《Animal Reproduction Science》：In silico analysis of cholesterol binding to species-specific and non-specific albumins and their effects on
in vitro quality parameters of ram spermatozoa
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该研究通过计算和体外实验探究不同物种来源的血清白蛋白（BSA、HSA、OSA、CSA）与胆固醇（CHOL）的相互作用及其对冷却绵羊精子功能的影响。结果显示，OSA在分子对接中表现出更稳定的CHOL结合模式，但体外实验发现OSA会显著降低精子活力、存活率，并增加凋亡和膜损伤，尤其在24小时冷却条件下。该研究强调物种特异性白蛋白在精子体外处理中的潜在风险，为优化动物生殖技术提供新视角。
Eduardo Rodrigues Pessoa | Cristina Palacin-Martinez | Victor Lucas Bernardes Fran?a | Marta Neila-Montero | Rafael Montes-Garrido | David Ramírez-González | Caio Bruno de Lima Oliveira | Denise Damasceno Guerreiro | Mercedes álvarez | Luis Anel | Luis Anel-Lopez | Valder Nogueira Freire | Arlindo Alencar Moura | Cristina Soriano-úbeda
巴西塞阿拉州福塔莱萨市塞阿拉联邦大学动物科学系
摘要
本研究结合了计算机模拟分析（in silico）中的白蛋白-胆固醇（CHOL）相互作用，以及体外评估不同物种特异性白蛋白（羊血清白蛋白，OSA）和非物种特异性白蛋白（牛：BSA；人：HSA；山羊：CSA）对冷却公羊精子的效应。通过分子对接、分子动力学和量子生化计算来表征白蛋白-CHOL的结合过程。实验使用了10份来自10只公羊的精液样本，这些精液分别在15°C下冷却3小时或5°C下冷却24小时，然后与BSA、HSA、OSA或CSA共同孵育。结果表明，OSA在多个计算机模拟方法中均表现出最有利的结合特性，并形成了稳定的复合物。在冷却3小时的样本中，OSA显著降低了精子的总活动率（44.0 ± 2.4%；P < 0.05）、存活率（28.8 ± 5.3%；P < 0.05），并增加了顶体损伤（40.2 ± 3.5%；P < 0.05），而其他组别中这些指标的变化较小（BSA分别为24.4 ± 1.6%和23.5 ± 1.4%）。在冷却24小时的样本中，OSA同样降低了精子的活动率和存活率（48.8 ± 3.8%，21.9 ± 1.6%；P < 0.05），与BSA相比）。此外，OSA还增加了细胞凋亡（93.9 ± 0.6%），并降低了线粒体活性氧（ROS）水平（6.1 ± 0.05），而BSA和HSA的相应数值分别为22.4 ± 3.9%和16.4 ± 2.8%）。HSA和OSA均导致了顶体损伤的增加（35.1 ± 2.3%和30.8 ± 1.4%，对照组为19.2 ± 4.2%）。因此，在 capacitation 条件下，OSA 会引发显著的膜结构和顶体变化，这可能与其有利的 CHOL 结合特性有关，但同时也会损害精子的活动性、存活率和线粒体功能。这些结果表明，对于冷却后的公羊精子而言，物种特异性白蛋白是有害的，不建议在当前条件下用其替代 BSA。然而，白蛋白的物种特异性效应表明，针对不同物种定制的处理方案将有助于优化体外精子处理流程。
引言
Capacitation 指的是精子在射出后进入女性生殖道内发生的生化修饰过程。精子 capacitation 对成功受精至关重要（Austin, 1952; Peris-Frau et al., 2019），理解这些过程对于推进辅助生殖技术（ARTs）的发展至关重要。虽然 capacitation 可以在体内自然发生，但也可以通过在培养基中添加外源性分子或模拟输卵管液的方式来体外复制（Visconti et al., 2011）。已经对牛（Rodríguez-Villamil et al., 2020）、公羊（Peris-Frau et al., 2021）和人类（Chhikara et al., 2023）等物种的精子 capacitation 进行了研究，其特征包括精子质膜流动性的增加、膜胆固醇（CHOL）的流出、细胞内离子浓度的变化（Visconti et al., 2011）、运动模式的变化（Bailey, 2010）、蛋白激酶 A（PKA）活性的增强（Visconti et al., 1995）、蛋白质酪氨酸磷酸化（Arcelay et al., 2008）以及顶体事件的变化（Austin, 1952, Bailey, 2010）。
要深入理解 capacitation 条件下精子受精能力的获得机制，需要研究精子膜的组成和动态及其与精液的相互作用（Martínez and Morros, 1996）。CHOL 是精子膜的一个关键成分，对膜的稳定性和流动性起着重要作用（Cross, 1996; Mann and Lutwak-Mann, 1981）。CHOL 的分子结构及其亲水区和疏水区的分布对其与载体蛋白的相互作用至关重要（Visconti et al., 2011）。CHOL 从精子质膜中的流出对于 capacitation 过程至关重要，多种分子可促进这一过程，包括高密度脂蛋白、β-环糊精、精子蛋白结合剂（BSP）和白蛋白（Menezes et al., 2016; Visconti et al., 1999a, 1999b, Xia and Ren, 2009）。
白蛋白是一种水溶性蛋白质，存在于精液、子宫液和输卵管液中（Casslen and Nilsson, 1984; Elzanaty et al., 2007; Tucker and Schultz, 1977）。白蛋白可以与精子膜结合并清除其中的 CHOL，从而促进膜流动性，并触发后续的细胞内信号级联反应，这些反应对精子 capacitation 是必不可少的（Visconti et al., 1998）。牛、人和山羊血清白蛋白（BSA、HSA、OSA 和 CSA）的结构高度保守（见补充材料中的图 S1C），它们都是单链球状多肽，具有由三个同源结构域组成的三维构象（Fanali et al., 2012）。这些白蛋白的分子量相似，大约在 66 至 69 kDa 之间，含有 580 至 586 个氨基酸（Jahanban-Esfahlan et al., 2015, Roufegarinejad et al., 2018）。尽管结构保守，不同物种的白蛋白在氨基酸序列和表面可及性方面存在差异（见补充材料中的图 S2），这些差异可能会影响它们与 CHOL 的相互作用。
计算机模拟方法，如分子对接、分子动力学和量子生化计算，已成为解析蛋白质-配体结合及其对生物过程影响的强大工具。尽管这些技术在药理学、医学和毒理学领域已经得到广泛应用（例如研究多种配体与血清白蛋白的结合 Dantas et al., 2015, Fran?a et al., 2022），但在动物繁殖领域的应用仍较为有限。在此背景下，计算机模拟分析白蛋白-CHOL 复合物的相互作用有助于阐明不同物种的白蛋白如何促进 CHOL 从精子膜中的流出，进而影响 capacitation 条件下的精子膜重塑和下游功能反应。尽管尚未在计算机模拟中研究白蛋白与 CHOL 的具体相互作用，但计算和建模方法已经有助于理解 capacitation 相关的关键过程，如肌动蛋白信号传导和钙介导的膜重塑（Aguado-García et al., 2021, Bernabò et al., 2011）。BSA 是常用的细胞培养基成分和体外精子 capacitation 协议中的添加剂（Francis, 2010, Go and Wolf, 1985），但它并非唯一选择，其效果可能因物种而异（Nyachieo et al., 2009）。因此，了解不同分子载体（尤其是血清白蛋白）如何促进 CHOL 的清除和膜重塑对于优化体外 capacitation 条件下的精子处理至关重要。识别具有增强 CHOL 结合能力的白蛋白可能为开发定制的精液稀释剂和/或 capacitation 培养基提供新机会，从而提高辅助生殖技术的效果。
通常将精子在15°C下冷藏3小时以稳定其状态，这有助于精子适应处理过程中的亚致死损伤（Neila-Montero et al., 2024a）。而在实际应用中，当受精因物流限制而延迟时，常选择在5°C下冷藏最多24小时（Alvarez et al., 2019, Purdy et al., 2010）。然而，长时间低温处理会损害精子的活动性和膜完整性，即使使用了优化的稀释剂（de Paz et al., 2010, López-Sáez et al., 2000）。这种储存条件可能会影响精子对白蛋白的反应，进而影响膜重塑和关键 capacitation 相关功能（Barbas and Mascarenhas, 2009）。因此，本研究旨在使用计算机模拟方法（分子对接、分子动力学和量子生化计算）来表征 CHOL 与物种特异性（OSA）和非物种特异性（BSA、HSA、CSA）白蛋白之间的相互作用，并体外评估白蛋白对冷却公羊精子活动性和功能特性的影响。
实验设计
本研究包括两个连续的实验。第一个实验使用计算机模拟方法（如分子对接、分子动力学和量子生化计算）研究了 CHOL 与 BSA、HSA、OSA 和 CSA 的相互作用。第二个实验评估了不同物种特异性（OSA）和非物种特异性（BSA、HSA、CSA）白蛋白对体外精子活动性和功能参数（存活率、细胞凋亡、线粒体活性氧 [ROS] 和顶体状态）的影响。
分子对接
根据对接得分和位点占据频率选择了合适的结合构象（见表 S1，见补充材料）。对于白蛋白-CHOL 结合，得分最高的构象分别为：BSA 的 -7.9/FA9、-7.6/NS1 和 -7.6/FA1；HSA 的 -11.1/FA1、-10.6/FA8 和 -8.5/FA9；OSA 的 -9.2/FA1、-9.0/FA1-FA9 和 -7.3/NS5；CSA 的 -9.5/FA6 和 -8.7/NS5。分子对接结果表明，CHOL 的结合倾向顺序为：HSA > CSA > OSA > BSA。
分子动力学
进行了分子动力学模拟。
讨论
由于牛血清白蛋白能够促进精子质膜中 CHOL 的流出，因此被用于体外精子 capacitation 过程（Chaves et al., 2021, Davis, 1982, Visconti, 2009）。尽管 BSA 是标准选择，但研究表明，其有效性因物种和白蛋白的结构特性而异（Kosa et al., 1997, Nyachieo et al., 2009）。
结论
计算分析表明，与 BSA、HSA 和 CSA 相比，OSA 在特定结合位点上与 CHOL 的相互作用更具能量优势且更稳定。这些分子特征表明，OSA 可能更有效地结合 CHOL，从而增加 CHOL 的清除潜力。在体外 capacitation 条件下孵育的公羊精子中，OSA 对精子活动性、存活率、线粒体 ROS 和顶体状态的负面影响比 BSA 更显著。
资助
本研究得到了巴西国家科学技术发展委员会（CNPq；项目编号 #162323/2021-2）和高等教育促进委员会（CAPES；项目编号 #88881.846281/2023-01）的博士奖学金支持，以及 Arlindo Moura 博士指导下的 CNPq 项目（项目编号 #312742/2022-3; 406866/2022-8）的资助。此外，该工作还部分得到了 PID2021-122470OB-I00 项目的支持，该项目由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER 和 UE 资助。
CRediT 作者贡献声明
Moura Arlindo Alencar Araripe：撰写、审稿与编辑、监督、资源管理、方法论制定、资金申请、概念构思。
Cristina Palacin-Martinez：数据可视化、方法论设计、数据分析、数据管理、概念构思。
Valder Nogueira Freire：监督、资源管理、方法论设计。
Cristina Soriano-úbeda：撰写、审稿与编辑、方法论设计、数据管理、概念构思。
Luis Anel-Lopez：撰写、审稿与编辑、监督。
写作过程中使用生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明
使用 ChatGPT 协助文本润色和提升可读性。作者随后对文本进行了严格审查和修订，并对最终内容负全责。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢西班牙莱昂市 Villaquilambre 的 Centro de Selección y Reproducción Animal (CENSYRA)、Villalazán 的 Centro de Selección y Mejora Genética OVIGéN 以及西班牙 Zamora 的 Asociación Nacional de Criadores de Ganado Ovino de Raza Assaf de Espa?a (ASSAFE.E, Granja Florencia) 在动物处理、精液采集及慷慨提供精液方面提供的支持。
