拟链，以维持催化循环。这种“目标→催化剂→新目标”的机制实现了超高效扩增，miR-21的检测范围为600 fM至100 nM，检测限低至400 fM。值得注意的是，TICA方法将总反应时间显著缩短至80分钟，显示出在快速灵敏的临床诊断中的巨大潜力。

引言

前列腺癌（PCa）是全球男性中最主要的恶性肿瘤之一，在过去几十年中显著导致了男性癌症相关发病率和死亡率[1]、[2]。及时检测和切除癌前前列腺上皮病变（PIN）或早期肿瘤可以有效控制PCa的进展并减少转移，因此早期诊断对于提高患者的5年生存率至关重要[3]、[4]、[5]。目前，PCa的临床筛查主要依赖于前列腺特异性抗原（PSA）检测、直肠指检（DRE）和经直肠超声（TRUS）引导的活检[6]、[7]、[8]。然而，这些方法存在明显局限性：良性病变（如良性前列腺增生BPH）也可能导致PSA水平升高，从而产生高假阳性率；DRE的敏感性不足以检测早期肿瘤，并且高度依赖于操作者的经验；而TRUS引导的活检具有侵入性，存在并发症的风险[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。因此，迫切需要非侵入性的、准确的PCa诊断方法。

microRNA（miRNAs）是一类内源性非编码RNA，长度约为19-23个核苷酸，不参与蛋白质合成[14]、[15]。相反，它们主要通过结合目标mRNA的特定区域在转录后水平调节基因表达，从而影响各种细胞生理过程[16]、[17]。在过去十年中，关于miRNAs在PCa中的研究取得了大量进展，揭示了它们在PCa发病机制中的关键作用[18]、[19]。其中，miR-21是一种特征明确的致癌miRNA（oncomiR），其在PCa组织、血清和尿液样本中的表达显著高于良性前列腺组织或健康对照组[20]、[21]、[22]。这种持续的过表达使miR-21成为PCa发展和进展的关键介质。

已经开发出多种技术用于检测PCa样本中的miR-21，包括逆转录-PCR（RT-PCR）、荧光原位杂交（FISH）和滴式数字PCR（ddPCR）[23]、[24]、[25]。然而，这些传统方法仍然受到高样本消耗、对同源miRNAs的特异性较差以及数据分析程序复杂的限制[26]、[27]。为了提高miRNA检测的灵敏度，已经广泛采用了几种基于核酸的等温扩增技术，如杂交链反应（HCR）、催化发夹组装（CHA）、滚环扩增（RCA）和链置换扩增（SDA）[28]、[29]、[30]。这些方法的有效性受到它们依赖于线性或单向扩增的局限。在传统的目标回收扩增技术中（例如，标准CHA或SDA），激活的催化复合物总数受到初始目标分子绝对数量的热力学限制。一旦目标结合，活性催化剂的浓度达到平台期，导致信号随时间线性增长[31]。相比之下，我们的TICA系统作为一个分支级联放大器，单个目标触发的三分支DNA（TB-DNA）生成三个独立的酶活性单元，这些单元随后切割更多的Cat-DT。这种特定的“目标→催化剂→新目标”机制驱动催化位点的指数级自我增殖，从根本上克服了单向扩增的缓慢动力学特性[32]。

最近，定制的DNA纳米结构因其精确的可编程性、优异的生物相容性和结构多样性而成为生物医学应用中的强大工具[33]、[34]、[35]。基于这些优势，本研究提出了一种高效的miR-21检测方法，通过创新的TICA机制实现了卓越的灵敏度、快速的动力学和自维持操作。与传统的线性探针（例如简单的发夹结构）不同，刚性DNA四面体支架引入了显著的空间限制效应。这种限制显著降低了级联杂交过程中的构型熵（ΔS），有效突破了热力学扩散极限。因此，催化元素的局部浓度显著提高，实现了超快的反应动力学。此外，这种3D刚性结构在复杂的生物基质中提供了比线性双链更优越的结构稳定性和抗核酸酶降解能力。这些独特性质从根本上证明了在我们的设计中采用四面体配置的科学必要性。该过程由miR-21启动，它释放一种酶活性链（E-DNA），将催化DNA四面体（Cat-DT）转化为三分支纳米结构（TB-DNA）。每个TB-DNA携带三个E-DNA单元，然后通过转化更多的Cat-DT来驱动指数级级联。此外，该系统巧妙地整合了一个机制：TB-DNA与Sig-DT的相互作用产生荧光信号，同时生成大量的miR-21模拟链。这种“目标→催化剂→新目标”的机制确保了强大的信号放大和显著加速的检测过程。

章节片段

化学试剂和设备

所有DNA序列的详细信息见表S1，所有序列均购自上海Sangon Biotechnology有限公司。PBS缓冲液购自北京Leagene Biotech有限公司，分析级NaCl和MgCl?购自Aladdin Scientific Corp.

DNA四面体（cat-DT和sig-DT）的制备

Cat-DT由四种定制合成的单链寡核苷酸组成，分别命名为Cat-1、Cat-2、Cat-3和S-DNA。最初，Cat-1、Cat-2和Cat-3被混合

miR-21检测的TICA策略原理

在图1中，TICA策略被描述为一个分为两阶段的稀释过程：（1）miR-21触发E-DNA从Locked-E-DNA中的释放，激活DNA酶活性，将Cat-DT转化为TB-DNA纳米结构；（2）TB-DNA与Sig-DT发生循环扩增级联反应，产生荧光信号的同时再生miR-21模拟物。该示意图为后续实验验证提供了基础框架。通过竞争性结合，miR-21触发

结论

本研究构建了一种基于功能差异化的DNA四面体的TICA系统，用于检测前列腺癌中的miR-21。依靠“目标→催化反应→新目标”的循环机制，该系统实现了高效的信号放大，显著缩短了反应时间并提高了检测灵敏度。

优化后，该系统对miR-21的检测范围为600 fM–100 nM，检测限低，并能特异性识别miR-21。

伦理声明

本研究严格遵循《赫尔辛基宣言》进行，并获得了重庆市中医院伦理委员会的批准（批准编号：2022-ky-11）。本研究中使用的血清样本来自接受常规治疗的患者的剩余临床标本。由于对参与者的风险很小且使用了废弃样本，伦理委员会免除了书面知情同意的要求，因此采用了口头知情同意

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢

本工作得到了重庆市科学技术委员会的资助（资助编号：cstc2017shmsA130059）。