《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：High-precision apple classification and traceability based on enhanced CBAM for near-infrared spectroscopy
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铁代谢与冻干保存机制研究：以Azospirillum lipoferum Sp59b为例，通过57Fe M?ssbauer光谱分析发现新鲜生物质中21%的Fe2?在冻干后完全氧化为Fe3?，且低温下检测到磁性分裂的Fe3?结构，提示存在类似细菌 ferritin 的储存形式。同步Raman和FTIR光谱证实冻干过程未破坏生物大分子组成，验证了冻干菌体保持休眠活性的可行性，为生物肥料长期保存提供了理论依据。
亚历山大·A·卡姆涅夫（Alexander A. Kamnev）|谢尔盖·S·斯塔尔奇科夫（Sergey S. Starchikov）|尤利娅·A·戴亚特洛娃（Yulia A. Dyatlova）|谢尔盖·A·克利明（Sergey A. Klimin）|弗拉基米尔·A·扎亚哈诺夫（Vladimir A. Zayakhanov）|基里尔·V·弗罗洛夫（Kirill V. Frolov）|伊戈尔·S·柳布廷（Igor S. Lyubutin）|安娜·V·图加罗娃（Anna V. Tugarova）
俄罗斯科学院萨拉托夫联邦科学中心植物与微生物生物化学与生理学研究所生物化学实验室，萨拉托夫410049，俄罗斯联邦
摘要
本研究比较了农业上重要的根瘤菌Azospirillum lipoferum Sp59b（以57FeIII–NTA复合物作为铁源培养）中细胞铁的氧化还原状态，分别在新鲜湿生物质（快速冷冻）和冻干样品中进行57Fe莫斯堡尔光谱分析（测量温度为T = 90?K和4.7?K）。同时使用原位拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术监测了样品的整体生物大分子组成。在新鲜生物质中检测到两种57FeII成分（占总细胞铁含量的21%），这些成分是通过铁的还原吸收产生的；然而在冻干过程中，这些成分完全重新氧化为57FeIII。因此，在T = 90?K时，冻干生物质中仅含有两种57FeIII形式（其莫斯堡尔参数与新鲜生物质中的不同）。在T = 4.7?K时，部分铁(III)表现出典型的六重峰，这是含铁蛋白类细菌的特征。新鲜生物质和冻干生物质的拉曼光谱以及冻干生物质的FTIR光谱显示出相似的主要细胞生物（大）分子成分。这与已知事实相符，即冻干后的细菌仍具有活力（处于休眠状态），这对于干微生物制剂的长期储存非常重要，例如用于生物肥料。
引言
在微生物生物技术的各个领域，冻干（在真空条件下对冷冻生物材料进行干燥）工艺长期以来被用于制备用于保存和长期储存的干微生物制剂[1]、[2]。实际应用表明，当适当储存时，冻干微生物的细胞可以在常温下保持活力（处于代谢不活跃的休眠状态）并能够进行培养[1]、[3]。对于农业生物技术应用而言，这意味着可以长期保存和储存含有促进植物生长的根瘤菌（PGPR，某些具有已知植物刺激特性的土壤细菌）的干制剂作为活性成分[2]、[4]。
然而，长期干燥已被证实会加剧微生物细胞的氧化应激，导致生物分子的氧化损伤。这一过程涉及芬顿化学反应（Fenton chemistry），其中铁(II)化学物质起着重要作用[5]、[6]、[7]。另一方面，许多细菌已知能够在吸收这种氧化还原活性3d过渡金属的过程中将其还原为铁(II)，这对几乎所有自然环境中的生物体来说都是重要的微量元素[8]、[9]、[10]。代谢活跃的细胞可以控制这些过程，即使在细胞内存在大量亚铁离子的情况下也能防止活性氧（ROS）的产生，从而避免对生物分子的氧化损伤[10]、[11]。然而，关于代谢不活跃（休眠）的干燥细胞在长期储存过程中克服氧化应激的能力仍不清楚。
属于PGPR的土壤细菌中，有几个普遍存在的Azospirillum属根瘤菌具有显著的农业生物技术潜力。其中一些已被用作生物肥料的活性成分[4]、[12]、[13]。由于它们的植物刺激作用和农业重要性，Azospirillum属细菌在过去四十年里一直是研究最广泛的细菌之一（参见最近的综述[13]、[14]、[15]、[16]）。尽管如此，它们的微生物学、生物化学和生理学的许多方面仍然不清楚，包括从活细胞状态到休眠状态（如干生物质中的状态）的代谢转变。
几乎所有微生物都需要铁这种关键微量营养素，铁在多种酶和铁储存蛋白中发挥着重要作用[17]。令人惊讶的是，直到最近，关于Azospirillum属细菌的细胞铁含量、代谢和物种形式的现有文献仍然有限（参见[9]、[18]、[19]、[20]、[21]及其中的参考文献）。首次使用透射57Fe莫斯堡尔光谱对Azospirillum菌株的铁吸收和转化进行原位研究[19]，结果显示细菌在从培养基中吸收铁的过程中会积极地将部分铁(III)还原为铁(II)；在对数生长阶段结束时，铁(II)占细胞总铁含量的高达33%。如上所述，这种行为在许多细菌中都很常见[8]、[9]、[11]。进一步的研究[20]、[21]表明，当新鲜生物质通过离心后进行冻干时，干样品中的铁(III)含量显著减少（约3%）。因此，似乎在冻干过程中细胞内积累的铁(II)大部分被重新氧化[21]。众所周知，大量铁(II)的存在对休眠细胞可能是危险的，因为它们会引发类似芬顿反应的过程[5]、[7]、[11]。在代谢不活跃的细胞中，几乎不可能或难以控制由此产生的活性氧的代谢解毒过程或防止其形成。有研究表明[21]，细胞内铁(II)在冻干过程中容易重新氧化为铁(III)，这一现象目前仅在两种Azospirillum菌株中观察到[20]、[21]，这可能是一种自然策略，用于保护干（休眠）状态下的细胞生物大分子成分免受类似芬顿反应的损伤。
为了验证这一假设，本研究使用透射57Fe莫斯堡尔光谱监测了另一种Azospirillum属细菌A. lipoferum Sp59b[22]、[23]从新鲜生物质到冻干物的过程中细胞铁的氧化还原变化。研究还包括了低温测量（从T = 90?K降至T ~ 5?K），以确认是否存在有序的含铁结构。这种现代的高信息量仪器技术允许在快速冷冻的活细胞或冻干生物质中原位研究细胞铁的化学状态[9]。同时使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）[24]、[25]和拉曼光谱[26]监测了新鲜和冻干生物质样品的整体生物大分子组成。
微生物样品的制备和处理
微生物样品的制备和处理
A. lipoferum Sp59b菌株由俄罗斯萨拉托夫IBPPM RAS的根际微生物收藏提供（类型菌株IBPPM 173；访问日期：2025年9月29日）。按照先前的描述[27]进行预培养。然后，在相同的磷酸盐-苹果酸盐培养基上好氧培养至对数生长阶段结束（约18–20小时），之后通过离心分离并用生理盐水（0.85%）洗涤两次。
结果与讨论
在T = 90?K下测量了57FeIII–NTA复合物（储备溶液；见第2.2节）的莫斯堡尔光谱，以监测铁的氧化还原状态（图1）。
从光谱可以看出，储备溶液中的大部分铁（占光谱面积的98%以上，对应于铁(III)成分）确实以高自旋态存在。
结论
冷冻微生物生物质的真空干燥（冻干）工艺长期以来被用于微生物生物技术的各个领域，以获得用于长期储存的干细胞制剂，因为冻干物中的细胞可以保持活力（处于代谢不活跃状态）。然而，长期干燥已被证实会通过芬顿化学反应加剧微生物细胞的氧化应激，其中铁(II)化学物质起着重要作用。
CRediT作者贡献声明
亚历山大·A·卡姆涅夫（Alexander A. Kamnev）：概念构建、方法论设计、验证、数据分析、资源获取、数据管理、初稿撰写、审稿与编辑、项目协调、资金申请。
谢尔盖·S·斯塔尔奇科夫（Sergey S. Starchikov）：方法论设计、数据分析、软件使用、数据管理、可视化、初稿撰写。
尤利娅·A·戴亚特洛娃（Yulia A. Dyatlova）：方法论设计、软件使用、数据分析、可视化。
谢尔盖·A·克利明（Sergey A. Klimin）：方法论设计、软件使用、数据分析、可视化。
弗拉基米尔·A.
伦理批准和参与同意
不适用。
资助
本研究得到了
俄罗斯科学基金会（资助编号：#24–26-00209）的支持。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、文章撰写或决定文章发表。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益/个人关系：亚历山大·A·卡姆涅夫表示获得了俄罗斯科学基金会的财务支持。其他作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本文的主要内容由A.A.K.在第四十四届国际光谱研讨会（CSI XLIV；2025年7月27–31日，德国乌尔姆）的主题演讲中介绍；感谢CSI XLIV组织委员会、国际顾问委员会和国际科学委员会邀请A.A.K.参加此次会议。
此外，还感谢对冻干细菌样品进行FTIR光谱测量的支持。
