《BioTechniques》：Isolation and characterization of bovine-milk derived extracellular vesicles using a modified aqueous two-phase system
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本文介绍了一种改良型双水相系统（ATPS），用于从原料牛乳中低成本、高效率地分离细胞外囊泡（EVs）。该研究通过一系列物理与生化表征，证明了所获EVs具备典型的囊泡形态、特定蛋白标志物（CD63、TSG101）及合理的蛋白/脂质比，为资源有限实验室开展EVs研究提供了实用可靠的技术方案，有助于推动牛乳来源EVs的治疗应用潜力探索。
在生物医学领域，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通信的关键信使，其承载的蛋白质、脂质和核酸信息，使其在疾病诊断、药物递送和治疗方面展现出巨大潜力。然而，通向这一宝藏的道路上却横亘着一道技术门槛：传统的EVs分离方法，如超速离心和尺寸排阻色谱，虽然有效，但往往伴随着高昂的设备成本、复杂的操作流程以及对囊泡可能造成的损伤，这让许多小型或资源有限的实验室望而却步。有没有一种方法，既能高效捕获这些珍贵的纳米“包裹”，又无需依赖昂贵的大型仪器呢？研究人员将目光投向了日常饮食中来源丰富的原料牛乳。牛乳本身就是一个复杂的生物基质，从中分离高纯度的EVs更具挑战性，但也意味着一旦成功，其方法将更具普适性和应用价值。
为了攻克这一难题，由Logan Scott Whitney等人领导的研究团队，在《BioTechniques》期刊上发表了一项创新研究。他们开发并验证了一种基于改良型双水相系统（Aqueous Two-Phase System, ATPS）的方法，专门用于从原料牛乳中分离EVs。这项研究不仅提供了一套详细的操作方案，更通过全面的表征证实了该方法的可靠性，为EVs研究的普及化和应用转化开辟了一条经济实用的新路径。
关键技术方法概要
研究人员从美国犹他州的Finney Farms获取原料牛乳作为样本来源。核心技术是改良的聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dextran）双水相系统分离法，该方法结合了序列离心、过滤和多次PEG/Dextran相分配步骤，将EVs富集在Dextran相中。随后，通过扫描电子显微镜（SEM）观察囊泡形态，使用玫瑰红（Rose Bengal）染色法测定蛋白质浓度，利用流式细胞术检测EVs特异性表面蛋白标志物CD63和TSG101，采用磺化香草醛（Sulfophosphovanillin assay, SPVA）法进行脂质定量，并应用TRIzol法提取和评估囊泡内的核酸含量，以全面表征分离所得EVs的理化性质和生物学特征。
研究结果
3.1. 形态
通过扫描电子显微镜（SEM）对分离物进行形貌表征。观察到的EVs平均直径为138.87 ± 30.09 nm。SEM图像证实了在该尺寸下EVs的球形和光滑表面，进一步验证了其大小和形态，与文献中报道的165.0 ± 3.4 nm尺寸和类似球形相符。盐晶体由于缓冲液的性质也被观察到，但因其尖锐的晶体结构而被排除在EVs之外。
3.2. 蛋白质浓度
使用玫瑰红（Rose Bengal）法测定了分离EVs中的蛋白质浓度，该方法基于玫瑰红染料与蛋白质中碱性氨基酸残基的结合。EV分离物的蛋白质浓度定量为0.340 ± 0.03 μg/μL，表明囊泡制剂中存在大量的蛋白质物质。该结果证实了EVs的成功分离，并且囊泡中的蛋白质含量与文献中通过超速离心法获得的结果（321.5 ± 61.5 μg/mL）相当甚至略高。研究也指出，与其他EVs分离方法一样，通过ATPS法更难完全去除酪蛋白胶束，但引入初步酸化步骤有助于提高蛋白质纯度。
3.3. 蛋白质功能与大小
流式细胞术证实了EVs标志物（包括CD63和TSG101）的存在，表明通过ATPS分离的EVs保持了功能完整性。CD63阳性的EVs显示出最高的归一化颗粒浓度（2.413 × 108particles/mL），高于TSG101阳性的EVs（1.698 × 108particles/mL）。仅使用二抗的对照样本信号微弱，而未染色的EV样本则未检测到事件，表明了染色方法的特异性。基于TSG101抗体数据的分析显示EVs平均直径为246 nm，而基于CD63抗体数据的平均直径为256 nm。此尺寸与SEM结果（~139 nm）的差异可能归因于SEM制样时的干燥过程以及流式检测中EVs的聚集。
3.4. 脂质浓度
使用磺化香草醛（SPVA）法分光光度测定了EVs的脂质浓度。当使用胆固醇标准品校准时，EVs的脂质含量为0.970 ± 0.2 μg/μL；当使用复合的胆固醇和鱼油脂肪酸标准品校准时，脂质含量为0.870 ± 0.1 μg/μL。所有预浓缩EV样本的SPVA平均脂质浓度为0.926 ± 0.2 μg/μL。计算得出的蛋白/脂质比值为0.3675（1:2.717），符合国际细胞外囊泡协会（ISEV）对此类尺寸分布的细胞外囊泡所规定的表征标准范围。
3.5. 核酸谱
使用TRIzol法从EVs中提取核酸并通过分光光度法进行定量。EVs中核酸的浓度为231 ± 18 ng/μL，这与文献中关于牛乳来源EVs的数值（200 ± 40 μg/mL）一致。分离物的260/280比值为1.34 ± 0.03，260/230比值为0.30 ± 0.04，表明存在蛋白质残留吸收以及碳水化合物、苯酚或其他芳香族化合物的污染。因此，EV分离物虽然含有典型浓度的核酸，但通过此方法获得的核酸存在杂质。
研究结论与意义
本研究成功利用改良型双水相系统（ATPS）从原料牛乳中分离并表征了细胞外囊泡（EVs）。该方法显示出作为传统超速离心和尺寸排阻色谱技术替代方案的潜力，符合当前MISEV指南。研究结果证实，分离得到的EVs在大小和形态、蛋白质浓度、蛋白质功能、脂质浓度以及核酸谱方面均具有细胞外囊泡的典型特征，并且在分离后仍保留了其生物活性成分和功能完整性。
该改良ATPS方法的核心优势在于其可扩展性、成本效益以及对专用设备的最低依赖，这使得小型或资源有限的实验室（特别是农村环境中的实验室）也能够进行EVs相关研究。尽管该方法在完全去除酪蛋白等杂质方面仍存在局限，有待进一步优化，但它为从原料牛乳这一丰富且未经处理的复杂生物基质中回收EVs提供了一种可靠且实用的方案。这项工作不仅验证了一种新的EVs分离工具，更重要的是降低了EVs研究的门槛，拓宽了获取和研究乳源性EVs的途径，为其未来的治疗应用潜力探索奠定了方法学基础，有助于推动EVs在生物医学领域更广泛的研究与应用。
