首个针对禽腺病毒11型诊断的特异性实时PCR TaqMan检测方法的开发

《Avian Pathology》：Development of the First specific Real-Time PCR TaqMan Assay for Fowl Adenovirus serotype 11 diagnosis.

　　摘要
禽腺病毒11型（FAdV-11）是家禽领域的主要病原体，与包涵体肝炎（IBH）相关，并在全球家禽产业中造成重大经济损失。本研究介绍了基于TaqMan探针的首个特异性实时PCR检测方法的开发与验证，该方法能够在一个反应中同时实现FAdV-11的检测、定量和基因分型。使用Geneious Prime软件设计了针对FAdV-11 Fiber基因片段的引物和探针。通过参考菌株进行了敏感性、线性、重复性、再现性和特异性等验证步骤，以评估该检测方法的分析性能。该检测方法表现出优异的线性（R2 = 0.995）和10拷贝/μl的分析灵敏度，能够特异性扩增FAdV-11而不与其他FAdV血清型或其他禽类病原体发生交叉反应，且检测时间仅需31分钟。检测结果的变异系数低于0.38%（实验间）和0.25%（实验内）。在从IBH临床病例中收集的样本上验证了该方法的临床性能，结果显示其与测序结果完全一致。此外，该检测方法的灵敏度是传统cPCR方法的十倍。进一步比较发现，特异性实时TaqMan PCR检测方法与通用实时PCR/52K检测方法具有高度相关性（R2 = 0.98），证实了其良好的分析性能。通过在一个反应中完成FAdV-11的检测、定量和基因分型，该方法为有效应对家禽产业中的FAdV-11疫情提供了完整的工具。

关键词：FAdV 11型；IBH；实时PCR；TaqMan探针；Fiber基因；基因分型

免责声明
作为对作者和研究人员的服务，我们提供了已接受的手稿版本（AM）。在最终出版版本（VoR）之前，将对该手稿进行编辑、排版和审稿。在生产和预印过程中可能会发现影响内容的错误，所有适用于期刊的法律免责声明也适用于这些版本。

引言
禽腺病毒（FAdVs）属于腺病毒科（Adenoviridae）和禽腺病毒属（Aviadenovirus），包含具有共同抗原的禽类腺病毒。FAdV感染在家禽群体中广泛存在（Kiss等人，2021年）。迄今为止，通过限制性内切酶的基因组分析已鉴定出五种FAdV物种（FAdV-A至FAdV-E），而病毒中和（VN）测试则确定了12个血清型（1-7、8a、8b、9-11）（Hess，2000年）。尽管大多数FAdV感染是亚临床的，但某些血清型与严重的禽类疾病相关，包括包涵体肝炎（IBH）（Abghour等人，2019年；Alvarado等人，2007年）、腺病毒性腺胃糜烂（AGE）（Domanska-Blicharz等人，2011年；Schachner等人，2018年）、胰腺坏死（Nakamura等人，2002年）和肝炎-心包积液综合征（HHS）（Zhang等人，2016年）。IBH是一种主要影响3至7周龄肉鸡的急性疾病，由FAdV-D和FAdV-E物种引起（Kiss等人，2021年；Schachner等人，2018年）。该疾病已在多个国家报道（Alzuheir等人，2021年；Chitradevi等人，2021年；Joubert等人，2014年；Nakamura等人，2011年；Ojki?等人，2008年；Oliver-Ferrando等人，2017年；Zhang等人，2016年），凸显了其在家禽产业中的普遍性和影响。在摩洛哥，2018年首次对2016-2017年间四个地区的FAdV病例进行了特征分析，累积死亡率为14.22%至21.28%（Redondo等人，2018年）。在五个测序分离株中，四个被鉴定为11型，一个为8a型。2019年，对2015-2016年摩洛哥暴发株的六邻体基因进行了系统发育分析，确认分离的FAdV株属于11型（Abghour等人，2019年）。传统上，通过电子显微镜分离病毒后进行诊断。然而，这种方法耗时且需要新鲜样本以确保病毒活性（Asthana等人，2013年）。对于血清型鉴定，常规PCR结合限制性片段长度多态性（RFLP）或六邻体基因L1环区域的测序，随后将扩增子序列与GenBank数据进行比较，已成为FAdV基因分型的金标准方法（Chitradevi等人，2021年；Ojki?等人，2008年；Raue & Hess，1998年）。这些分子技术已基本取代了传统的血清学方法，如VN测试，克服了灵敏度低和血清型间交叉反应的局限性。此外，还开发了针对特定FAdV血清型的特异性实时PCR检测方法，用于快速诊断相关疾病（Wang等人，2017年；Ugwu等人，2023年；Niczyporuk & Czekaj，2018年）。这些方法大大提高了对禽类群体中疫情的反应效率和疾病管理能力。但目前尚无针对广泛与IBH相关的FAdV-11的实时PCR检测方法。本研究旨在开发一种针对FAdV-11的TaqMan实时PCR方法，能够在单个反应中实现检测、定量和基因分型，从而更好地管理家禽中的FAdV-11感染。

材料与方法
1. 参考FAdV菌株
参考菌株（表1）从Avian Vaccine Service AVSBio（美国威斯康星州）获得，为冻干病毒库存，并根据美国分类系统进行分类。表1还列出了每个接收菌株在国际病毒分类委员会（ICTV）分类系统中的对应关系。每个菌株通过加入超纯分子水重新配制，然后分装到200 μL的试管中并储存在-80°C。表1：本研究中使用的标准FAdV菌株。

2. 临床样本采集
样本根据Abghour等人（2019年）（Ouchhour等人，2025年）描述的方案，从疑似患有包涵体肝炎（IBH）的商业肉鸡群和蛋鸡群中无菌采集。详细病例信息包括分离年份、地理位置、年龄和鸡的品种，见表1。所有样本均置于无菌袋中并储存在-80°C直至进一步处理。将组织匀浆后在4°C下以2000×g离心10分钟，所得上清液用于病毒DNA提取。

3. 病毒DNA的制备
病毒DNA由Hassan II农业与兽医研究所制备。所涉及的病毒包括禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）和传染性喉气管炎病毒（ILTV）。本研究中使用的AIV为田间分离株（A/Broilers/Rabat/Ch24/2024 (H9N2)，GenBank登录号为PV265474.1，来自2024年摩洛哥拉巴特地区出现呼吸症状的肉鸡。NDV为常用疫苗株LaSota，用于全球的疫苗接种和挑战研究。IBV为田间分离株（IBV47/2013/Morocco，GenBank登录号为MF156218.1），此前已在摩洛哥家禽群中进行了特征分析。ILTV使用的疫苗株为A20（例如Poulvac Laryngo A20，Zoetis），作为标准实验室参考株用于检测方法验证。

4. 伦理声明
本研究中使用的组织样本来自自然死亡的临床患病肉鸡和蛋鸡。实验过程符合摩洛哥关于实验动物护理和使用的法规，以及动物伦理委员会（CESASPV）批准的动物实验方案，并符合众多科学参考文献和世界动物卫生组织（WOAH）手册（2024年）中的国际标准。

5. 病毒DNA提取
FAdV参考菌株的DNA使用MagPurix EVO自动化核酸纯化系统（Zinexts，台湾）和MagPurix?病毒/病原体核酸提取试剂盒按照制造商的方案提取。田间样本则使用Kylt? RNA/DNA纯化试剂盒（Hoeltinghausen，德国）提取。

6. 常规PCR和测序
从田间样本中提取的DNA使用通用引物HEXON A/HEXON B进行扩增。这些引物针对六邻体基因，产生约897 bp的扩增子（Meulemans等人，2001年）。扩增使用DreamTaq Green PCR Master Mix（2X）试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）进行。45 μL的反应混合物包含5 μL的DNA样本、25 μL的Master Mix、每种引物各2 μL（10 μM），体积补足至20 μL。常规PCR的热循环条件为：初始变性95°C 5分钟，随后45个循环：95°C变性30秒、62°C退火30秒、72°C延伸1分钟，最后72°C延伸10分钟。六邻体基因的扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳在Tris-borate-EDTA缓冲液中分离，并用溴化乙锭染色（Promega，美国麦迪逊）。阳性样本经过纯化、测序，并使用NCBI的BLAST工具与GenBank中的序列进行比对。本研究中仅使用11型菌株来验证检测方法的临床性能。

7. 实时PCR
实时PCR（qPCR）在QuantStudio 5实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，美国）上进行，遵循Günes等人（2012年）的方案。每个反应包含5 μL的DNA和15 μL的反应混合物，其中含有10 μL的SensiFAST SYBR Lo-Rox试剂盒（Bioline，纽约），包括Taq DNA聚合酶、SYBR Green I和脱氧核苷三磷酸混合物，以及每种引物各0.8 μL（52K-fw/52K-rv，10 μM）。

8. 引物和探针设计
从NCBI数据库下载了12种FAdV血清型的完整基因组以及国际收集的FAdV-11纤维基因。补充表1列出了本研究中使用的FAdV的GenBank登录号。使用Geneious v.4软件中的ClustalW算法进行序列比对。然后选择FAdV-11纤维基因中的一个特定区域进行引物和探针设计，使用Primer3软件完成。使用BLAST工具评估引物和探针的特异性。此外，使用OligoAnalyzer工具评估了二级结构（如发夹结构、同二聚体和异二聚体）的缺失。引物参数如熔解温度（Tm）和GC含量（%GC）使用NEB Tm Calculator确定。引物和探针由Sigma-Aldrich合成。

9. 特异性实时/FAdV-11 PCR检测方法的优化和标准曲线
为了优化PCR反应，测试了不同浓度的引物（范围0.8至0.4 μM）和探针（范围0.15至0.5 μM），在含有10 μL 2X Luna Universal Probe qPCR Master Mix（New England Biolabs，美国）、5 μL DNA和2.29 μL无核酸酶水的反应混合物中（总体积20 μL）。然后在LightCycler z 480实时PCR系统（Roche Diagnostics，美国）上进行检测。FAdV-11的定量采用以下热循环方案：初始变性95°C 1分钟，随后40个循环：95°C变性15秒、60°C退火30秒、延伸72°C 1分钟，最后72°C延伸10分钟。使用含有10^6拷贝/μl的阳性对照生成标准曲线，采用FAdV-11 DNA的1:10稀释系列。所有稀释液同时进行分析，结果使用LightCycler软件（版本1.5.0）处理。

10. 交叉和内部特异性测试
通过在一个反应中包含所有12种FAdV血清型的参考菌株来评估检测方法的内部特异性。在其他常见禽类病原体（包括禽流感病毒（H9N2）、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒（ILTV）存在的情况下评估了外部特异性。

11. 灵敏度测试
使用一系列FAdV-11 DNA稀释液（浓度范围10^6至5拷贝/μl）确定检测方法的灵敏度。每个稀释液重复三次进行特异性实时/FAdV-11 PCR检测，以确定最低可靠检测浓度。

12. 重复性和再现性
通过在一日内多次（5至9次）对不同病毒DNA载量（范围10至10^6拷贝）进行检测来评估特异性实时/FAdV-11 PCR检测的重复性（实验内）。通过在连续三天内重复三次测量来评估再现性（实验间）。

13. 数据分析
数据最初转换为对数尺度以确保结果的线性。为了将我们特定的实时/FAdV-11 PCR检测方法与参考测试进行比较，进行了回归分析，并使用Spearman相关系数（r）计算了相关系数。III. 结果 1. 引物、探针和优化 使用Geneious软件中的ClustalW算法对十二种参考FAdV菌株的完整基因组以及与血清型11的野外菌株相对应的纤维基因的核苷酸序列进行了比对。比对结果确定了一个特定于血清型11的区域，随后该区域被选为引物和探针设计的模板。本研究中使用的指定引物和探针的序列以及其他引物的序列列在表2中。表2：本研究中使用的引物和探针的序列。下载CSV显示表格 为了优化特定的实时/FAdV-11 PCR检测方法，同时测试了不同浓度的引物和探针。总共评估了九种引物浓度组合（范围从0.4到0.8 μM）和探针浓度组合（范围从0.15到0.5 μM），总反应体积为20 μL。选择了产生最强荧光信号和最低循环阈值（ct）的最佳浓度组合（图2）。这种组合对应于每个引物0.8 μM和探针0.4 μM，用于后续实验。图1：比对结果以及引物和探针在FAdV-11纤维基因上的位置。显示全尺寸 图2：不同引物和探针浓度组合的扩增曲线。选择显示最高荧光率的曲线作为最佳浓度组合。显示全尺寸 2. 检测方法的分析性能 2.1 标准曲线 使用从10到10^6拷贝/μl的六种稀释度面板进行了检测方法的线性评估，每种浓度测试了三次。计算出的平均病毒载量从1.43到6.46拷贝/μl不等。根据每个浓度获得了平均Ct值，并用其建立了标准曲线（图4a）。标准曲线显示，在10-10^6拷贝/μl的范围内，检测方法是线性的（图3），回归系数（R2）值为0.994，扩增效率为99%。图3：特定实时/FAdV-11 PCR检测方法的线性。显示全尺寸 2.2 线性测试 对比特定实时/FAdV-11 PCR检测方法测得的浓度与标称浓度（表4b）之间的回归分析显示，回归系数为0.990（图4）。这个值表明标称浓度和测量浓度之间存在强相关性，证实了我们的检测方法在整个稀释范围内的准确性和可靠性。图4：a. 特定实时/FAdV-11 PCR检测方法的标准曲线，显示Ct值与质粒浓度（10到10^6拷贝/μl）之间的关系。b. 特定实时/FAdV-11 PCR检测方法的线性。显示全尺寸 表3：测试优化结果。该表列出了每种引物和探针组合获得的Ct值。下载CSV显示表格 表4：特定实时/FAdV-11 PCR检测方法的线性测量系列。该表表示标称浓度、平均Ct值（三次重复的平均值）以及我们的检测方法对每个浓度获得的测量值。下载CSV显示表格 2.3 检测限 对从10到10^6拷贝/μl的一系列稀释度进行了测试，以确定我们检测方法的检测限。最低浓度的检测准确度（置信水平≥95%）估计为10拷贝/μL（图5a）。对于常规PCR，使用HexonA/HexonB引物测试了从10到10^5拷贝/μl的稀释度系列，这些引物可以扩增hexon基因内的890 bp区域。常规PCR的检测限确定为10^2拷贝/μL（图5b）。图5：a. 特定实时/FAdV-11 PCR检测方法的敏感性分析，显示检测限为10拷贝/反应。b. 常规PCR（Hexon A/Hexon B）的敏感性分析，PCR产物大小约为890 bp。曲线1-6/泳道的模板量分别为10^5到5拷贝。M：DNA大小标记。显示全尺寸 2.4 种内和种间特异性 在存在12种FAdV DNA提取物的情况下测试了我们的检测方法的种内特异性。扩增曲线表明，该检测方法没有扩增其他11种血清型，证实了特定实时/FAdV-11 PCR检测方法对血清型11的特异性（图6a）。相比之下，在存在四种禽类病毒（禽流感病毒（H9N2）、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒）的cDNA的情况下测试了种间特异性。曲线显示，我们的检测方法没有扩增这些病毒，证实了其种间特异性（图6b）。图6：a. 特定实时/FAdV-11 PCR检测方法的种间特异性测试。红色曲线代表FAdV-11，而绿色曲线（阴性结果）对应于其他11种FAdV血清型，证实了检测方法的特异性。显示全尺寸 2.5 重复性和再现性测试 为了确定特定实时/FAdV-11 PCR检测方法的重复性，测试了一系列从10到10^6拷贝/μl的浓度。每个浓度在单次运行中测试了6到9次。然而，为了确定再现性，每个浓度在连续三天内测试了三次。通过检查Ct值的变化分析了检测方法内的和检测方法间的变异。检测方法内的和检测方法间的变异系数分别为0.126–0.30%和0.16–0.37%，表明我们的检测方法具有出色的再现性和重复性。3. 特定实时/FAdV-11 PCR检测方法的临床性能 在测试的25个样本中，通过测序确定其中25个为血清型11。为了评估我们检测方法的临床性能，这些样本通过特定实时/FAdV-11 PCR检测方法、常规PCR（Hexon A/Hexon B）和通用实时PCR/52 K测试进行了扩增。获得的Ct值转换为对数值（log10 IU/mL），以便研究我们的检测方法与通用实时PCR/52 K定量检测方法之间的相关性。3.1. 与cPCR检测方法的一致性 在测试的25个样本中，80%（20/25）的样本通过我们的检测方法和cPCR检测方法都检测到了FAdV-11 DNA。此外，16%（4/25）的样本通过我们的检测方法被检测到，但cPCR检测方法呈阴性。最后，4%（1/25）的样本通过特定实时/FAdV-11 PCR检测方法和cPCR检测方法都呈阴性。该样本的病毒载量估计小于10拷贝/反应（表6）。表5：特定实时TaqMan PCR检测方法的重复性和再现性。下载CSV显示表格 表6：特定实时/FAdV-11 PCR检测方法、通用实时PCR测试/52 K和常规PCR（Hexon A/Hexon B）的检测率。下载CSV显示表格 我们的检测方法与cPCR检测方法之间的周转时间比较（表7）显示，cPCR检测方法需要3小时40分钟来检测样本，而我们的检测方法仅需1小时21分钟即可完成整个过程。表7：特定实时/FAdV-11检测方法、通用实时PCR/52 K检测方法和常规PCR（Hexon A/Hexon B）的周转时间比较。下载CSV显示表格 3.2. 与通用实时PCR/52 K检测方法的一致性 在测试的25个样本中，96%（24/25）的样本通过我们的检测方法和通用实时PCR/52 K检测方法都检测到了FAdV-11 DNA。然而，4%（1/25）的样本通过通用实时PCR/52 K检测方法被识别为阳性，但通过我们的检测方法呈阴性（表6）。该样本的病毒载量估计为6拷贝/μl。通过特定实时/FAdV-11 PCR检测方法检测的样本的平均病毒载量为3.46 ± 1.46 log10 IU/mL，略高于通用实时PCR/52 K检测方法测得的3.26 ± 1.40 log10 IU/mL。两种检测方法之间的差异没有统计学意义（p < 0.001）（图7a）。图7：a. 特定实时/FAdV-11 PCR检测方法与通用实时PCR/52 K检测方法之间的FAdV-11 DNA水平比较。显示全尺寸 通用实时PCR/52 K检测方法与特定实时PCR/FAdV-11检测方法之间所有测试样本（n = 25）的总体相关性给出了线性方程y = 0.9353x + 0.0158，相关系数为0.9531，表明两种检测方法之间存在强且显著的相关性（图7b）。周转时间的比较显示，通用实时PCR/52 K检测方法需要2小时21分钟来检测样本，而我们的检测方法仅需1小时21分钟即可完成整个过程（表7）。V. 讨论 包涵体肝炎是一种由禽腺病毒引起的广泛存在的禽类疾病。D型和E型分别占报告的IBH病例的24%和76%（Kiss等人，2021年）。E型的血清型8a和8b以及D型的血清型11和2是从IBH病例中最常分离出的血清型。在摩洛哥，2015年至2017年间报告的两场流行病中，血清型11被确定为优势血清型（Abghour等人，2019年；Ouchhour等人，2025年；Redondo等人，2018年）。这一背景为开发本研究中介绍的针对FAdV-11的特定实时PCR检测方法的选择提供了依据。我们的检测方法基于针对纤维基因内一个区域的引物和探针。这些引物和探针已被证明对FAdV-11的检测有效且具有特异性。检测方法的分析性能显示效率为99%，回归系数为0.994，与基于SYBR Green的通用实时PCR检测方法报告的效率98%和R2为0.999相似。我们的检测方法的灵敏度确定为10拷贝/μl，与Romanova等人开发的针对FAdV-9的实时PCR检测方法的灵敏度相当（Romanova等人，2009年），后者也能检测其他血清型（FAdV-1、FAdV-2、FAdV-8、FAdV-10）。基于SYBR Green的通用实时PCR报告的检测限为6.9拷贝/mL，这比我们的检测方法稍微敏感一些（Günes等人，2012年）。然而，这种检测方法可以检测所有12种血清型，但不能区分它们。此外，一种针对FAdV-4的TaqMan实时PCR检测方法的检测限与我们的检测方法相似，强调了所开发检测方法的稳健性。重要的是，我们的检测方法表现出高度的特异性，成功区分了FAdV-11与其他所有FAdV血清型，包括在D型中关系最密切的FAdV-2。这种强大的区分能力反映了针对FAdV-11纤维基因中独特核苷酸变异的引物和探针的精心设计，确保即使在存在密切相关的病毒DNA的情况下也不会发生交叉反应。该检测方法在针对其他常见禽类病原体（包括禽流感病毒（H9N2）、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒）进行测试时也没有扩增。临床性能在25个野外样本上得到了验证。获得的结果与另外两种检测方法的结果进行了比较：基于Hexon A/Hexon B引物的常规PCR（Meulemans等人，2001年；Raue & Hess，1998年），通常用于通用检测和系统发育研究，以及基于SYBR Green的通用实时/52 K PCR（Günes等人，2012年）。我们的检测方法在检测FAdV-11方面比常规PCR灵敏10倍，覆盖了广泛的DNA浓度范围。它还与通用实时检测方法/52 K显示出高相关性（R2 = 0.98），同时提供了一步完成检测、定量和基因分型的优势。我们检测方法的一个关键优势是其快速性。它能够在显著缩短的时间框架内（31分钟）内完成包括检测、定量和基因分型在内的全面诊断过程，而通用实时PCR/52 K检测方法需要90分钟，常规PCR的简单检测需要130分钟。这些结果突显了我们特定实时TaqMan检测方法的显著优势，其准确性、速度和实用性使其成为监测和控制FAdV-11感染的强大工具。VI. 结论 总之，本研究报道了首个针对FAdV-11的实时TaqMan PCR检测方法的开发和验证，提供了一种快速、灵敏且准确的诊断工具。该检测方法表现出优异的分析性能，灵敏度为10拷贝/μl，具有高特异性和准确性。其高效率（结果在31分钟内获得）以及能够在单次反应中结合检测、定量和基因分型的能力，使其成为FAdV-11流行病管理的宝贵工具。这项测试标志着FAdV-11分子诊断技术的重大进步，为家禽产业的有效防控策略提供了支持。
**资助情况**：本研究是“多主题研究与开发项目”的一部分，该项目得到了穆罕默德六世理工学院（UM6P）、高等教育与科学研究部（DESRS）、国家科学技术研究中心（CNRST）以及Cherifien Phosphates Office基金会（FOCP）的支持，并与Hassan II农业与兽医研究所合作开展。

**研究亮点**：
- 首次开发出一种针对FAdV-11的特异性实时PCR TaqMan检测方法，能够实现检测、定量和基因分型的一步完成；
- 方法具有优异的线性关系（R2 = 0.995）和高达10拷贝/μl的分析灵敏度；
- 可特异性扩增FAdV-11，且不会与其他FAdV血清型或禽类病原体发生交叉反应；
- 在临床验证中，该方法与测序结果完全一致。

**补充材料**：
- Supplement Data.docx
- 下载MS Word文件（16.4 KB）

请注意：文件链接可能因版权或访问限制而无法直接提供。如需获取完整资料，请联系相关机构或研究者。