通过CRISPR/Cas9技术在β-酪蛋白基因位点上实现人类促红细胞生成素的靶向插入，使得HC11乳腺上皮细胞能够对乳生成激素产生反应性表达

《Scientific Reports》：CRISPR/Cas9-mediated targeted knock-in of human erythropoietin at the β-casein locus results in lactogenic hormone-responsive expression in HC11 mammary epithelial cells

　　

摘要

精确的基因组整合策略对于实现稳定且可调控的转基因表达至关重要。在本研究中，我们建立了一种基于CRISPR/Cas9的靶向敲入系统，将人促红细胞生成素（hEPO）基因整合到HC11乳腺上皮细胞中小鼠β-酪蛋白基因座的天然调控区域。我们设计了一种携带hEPO的供体载体，通过同源定向修复将其成功引入β-酪蛋白基因座中。随后分离出杂合的单细胞敲入克隆，并通过基因组分析对其进行了验证。在乳汁生成激素的刺激下，整合后的hEPO转基因表现出对激素的反应性表达，其蛋白质水平相比未受刺激时增加了约20倍。为了便于后续的纯化与活性检测，我们采用了带有GST标签的hEPO构建体。该融合蛋白首先通过谷胱甘肽亲和层析法进行纯化，然后再通过蛋白酶水解得到重组hEPO。纯化的蛋白具有可测量的生物活性，其比活性为53.4 mIU/μg。这些研究结果表明，在β-酪蛋白基因座进行靶向整合后，乳腺上皮细胞中的天然调控元件能够驱动对乳汁生成激素的反应性表达。这一方法为构建可控的基因表达平台提供了可能，可应用于治疗性蛋白研究中的激素诱导表达系统。