用于人类组织中胶原-基因活性相互作用微观空间映射的相关多模态成像技术

《npj Imaging》：Correlative multimodal imaging for microscale spatial mapping of collagen-gene activity interactions in human tissues

　　摘要
理解基因活性与其他生物结构之间的关系对于研究组织重塑过程、疾病和再生至关重要。RNAscope原位杂交检测技术能够实现目标转录本的单分子检测，而无需标记的多光子显微镜则能够对细胞外基质中的胶原蛋白进行高分辨率、定量成像。这两种技术此前尚未结合使用，以在同一组织切片中提取分子特征与结构特征之间的空间相关性。在这里，我们介绍了一种关联的多模态成像方法，将RNAscope与第二谐波生成显微镜相结合，以在微观尺度上将转录本定位与胶原蛋白的定量指标对齐。我们将这种方法应用于健康患者和患有杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy）的患者的骨骼肌活检样本中。通过这种方法，我们观察到，在特定 dystrophin 转录本（靶向外显子 37–42 和 63–75）富集的区域，胶原蛋白纤维的长度和密度有所增加，这表明 dystrophin 转录本的分布与胶原蛋白的组织结构可能存在空间相关性。这种工作流程使得分子数据和结构数据能够在微观尺度上整合。此外，它还可以轻松扩展到不同的组织、目标和疾病背景中，为更深入的空间生物标志物发现、纤维化研究以及基于转录本的疗法对组织形态影响的微观评估提供了一个多功能平台。

引言
基因活性与组织重塑之间的空间关系是组织发育、疾病进展和治疗反应的关键驱动因素。诸如纤维化、癌症侵袭和神经肌肉退化等过程涉及在微观和宏观尺度上转录本动态和组织结构的协调变化，然而这些分子和结构维度很少在同一组织切片中一起进行研究。

RNAscope 原位杂交（ISH）检测技术已成为一种强大的技术，能够在单分子分辨率下检测特定转录本。该技术基于信号放大系统，使用双 Z-靶标探针对，这些探针能够特异性地与目标 RNA 序列杂交，同时将背景噪声降至最低，从而能够在完整的细胞和组织中同时可视化转录本的丰度、定位和完整性。这种方法揭示了转录本的空间定位——无论是在细胞质中、特定细胞器上还是靠近其转录位点——可以通过 RNA 结合蛋白相互作用、局部翻译或 RNA 稳定性等机制影响转录后调控。这些机制表明，转录本的区室化对于设计针对 RNA 的疗法具有重要意义。

与此同时，成像技术已被广泛用于表征胶原蛋白和组织重塑。其中，多光子显微镜（MPM）因其无需标记的成像能力和最小的样本制备要求而受到特别关注。通过利用胶原蛋白和肌球蛋白产生的第二谐波（SHG）以及脂质产生的第三谐波（THG）等内在非线性光学信号，MPM 可以提供关于 ECM 组成和结构的高分辨率、定量信息，而无需染色。由于胶原蛋白、脂肪和肌球蛋白是许多病理过程中的关键结构成分，MPM 已成功应用于从癌症到角膜水肿和神经肌肉疾病等多种情境中，甚至与新的人工智能方法结合使用来评估人类活检样本。

由于其非破坏性特性（使用未染色的组织且操作最少），MPM 非常适合于多模态策略。它与 MALDI 成像和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜等方法的兼容性已经证明了从同一样本中提取互补的分子和结构特征的潜力。然而，虽然基于 SHG 的关联成像策略已成功与蛋白质水平或生化方法（如免疫荧光、MALDI 或振动显微镜）结合使用，但尚未在显微分辨率下直接将单分子 RNA 原位杂交与 MPM 结合在同一组织切片中进行探索。

通过这项研究，我们旨在通过引入一种将 RNAscope ISH 检测技术与无标记 MPM 相结合的互补多模态工作流程来丰富基于 SHG 的成像技术。作为概念验证，我们在受杜氏肌营养不良症影响的骨骼肌活检样本上展示了这种方法，证明了其在临床相关组织中将 RNA 转录本信号与定量胶原蛋白指标对齐的可行性。杜氏肌营养不良症目前无法治愈，大多数患者在第三或第四个十年面临致命并发症。选择这种病理情况是因为其特征是转录本失调，导致功能性 dystrophin 蛋白缺失。dystrophin 的缺失破坏了 dystrophin-糖蛋白复合物的完整性，导致肌膜不稳定、钙稳态紊乱、信号转导异常以及肌肉纤维的反复退化和再生。这些病理事件最终导致慢性炎症和肌肉组织被纤维化和脂肪沉积物替代，表现为进行性肌肉无力、行走能力丧失、心肌病、呼吸功能下降以及由于大脑中缺乏 dystrophin 同源物而导致的神经认知缺陷。在这种情况下，dystrophin 基因转录是一个漫长且严格调控的过程，涉及复杂的剪接机制（如递归剪接和选择性剪接），从而产生多种异构体，包括三种全长变体（Dp427b、Dp427m、Dp427p）以及几种较短的组织特异性异构体（如 Dp260、Dp140、Dp116、Dp71 和 Dp40）。然而，对于 dystrophin 转录本动态（尤其是其空间分布和亚细胞定位）的最新理解仍然有限。

通过结合宏观（全样本）和微观（数十微米）分析，这种灵活的方法能够识别转录本定位与胶原蛋白结构之间的空间相关性，为生物标志物发现和组织重塑研究提供了一个广泛适用的平台。

结果
在这里，我们展示了可以独立使用这两种方法进行的分析，以及对骨骼肌的空间增强分析，这是对我们框架的技术验证，包括将两种技术获得的图像进行关联，并应用所提出的邻近性分析。最后，我们提供了潜在偏差的分析。

**独立的 RNAscope ISH 数据分析**
为了独立于组织形态评估转录本表达，我们首先分析了从 RNAscope ISH 检测获得的明场图像。转录本显示为明显的红色点，可以根据它们的数量和大小进行量化。RNAscope 检测提供了定位的分子信息，可以直接评估转录本的存在和空间分布。图 1 总结了从 RNAscope 图像中得出的两个关键定量指标：每个检测到的转录本相关点的平均面积（以像素为单位），以及每平方毫米的点数，该数值经过样本面积归一化，反映了组织内点的密度。

**图 1：** 在 DMD 和 WT 样本中从 RNAscope 图像中得出的特征的全局量化。A 面板显示了靶向外显子 37–42（绿色）和 63–75（橙色）的探针检测到的点的平均面积（以像素为单位），B 面板报告了每个样本和探针每平方毫米的点数。误差条表示平均值的标准误差（SEM）。

在分析的 DMD 和 WT 样本中，靶向外显子 37–42 的探针主要检测到 Dp427m 异构体，其对应的点比靶向外显子 63–75 的探针（检测到 Dp427m 和 Dp71）的点更大（图 1A）。点面积的差异反映了 RNAscope 信号范围和局部转录本积累的相对变化。尽管 Dp71 通常在成熟的肌肉纤维中不存在，但在肌肉退化和再生过程中仍可能以低水平存在。在每个独立样本中，与 37–42 相关的点的平均面积低于 20 像素，而与 37–42 相关的点超过 24 像素。这些结果证实了先前的发现，表明观察到的信号强度差异可能源于全长 Dp427m 转录本的不同构象，后者可能部分被剪接或富集在核糖核蛋白复合物中。

就每平方毫米的点数而言（图 1B），WT 样本的转录本密度更高，63–75 探针的点数超过 1600 个/平方毫米，而 37–42 探针的点数约为 1100 个/平方毫米。相比之下，所有 DMD 样本的转录本数量都减少，无论使用哪种探针。例如，DMD1 和 DMD2 的点数都少于 300 个/平方毫米。这一观察结果与在肌营养不良骨骼肌中报告的 dystrophin mRNA 表达下调一致。

**独立的多光子显微镜数据分析**
为了独立于转录本表达评估组织结构，我们使用多光子显微镜对骨骼肌切片中的胶原蛋白进行了无标记成像分析。通过利用 SHG 信号，我们特异性地可视化了胶原蛋白纤维并量化了它们的特征和组织结构。这些基于胶原蛋白的图像分析结果如图 2 所示。

**图 2：** 使用基于 SHG 的多光子显微镜评估胶原蛋白结构。A–C 面板显示了三个不同 DMD 受影响肌肉切片的代表性感兴趣区域（ROIs），D 面板显示了 WT 肌肉切片的 ROI。E 显示了每个样本的平均胶原蛋白纤维长度，F 显示了每平方毫米的胶原蛋白纤维数量，该数量经过组织面积归一化。在两个条形图中，数据代表每个样本的两个载玻片的平均值（靶向外显子 37–42 和 63–75）；误差条表示平均值的标准误差（SEM）。

DMD 样本的 SHG 图像（图 2A–C）显示了组织中广泛且异质的胶原蛋白沉积，密集的纤维束穿过多个区域。相比之下，WT 样本（图 2D）的肌肉内胶原蛋白含量极少，分布更为均匀。这种视觉差异反映了 DMD 病理中典型的纤维化重塑。为了量化这些差异，我们计算了每个样本的两个全局指标：平均纤维长度和平均纤维密度（即单位面积的纤维数量）。如图 2E 所示，在这个有限的样本组中，DMD 样本的胶原蛋白纤维比 WT 对照组更长。WT 对照组的平均纤维长度为 19.0 ± 0.5 微米，而 DMD1 的纤维长度超过 22 微米。图 2F 中报告的纤维密度在 DMD 样本中表现出高度变异性。DMD1 的胶原蛋白纤维数量最多（约 1400 条/平方毫米），而 DMD4 的纤维数量接近 WT 对照组（881 ± 88 条/平方毫米）。

由于 RNAscope 不会改变胶原蛋白的形态或干扰 SHG 信号的获取，尽管使用了不同的探针（靶向外显子 37–42 和 63–75），这两个载玻片被认为是可比较的，并一起进行了分析。小的标准误差证实了重复实验之间的一致性，并支持了胶原蛋白定量流程的稳健性。

**配准过程**
配准过程允许 DMD 转录本和胶原蛋白纤维的像素级共定位。图 3 展示了这一过程的代表性示例。在明场图像（图 3A）中，DMD 转录本的信号显示为明显的点。如图 3D 的放大视图所示，信号清晰可辨；然而，由于没有进行特定染色，胶原蛋白结构几乎不可见。实际上，在这种情况下没有使用常用的 Masson’s Trichrome 等染色剂来可视化胶原蛋白。

**图 3：** 来自 DMD 肌肉切片的明场和多光子显微镜图像的配准，这些切片用靶向外显子 37–42 的 RNAscope 探针进行了杂交。A 面板显示了样本的明场扫描，B 显示了通过多光子显微镜获得的相应 SHG 图像，C 显示了两个注册图像的叠加。D–F 面板分别显示了 (A–C) 中红色框内区域的放大视图。每个单独的 DMD 转录本表示为一个明显的红色点（紫色箭头）。样本用 Gill’s Hematoxylin 进行了染色。

**图 3B 的 SHG 图像** 提供了胶原蛋白结构的详细可视化，如图 3E 的放大视图进一步强调。此外，这些图像表明 RNAscope 处理不会影响 SHG 信号的获取，这是证明所提出的多模态关联方法可行性的关键方面。重要的是，由于两种成像技术是依次应用于同一载玻片上且没有中间处理，因此组织变形最小，从而实现了准确和直接的图像配准。数据融合后的最终图像（图 3C）显示了两个图像之间的满意空间对齐。如图 3F 的叠加图所示，感兴趣区域（ROI）很好地共定位，证实了 RNAscope ISH 检测不会干扰 SHG 信号的获取，并且组织结构在整个双成像过程中保持稳定。

**通过结合 RNAscope 和多光子显微镜进行宏观空间分析**
在图像配准之后，将 RNAscope ISH 检测技术与基于 SHG 的多光子显微镜相结合，能够在同一组织切片中实现转录本表达与胶原蛋白微结构的空间相关性。这种方法的主要优势在于它能够在不引入组织伪影的情况下叠加分子和结构特征，因为两种成像技术是依次应用于同一载玻片上，无需中间处理或组织操作。

在图 4 中，我们展示了代表性 DMD 和 WT 组织切片的 RNAscope 信号（白色）和胶原蛋白信号（绿色）的叠加。DMD样本（图4A）显示了广泛分布且无序的肌肉内胶原纤维网络，而WT切片（图4B）则表现出非常有限的肌肉内胶原以及更为区域化的胶原结构。与之前的定量分析结果（图2B）一致，WT切片显示出明显更多的RNAscope阳性点，证实了与我们所分析的DMD样本相比，其转录本含量更高。图4：在叠加了SHG信号（绿色）和报告RNAscope提取点的二值掩膜（白色）后，展示了DMD和WT组织样本的人类骨骼肌切片。A面板显示了一个DMD样本，其胶原结构更为分散和复杂，而B面板则显示了WT样本，其中可见更多的点。全尺寸图像。

除了定性评估外，我们还通过将样本划分为100×100像素的均匀网格来进行定量空间分析。对于每个网格单元，我们计算了从SHG图像中提取的三个与胶原相关的形态学特征（纤维长度、方向和扭曲度）的平均值，以及RNAscope阳性点的密度。这使得能够在整个组织中空间上定位分子和结构指标。图5展示了由此产生的空间图和相关性矩阵。图5：基于网格的DMD骨骼肌中胶原形态和转录本信号分布的宏观分析。图显示了从SHG图像计算出的三个胶原纤维形态学特征的网格图：A为平均纤维长度，B为平均纤维方向，C为平均纤维扭曲度。D面板显示了针对外显子37-42的RNAscope分析得到的探针信号密度网格图，显示了每100×100像素区域内检测到的转录本相关点的数量。E面板展示了Spearman相关性矩阵，显示了整个样本中胶原特征与探针密度之间的单调相关性。黄色和橙色框表示弱到中等的正相关性（ρ<0.4），而白色表示相关性可以忽略不计。

全尺寸图像。胶原纤维长度（图5A）、方向（图5B）和扭曲度（图5C）的地图揭示了DMD样本中的显著异质性。值得注意的是，较长的胶原纤维倾向于形成结构化的束，连接密集的纤维化区域，而较短的纤维则主导较少人口的区域。组织切片的中央部分扭曲度似乎更高，表明存在局部结构扭曲。转录本信号的空间分布（图5D）也显示出区域差异。右上象限显示出高探针密度，而深蓝色区域代表转录本信号最少的区域。这些模式表明组织中的转录本活性不均匀，可能反映了病理重塑或探针可及性的区域差异。

为了探索潜在的空间相关性，我们计算了所有提取参数之间的Spearman相关系数（图5E）。胶原扭曲度与纤维长度（ρ=0.26）和方向（ρ=0.31）显示出低到中等的正相关性，这表明较长、方向更一致的纤维也可能表现出更高的路径不规则性。然而，探针密度与任何胶原特征之间没有显著的单调相关性（|ρ|<0.11），表明在这个宏观尺度上，转录本丰度与胶原结构并没有强烈的共变关系。这些结果表明，尽管宏观图揭示了胶原形态和转录本信号在区域上的有意义变化，但在更小的分辨率下可能存在它们之间的相互关系。因此，可能需要更高分辨率的微观分析来揭示更微妙的空间关系。

微观空间分析：所提出框架的技术验证

虽然宏观分析显示转录本丰度与胶原结构之间的相关性有限，但所提出的多模态成像策略也允许进行更细致的微观尺度研究。我们实施了在方法部分描述的新近邻分析，以评估RNAscope阳性转录本信号与周围胶原特征之间的局部相关性。具体来说，我们（i）比较了DMD和WT样本（图6），以及（ii）研究了不同转录本目标（外显子37-42与63-75）在同一样本内是否显示出不同的空间胶原关联（图7）。对于这两种分析，我们使用了以每个转录本点为中心的同心区域，半径范围从10到100像素（大约对应6.3到63微米）。

图6：围绕转录本信号的胶原特征的微观近邻分析。显示了以RNAscope阳性点为中心的同心圆形区域内检测到的胶原纤维的平均数量，作为半径的函数，针对外显子63-75（A）和37-42（B）。报告了以RNAscope阳性点为距离函数的平均胶原纤维长度，针对外显子63-75（C）和37-42（D）。每条曲线代表一个样本，DMD和WT样本在各个面板中以一致的颜色编码。误差条代表平均值的标准误差（SEM）。分析的半径范围从6.3到63微米。

图7：转录本信号周围的胶原纤维长度的标准化曲线和胶原共定位。A-D面板显示了每个DMD样本中以距离转录本相关点为函数的标准化平均胶原纤维长度，针对外显子63-75（黑色）和37-42（红色）。I面板显示了WT样本的相同指标。数值被标准化到最小半径（6.3微米）的纤维长度，以突出相对衰减曲线。E-H面板报告了每个DMD样本中缺乏周围胶原纤维的转录本相关点的百分比，随着半径的增加而变化。J面板显示了WT样本的相同指标。如果定义的半径内没有检测到胶原纤维，则认为一个点是“孤立的”。这项分析揭示了不同疾病状态和探针目标之间转录本和胶原纤维的空间接近性差异。误差条表示平均值的标准误差（SEM）。

图6展示了这种基于近邻分析的结果。在图6A和B中，我们展示了使用针对外显子63-75和37-42的探针，在距离转录本相关点逐渐增加的距离内发现的胶原纤维的平均数量。正如预期的那样，纤维数量随距离增加而增加，反映了分析区域的扩大。这种增加的速度在所有样本中是一致的。值得注意的是，即使在短距离（例如>15微米）时，DMD1也显示出最高的纤维数量，这与图3F中报告的更高整体胶原纤维密度一致，表明在五个分析样本中纤维化基质更为密集。图6C和D显示了以距离探针信号为函数的平均胶原纤维长度。如之前观察到的（图3E），WT样本的胶原纤维比DMD组织更短。然而，有趣的是，在所有样本和两种探针中，都出现了一个一致的趋势：胶原纤维在靠近RNAscope阳性信号的地方最长，并且随着距离的增加而逐渐变短。这表明所提出的相关方法可以捕捉到一种潜在的微观现象：胶原的组织和发育可能受到局部DMD转录本存在的影响。

为了进一步探索这一观察结果，我们将每个样本中的纤维长度值标准化到它们的最大值（始终在6.3微米），如图7A-7D所示。这种标准化允许更清晰地比较不同距离上纤维长度减少的斜率。在所有样本中都观察到了逐渐减少的趋势，其中37-42探针的减少最为明显，特别是在DMD3中。这种更陡峭的斜率表明Dp427m转录本周围的胶原结构具有更大的局部异质性。在图7E-H和J中，我们分析了随着邻域半径增加而缺乏附近胶原纤维的转录本相关点的百分比。DMD1和DMD2的特征是整体纤维密度较高（图3F），显示出即使在30微米半径内，也有不到10%的点缺乏附近的胶原纤维。相反，DMD3、DMD4和WT样本显示出更高比例的DMD转录本信号（即点）没有相邻的纤维，特别是在小半径处。值得注意的是，在WT样本中，超过20%的转录本点在60微米半径内缺乏胶原纤维，表明在这个样本中转录本信号与胶原之间的空间相关性更远。

在比较单个样本内的探针时，在DMD组织中，与37-42探针相关的胶原纤维似乎更接近转录本信号，而与63-75探针相关的胶原纤维则相反。相比之下，WT组织显示出相反的趋势，胶原与37-42探针的关联更为紧密。这种差异可能反映了探针检测到的转录本区域的定位差异。尽管探针重叠阻止了在此特定研究中区分异构体，但如果目标不重叠，这种方法可以揭示异构体特定的模式。这种空间模式可以在更大的队列中进行探索，以评估其生物学相关性。

总体而言，这种基于近邻的微观分析表明，所提出的框架可以量化转录本定位与组织结构之间的微观空间关系，捕捉到单个切片内的潜在不同微环境。

为了评估观察到的胶原纤维长度与RNAscope阳性转录本点之间的近邻依赖性趋势是否可能源于几何采样偏差，我们实施了一个零模型控制。对于每个组织样本，随机化了5000个转录本点的位置。然后使用这些随机分布重复了近邻分析，以在完全的空间随机性下建立基线期望。在图8A-E中，我们将每个样本获得的标准化纤维长度与随机基线分析进行了比较。实验近邻曲线的斜率大于考虑随机点时获得的斜率。这表明，尽管几何偏差对近邻信号有一定影响，但观察到的转录本点与较长胶原纤维之间的关联不能完全由随机空间放置解释，很可能反映了真实的联系。

图8：使用随机转录本点分布和受控扰动来评估几何和算法偏差。A-E面板报告了每个样本中以距离RNAscope阳性转录本点为函数的标准化胶原纤维长度。对于每个面板，使用实验观察到的针对外显子37-42和63-75的探针获得的曲线与其相应的随机基线进行了比较。实验观察到的曲线显示出更陡的斜率。F面板显示了不同γ校正下的平均胶原纤维长度（左绿色框：γ=0.70，中间橙色框：γ=0.75，对应于图3E的数据，右蓝色框：γ=0.80）。

虽然随机转录本点分析表明仅几何采样偏差不能解释观察到的近邻依赖性趋势，但我们还评估了纤维分割过程本身是否可能引入算法偏差。为此，我们通过进行敏感性分析来评估所利用网络的稳定性。特别是，在基于深度学习的分割之前，我们稍微修改了图像预处理参数，考虑了两个额外的γ校正（0.70和0.80）。这些参数略微改变了SHG信号，这是网络用于分割胶原结构的信息。我们在图8F中报告了这一测试的结果，显示在这些扰动存在的情况下，关于绝对纤维长度值的轻微差异约为1微米。然而，通过比较不同样本上的估计值，获得的一般趋势得到了保留。

讨论

在这项研究中，我们提出了一个相关的多模态成像框架，它结合了基于RNAscope的原位杂交和无标记多光子SHG显微镜技术，以研究转录本定位与胶原形态之间的潜在空间相关性。通过在同一完整组织切片中实现分子和结构特征的像素级对齐，该平台为高分辨率的相关性分析在空间生物学中建立了一种新的方法论方法。这种方法的优势在于它能够在不同空间尺度上探究分子-结构相关性。在宏观尺度上，转录本丰度和胶原形态似乎基本上是独立的，反映了肌肉组织的异质性和复杂性，这在临床研究中已经得到证实。然而，在微观尺度上，我们的近邻分析表明，在对照和疾病组织中，较长的胶原纤维都靠近RNAscope阳性转录本信号。如果没有所提出的多模态整合，这种相关性将无法被检测到。这强调了一个核心信息：大规模平均值可能隐藏了生物学上有意义的微观依赖性，只有通过细胞和亚细胞分辨率的相关成像才能揭示这些依赖性。

将这一概念应用于DMD展示了这种方法的未来生物学相关性，因为纤维化和转录本失调是该疾病的定义特征。重要的是，当比较针对DMD基因不同区域的探针时，出现了异构体特定的差异，表明不同的转录本变体可能与不同的胶原微观结构模式相关。能够在空间上分辨异构体特定的重塑特征，突出了该方法在生理和病理背景下解析转录本多样性的潜力。尽管样本量有限，我们的概念验证依赖于人类患者活检，而不是动物模型或细胞系统。这不仅强调了该技术平台的转化潜力，还展示了其在临床相关材料中的稳健性，在这些材料中，样本的可用性和完整性往往限制了多模态成像策略的应用。尽管这里应用于骨骼肌，但该平台的更广泛影响涵盖了生物医学研究领域。纤维化和细胞外基质（ECM）的重塑是癌症进展、慢性炎症、心血管病理和器官再生的基础。能够将局部转录相关性与其它结构的形态特征映射起来，为生物标志物的发现和患者分层提供了新的机会，暗示了可能存在具有不同组织结构或治疗反应的潜在亚型。此外，该方法与先进的技术模式（如光片成像或透明组织多光子成像）以及无标记的多参数方法（如SLAM（同时无标记自荧光多谐波）显微镜方法）兼容，后者结合了自荧光、二次谐波（SHG）和三次谐波（THG）信号。整合这些技术将能够更全面地描述细胞和细胞外成分与基因表达之间的关系。结合人工智能进行自动特征提取，进一步扩展了其转化潜力，使得临床活检的高通量分析成为可能。

这项研究存在一些局限性：它基于一个小样本队列，反映了这项工作的概念验证性质。转录相关的空间观察结果并未被视为独立的重复实验，而是在样本层面进行了平均处理，以保持生物学上的独立性。未来的研究需要更大的样本队列，以得出明确的生物学结论。这项研究的目的是为了展示该相关分析平台的可行性和能力，而不是为了建立最终的临床见解。未来需要对更大的患者队列进行纵向采样，并包括多种疾病模型，以验证和推广观察到的空间模式。此外，将这种方法扩展到胶原蛋白以外的其他ECM成分、脂质或细胞内蛋白质，可能会提供更全面的组织重塑动态图谱。另一个局限性是，RNAcope阳性转录本的核定位与细胞质定位没有明确区分。因此，观察到的空间关联不能归因于特定的亚细胞转录状态，例如活跃的转录与成熟的mRNA定位。未来的框架扩展可以纳入核分割（例如，使用免疫荧光核标记），按亚细胞区室对转录信号进行分层，并研究核转录本或细胞质转录本是否与胶原蛋白的形态特征表现出不同的空间关系。尽管RNAcope探针被设计为优先靶向与特定异构体相关的区域，但部分序列重叠限制了异构体的独家检测。尽管如此，改进探针设计或与其他技术结合使用，可以实现对异构体特异性分布的直接可视化，为探索 dystrophin 转录本的空间生物学提供了强有力的途径。同样，未来将细胞类型分辨策略纳入该框架将增强生物学解释能力。例如，使用免疫荧光标记物来标记成纤维细胞和肌源性细胞，或整合多重空间转录组学方法，将能够将转录信号归因于特定的细胞类型。这将有助于区分由产生 ECM 的成纤维细胞表达的转录本和来自邻近肌肉纤维或炎症细胞的转录本，从而明确观察到的空间关联是直接由细胞贡献还是由旁分泌微环境效应引起的。

从算法角度来看，尽管证明了胶原蛋白纤维分割的稳定性，但通过对手动注释的 SHG 信号进行微调（考虑胶原纤维稀疏和密集的区域），可以提高所用神经网络的可靠性。通过将 RNAscope ISH 测定与多光子显微镜相结合，我们建立了一个强大而灵活的平台，实现了转录活性检测和结构成像之间的桥梁。这种相关方法揭示了转录本定位与胶原蛋白结构之间以前无法访问的微观关系，为空间生物学开辟了新的范式。除了神经肌肉疾病外，该方法还广泛适用于各种组织和病理学，为发现空间分辨的生物标志物、了解局部纤维化发展和组织再生提供了独特的机会，并能够更全面地评估治疗干预对组织中转录动态的影响。

从 SHG 成像的角度来看，胶原蛋白的微观结构可以通过计算更广泛的定量参数来描述，而不仅仅是纤维长度、方向和扭曲度。实际上，基于信号强度的指标、各向异性或一致性指数、前后（F/B）SHG 比值以及偏振分辨测量提供了关于纤维排列、方向分散、分子有序性和胶原蛋白成熟度的补充信息。为了证明我们相关多模态框架的可行性，我们使用的最小特征集（纤维长度、方向和扭曲度）足以揭示批量分析中不存在的空间趋势，突显了所提出的相关成像工作流程所实现的基于邻近性的查询的附加价值。当前的方法完全兼容于整合这些额外的 SHG 相关特征，从而能够更全面和机制性地描述与转录本定位相关的胶原蛋白表型。

因此，这项工作提出了一个多功能的技术基础，用于探究基因活性与组织结构之间的相互作用。其可扩展性、与先进成像和计算工具的兼容性，以及在不同疾病和生物结构中的适用性，使其成为推进基础研究和临床转化的有前景的技术。

方法
为了清晰地概述我们提出的方法论，我们在图 9A 中总结了从组织提取到图像分析的整个成像流程。简而言之，我们从 4 名携带不同突变的 DMD 患者和 1 名健康对照受试者（野生型：WT）那里收集了胫骨前肌活检样本。在安装好的载玻片上，我们进行了 RNAscope ISH 测定，使用两种不同的探针来定位组织中的 DMD 转录本，这两种探针分别针对外显子 37–42 和外显子 63–75，拦截不同的 dystrophin 异构体。针对外显子 37–42 的探针可以检测全长转录本 Dp427m，而另一种探针也能检测到较短的异构体 Dp71，导致探针目标区域之间存在部分重叠。这些 dystrophin 转录本仅在肌肉中表达，并且在没有同时使用的细胞类型特异性标记的情况下被检测到。因此，无法明确它们的细胞来源，观察到的 RNAscope 信号与胶原蛋白特征之间的空间邻近性不应被解释为转录本-ECM 机制耦合的直接证据。我们使用明场显微镜和 MPM 对每个样本进行了成像，以获得两个全切片图像。这些图像进行了空间配准，以确保精确对齐。明场图像用于检测和定位转录本点，而 MPM 图像则用于提取单个胶原纤维的形态特征。

图 9：提出的工作流程和概念框架示意图。
在人类骨骼肌活检样本上进行了针对外显子 37–42 和外显子 63–75 的 RNAscope ISH 测定。每个载玻片被成像两次：首先使用明场显微镜检测 RNAscope 信号，然后使用 MPM 获取来自胶原蛋白的无标记 SHG 信号。随后对结果图像对进行了配准，以实现像素级别的对应。最后，我们进行了基于邻近性的空间分析，以研究局部胶原结构是否因转录本信号的存在而有所不同，从而能够在组织内进行分子-结构相关性的微观评估。B 在这个概念框架中，绿色面板显示了本研究中当前实施的技术组件（技术成果），以及从分析中得出的相应推断（推断成果）。橙色面板突出了可以纳入框架的扩展内容，而红色面板展示了这些未来扩展可能实现的新的生物学研究和见解类别。

然后使用基于邻近性的方法进行了微观空间分析：对于每个转录本信号，定义了围绕它的同心区域，以量化距离转录本位置的胶原特征。这使我们能够评估局部胶原结构的变化是否与转录本的存在相关。在接下来的部分中，我们将更详细地描述流程的每个步骤。

为了为所提出的方法提供更广泛的概念背景，我们在图 9B 中引入了一个概念框架示意图。绿色框显示了在此概念验证中实现的模块，将流程的纯技术组件（技术成果）与当前开发状态下可以得出的生物学见解（推断成果）分开。黄色模块展示了可以纳入框架的潜在扩展，包括额外的分子读数、成像对比度或分析策略，这些在本文中未探讨，但在技术上与所提出的方法兼容。红色模块强调了这些扩展可能解锁的更广泛的生物学问题类别，强调了该框架的模块化和可扩展性，超出了本文中呈现的具体技术验证。

招募的受试者
在获得知情同意后，从四名 DMD 患者和一名健康捐赠者那里收集了胫骨前肌活检样本，用于研究目的。所有实验方案均获得了费拉拉大学的伦理批准，批准号为 841/2020/Sper/AOUFe，符合赫尔辛基宣言。招募的个体列在表 1 中。

表 1 招募的受试者列表

RNAscope 测定
使用 RNAscope 2.5 HD Reagent 进行了 ISH 测定（Red (ACDbio)）。Polr2A（RNA 聚合酶 II 亚基 A）被用作阳性对照探针，而 DapB（4-羟基-四氢二吡啶酸还原酶）被用作阴性探针。使用了两种独立的针对 DMD 转录本的探针：
- Probe Hs-DMD-Dp427m-E37-E42 包含 15 个 Z 对，靶向 NM_004006 中的 5400 到 6361 个核苷酸（对应于外显子 37–42 区域）。
- Probe Hs-DMD 包含 20 个 Z 对，靶向 NM_004006 中的 9511 到 10,902 个核苷酸（对应于外显子 63–75 区域）。RNAscope 测定按照制造商的说明进行，并进行了以下优化以提高信号的特异性：(i) 在脱蜡步骤后，将 FFPE 载玻片在 60°C 下孵育 30 分钟；(ii) 进行 10 分钟的目标回收步骤；(iii) 用 Amp 5 在 FFPE 载玻片上孵育 60 分钟；(iv) 使用 Protease Plus 进行预处理蛋白酶消化。

多光子和明场显微镜
使用 upright TriM Scope II 多光子显微镜（Miltenyi Biotech，Bielefeld，德国）获取了人类骨骼肌样本组织切片的 SHG 信号图像。激发由可调谐的飞秒激光器（Cronus 2 P，Light Conversion，Vilnius，立陶宛）提供，脉冲持续时间 <160 fs，在 680–960 nm 范围内操作（第一个输出通道，最大功率 1 W）。激光器调谐至 810 nm，并以 10% 的输出功率操作，使得样品平面上的入射功率为 13 mW，用于 SHG 激发。图像使用 Zeiss W Plan-Apochromat 20× 水浸物镜（NA 1.0）获取。后向散射发射通过两个长通二向色镜（截止波长：560 nm 和 495 nm；Semrock）传输，并由光电倍增管（PMTs；H6780-01-LV，Hamamatsu，Herrsching am Ammersee，德国）和 GaAsP 探测器（H7422-40-LV，Hamamatsu）检测。前向散射的 SHG 信号由位于载物台下方的单独 PMT 收集，使用 1.4 NA 的聚光透镜进行聚焦。前向和后向 SHG 发射都通过 405 ± 10 nm 的带通滤光片（BrightLine HD 滤光片，Semrock；AHF Analysentechnik，Tübingen，德国）过滤。

图像分析使用前向散射的 SHG 进行。整个组织切片被成像为二维马赛克。每个瓦片覆盖 512 × 512 像素的区域，像素停留时间为 1.63 μs，分辨率为 0.63 μm。图像采集包括 2× 线平均和相邻瓦片之间的 15% 重叠。马赛克拼接使用 IMARIS 软件（Oxford Instruments）完成。

用于转录本信号检测的明场图像使用配备 10× 物镜（NA = 0.3，工作距离 = 16 mm）的 Nikon Eclipse Ti2 显微镜获取。

图像配准
对于每个样本，使用基于 SimpleITK 库构建的定制 Python 基础的配准流程，对明场和多光子显微镜的图像进行了空间对齐。这一步确保了转录本检测（光传输扫描）和胶原形态（SHG 信号）之间的像素级对应。我们在“配准过程”部分报告了结果。

图像的独立处理和量化
一旦明场和多光子图像被准确配准，它们就被独立分析以提取特定信息，尽管我们展示了当综合考虑时它们的解释能力显著增强。在明场图像中，关键信息对应于转录本特异性 RNAscope 信号的定位，这些信号表现为离散的红色点。由于这种由红色和蓝色通道组合产生的着色是图像中唯一具有这种颜色轮廓的结构，我们实现了一个简单的阈值算法来分割转录本信号。具体来说，我们使用 RGB 图像通道计算了像素级比率图，定义为 G / (R + B)，其中分母中添加了一个小的 epsilon 值 0.001 以防止除以零。比率低于 0.4 的像素被分类为候选探针点。随后，从这个经过阈值处理的图像中生成了一个二值掩膜，并将连接的圆形组件识别为单独的转录信号。对于每个点，我们使用基于区域的形态学操作提取了包括质心位置和面积在内的形态学特征。检测到的RNAscope阳性点根据其质心位置被视为空间点特征。点面积被用作RNAscope信号范围的半定量描述符，并不直接表示绝对转录本丰度。在当前分析中，没有区分核转录本和细胞质转录本的定位，也没有考虑亚细胞区室化。本研究的统计分析单位是单个生物样本（患者活检）。为了避免伪重复，所有图表中报告的胶原指标都是对每个样本内所有以转录本为中心的区域进行平均得到的，所有报告的邻近性剖面都代表样本级别的聚合数据。没有在样本之间进行点级别的统计推断。

对于多光子图像，我们专注于量化胶原的结构特性。在对SHG信号应用了0.75的γ校正和2×2的中值滤波后，使用了一个预训练的变分自编码器来分割和骨架化胶原纤维。每个被识别的纤维都被赋予了一个唯一的ID，使我们能够单独跟踪和分析它们。基于得到的分割结果，我们生成了派生图，其中骨架化纤维的每个像素都被标记了相应的形态学属性值。对于每根纤维，计算了三个主要的结构特征：（i）长度，通过沿骨架路径的像素距离总和计算得出，对角线步长加权为2的平方根，轴向步长加权为1；（ii）方向，计算为纤维主轴起点和终点之间的角度，范围限制在[0, π]之间；（iii）迂曲度，定义为实际（曲线）长度与端点之间的直线欧几里得距离之比。

为了研究与转录本相关的探针信号的空间邻近性与胶原形态的局部差异是否相关，我们开发了一个基于邻近性的分析框架。对于每个样本，所有从明场图像掩膜中分割出来的点（如“独立图像处理和量化”部分所述）被用作参考点。在每个点的质心周围，我们定义了一系列半径逐渐增加的同心圆形区域，范围从10到100像素（大约对应6.3到63微米）。对于每个半径，我们计算了位于该区域内的胶原纤维的形态学特性（长度、方向和迂曲度）的平均值。然后，这些平均值在每个样本内的所有与探针相关的区域中进行了平均。每个半径的平均值及其标准误差（SEM）被绘制出来，以便识别与转录本定位相关的胶原微结构的潜在空间趋势和差异。

处理和分析是在一台配备有AMD Ryzen 9 5900×12核处理器、128 GB RAM和12 GB专用内存的NVIDIA GeForce RTX 3080 GPU的台式工作站上进行的。图像生成使用了Fiji软件，这是一个专为生物成像设计的ImageJ包。图表和图形使用OriginPro 2025a（OriginLab Corporation）创建。自定义的Python脚本被开发并执行用于图像配准、分割和特征提取。