使用LC-HRIM-QTOFMS进行快速定量生物分析，该技术具备灵活的样品输送方式以及可调节的行波轮廓特性

《Analytica Chimica Acta》：Rapid quantitative bioanalysis using LC-HRIM-QTOFMS with flexible sample delivery and variable traveling wave profiles

高分辨离子迁移-高效液相色谱-质谱联用技术结合自动进样优化，实现复杂生物样本中痕量代谢物（如酵母核黄素衍生物、植物铁吸收素）的快速定量分析，通过变量行波扫描提升离子采样密度，并采用短柱高效液相色谱缩短分析时间至5分钟以内，解决了传统方法中峰容量不足和基质效应问题。

　　

Sabrina M. Cramer|Viktoria Kowarz|Diethard Mattanovich|Stephan Hann|Tim Causon

维也纳技术大学（BOKU）分析化学研究所，自然科学与可持续资源系，Muthgasse 18，1190，奥地利

摘要

背景

在生物分析的液相色谱-质谱（LC-MS）应用中，引入高分辨率离子迁移率（HRIM）这一维度可以提高通量，并获得高灵敏度的结果，同时将离子抑制降至最低。然而，传统的HRIM分离步骤会导致每个LC峰的数据点减少以及工作范围缩小，从而影响定量分析的效果。本研究通过采用替代的样品输送方法和HRIM行波轮廓技术，解决了这些问题，实现了对复杂样品中小分子和代谢物的快速定量分析。

结果

开发了新的HRIM-QTOFMS工作流程，能够快速、定量地分析样品，并充分采样LC峰，以充分利用高分辨率的离子迁移率分离效果，获得高质量的分析数据。通过使用可变行波轮廓（在HRIM扫描过程中改变施加的振幅和频率），每个LC峰的采样点数增加到超过15个。通过优化进样方式，峰面积得到改善，使用短柱（3至5厘米）时，总分析时间可进一步缩短至每个样品不到5分钟。该方法成功地在5分钟内定量了由三种不同工程酵母菌株Komagataella phaffii产生的核黄素及其它黄素核苷酸，同时还鉴定并定量了禾本科植物（大麦和高粱）分泌的植物铁载体。

意义

本研究提出了一种结合快速LC分离和HRIM分离的新方法，并采用了集成进样模式，适用于生物分析的定量应用。我们证明了通过使用HRIM行波轮廓技术增强LC峰的采样，并利用HRIM后的碎片化过程来定量异构体，可以实现生物样品中小分子的高通量分析。

引言

现有的生物分析方法通常是靶向性和定量的，但许多方法依赖于液相色谱（LC）与质谱（MS）的组合。离子迁移率（IM）提供了一种有效的补充分离方式，因为气相离子可以根据大小、形状和电荷在毫秒级时间内被分离，同时还能计算出碰撞截面（CCS）。将LC与IM-MS结合使用，可以在保持LC分离优势的同时，大幅减少分析所需时间，而不会牺牲分辨率[1]、[2]。引入IM技术还带来了其他优势：通过离子迁移率进行预质谱信号过滤，从而获得更干净的光谱；改善异构体的分离和鉴定；以及通过将分析物迁移率转换为计算出的CCS值来进行进一步的分子注释[3]。

近年来，为了提高异构体分离的分辨率（R_p），高分辨率离子迁移率（HRIM）技术得到了发展，其R_p超过了200，使得异构体的分辨率得到显著提升[4]、[5]、[6]、[7]。提高IM的分辨率可以通过在电压梯度上捕获离子（即捕获离子迁移率）或使用数米的IM路径长度来实现。其中一个商业化的平台MOBILion MOBIE系统采用了结构无损离子操控（SLIM）技术，在两个堆叠的印刷电路板之间形成13米的蛇形路径来限制和推动离子运动，从而在几百毫秒的时间内实现对所有分析物的高分辨率MS光谱采集。

在分析方法开发中，利用HRIM-MS可以完全省略初始的色谱分离步骤或大幅加快分离速度。在直接进样方法中，仅依赖IM分离可以实现最高的通量，但这样会降低整体的峰容量和分析性能[8]、[9]、[10]。然而，当IM分辨率有限时，基质效应可能导致严重的离子抑制和光谱数据质量下降，影响异构体的区分。不过，即使只进行短暂的初步LC分离，也能保留两种分离方式的优点，减少电喷雾离子受基质效应和电荷竞争的影响，保留时间还能为异构体鉴定提供参考参数。

鉴于当前的仪器技术水平，使用LC-HRIM-MS对复杂生物基质中的小分子和代谢物进行高通量定量应该是可行的。不过，要使这些方法能够得到常规应用，必须同时满足定性和定量分析的要求。在此，我们开发了优化后的LC-HRIM-QTOFMS参数，实现了高通量的靶向分析，并保持了常规LC-QTOMS方法所需的稳健性。为此，需要对狭窄的LC峰进行充分采样，以充分利用高分辨率的SLIM分离效果并获得干净的质量谱。通过结合LC和HRIM的优势以及改进的样品引入技术，我们针对生物样品中的小分子（如核黄素及其核苷酸FMN和FAD，以及由甲基营养酵母Komagataella phaffii产生的八种植物铁载体）进行了两项应用研究。

章节摘录

化学物质

本研究使用的化学物质包括：3"-羟基麦角酸（MA）、3"-羟基麦角酸epi型（epi-HMA）、羟基阿魏酸（HAVA）、脱氧麦角酸（DMA）、3"-羟基脱氧麦角酸（HDMA）、3"-羟基脱氧麦角酸epi型（epi-HDMA）和阿魏酸（AVA）及其相应的¹³C₂标记衍生物，以及¹³C₄标记的DMA。这些化学物质由奥地利维也纳技术大学应用合成化学研究所提供[11]、[12]。它们的结构见表S10。

实施进样模式

本研究使用的混合采样器提供了进样模式作为流式进样的替代方案，通过冲洗溶剂来减少样品和洗脱液不匹配引起的强烈溶剂效应[15]。此外，这种模式允许更快地调整流动相组成，因为流式进样的流动路径被绕过了，从而缩短了梯度延迟体积。

结论

我们开发了快速LC-HRIM-MS方法，用于生物样品的靶向分析，充分利用了HRIM的技术优势，并通过自动进样模式将LC分离时间降至最低。这两种目标应用的分析时间分别从14分钟缩短至3分钟[14]，以及从12分钟缩短至5分钟[14]。为了实现快速LC分离下的准确定量，本文强调了两种关键方法。

CRediT作者贡献声明

Tim Causon：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法论设计、资金筹集、概念构思。Stephan Hann：撰写、审稿与编辑、方法论设计、数据分析。Sabrina M. Cramer：初稿撰写、数据可视化、方法验证、方法设计、实验研究、数据分析。Diethard Mattanovich：撰写、审稿与编辑、方法论设计。Viktoria Kowarz：方法验证、资源调配、方法论设计

资金来源

我们感谢Agilent大学关系部（ACT-UR计划和奖项ID #5010提供的资金支持。开放获取资金由BOKU大学提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

感谢Agilent Technologies Inc.和MOBILion Systems Inc.提供的技术支持以及分别借出的QTOFMS和HRIM仪器。同时感谢BOKU大学土壤科学研究所的Andreea Spiridon提供根系分泌物样本。