通过局部显微注射技术研究轮藻中叶绿体活动的循环转运机制及其氧化还原调节

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics》：Cyclosis-mediated transport and redox regulation of chloroplast activity probed by local microinjection in characean alga

细胞受闪烁光照后通过细胞质流动传递NADPH和H2O2，影响下游叶绿素荧光。微注射实验证实H2O2和NADPH可跨膜运输，调控光系统II电子传递及非光化学淬灭，揭示细胞质流动在长距离 chloroplast 通讯中的作用。

　　

Natalia A. Krupenina|Alexander A. Bulychev|Anna V. Alova|Florian von Ruling|Alexey Eremin

俄罗斯莫斯科国立罗蒙诺索夫大学生物学院

摘要

暴露在闪烁斑点光照下的轮藻科（Characeae）节间细胞能够促进局部光照胁迫区域与未受处理细胞区域之间的长距离叶绿体间通信。这种信号传递和功能协调涉及从受光照胁迫的叶绿体中输出多余产物，通过细胞质流动进行横向运输，将运输到的物质传递到光照较弱的受体叶绿体中，并对这些物质产生代谢反应。有间接证据表明，叶绿体间通信是由光合作用电子传递过程中产生的两种代谢物介导的：还原剂如NADH以及最稳定的活性氧形式H?O?。本研究通过局部施加亚纳米浓度的H?O?和细胞质微注射NADH，并结合显微镜-PAM叶绿素荧光测定法及共聚焦激光扫描显微镜技术，测试了这些物质在细胞内信号传导中的作用。结果表明，这些物质对暴露在弱光环境下的叶绿体的实际叶绿素（Chl）荧光强度（F′和Fm′）有影响，但对处于黑暗环境中的细胞则没有影响。NADH和H?O?引起的叶绿素荧光变化具有相反的极性，分别反映了质体醌的还原（通过循环电子传递途径）和非光化学淬灭过程。实验还证实了外源H?O?能够随细胞质流动，这表明H?O?可以在植物细胞中作为可传输的信号物质发挥作用。研究结果为还原剂和氧化剂H?O?参与叶绿体间通信提供了证据。

引言

诸如局部光照[1]、[2]、[3]以及使用玻璃微针穿刺细胞壁[4]、[5]等定向物理化学处理方法，有助于研究细胞和组织中的时空关系。在巨型轮藻细胞实验中，发现高光照下的叶绿体会将生理活性物质释放到细胞质中，这些代谢物通过细胞质流动扩散到未受处理的区域，从而影响该区域的叶绿素（Chl）荧光和光合作用活性[6]。

在低背景光照条件下，流经明亮光照点的细胞质会积累还原剂（NADH），这可从下游细胞区域叶绿素荧光强度F′的短暂升高中看出。在高背景光照或较高外部pH值条件下，局部光照区域的细胞质中还会富集另一种代谢物H?O?，该物质会导致位于光照点下游的叶绿体发生能量依赖性的非光化学淬灭（NPQ）[7]。

使用玻璃微针穿刺细胞壁是一种不同的局部刺激方式，它会在损伤点周围形成明显的碱性区域[4]、[8]。pH值的升高伴随着氧气消耗的增加，表明质膜NADPH氧化酶被激活，同时由于细胞壁失去对质膜的支撑作用，导致H?O?的生成[8]。局部光照下产生的光代谢物富集的细胞质部分可能促进参与机械敏感性反应的膜运输系统的活性[9]。这体现了光合作用、运输过程以及植物细胞力学之间的紧密联系。

直接测量植物细胞器及亚细胞区室中的光代谢物可能具有挑战性，且受所用方法的影响。近年来，用于检测植物细胞中H?O?和NADH的传感器技术有所进展[10]、[11]。然而，这些方法的局限性和缺点阻碍了我们对光代谢物在植物生理学中作用的全面理解。强烈的叶绿体自荧光现象以及难以获得表达荧光传感器的转基因轮藻细胞，限制了生物传感器在轮藻藻类中的应用。

通过局部施加生理活性物质，可以进一步阐明植物细胞中的时空关系。现有的微注射装置能够以极快的速度（不到一秒的时间内）将纳米级别的测试物质输送到细胞外空间或细胞内各区室。研究叶绿素对测试物质瞬时施加的反应，有助于了解光合作用早期的变化（这些变化无法通过其他传统技术观察到），同时还能揭示这些物质在细胞膜中的渗透情况及其空间分布。尽管如此，该技术在植物细胞研究中的应用潜力尚未得到充分探索。因此，有必要评估微注射技术在研究细胞内物质渗透及细胞质运输（如抑制剂和光合作用电子传递反应产物）方面的适用性。

在本研究中，我们测量了在细胞外和细胞内施加不同渗透机制的化合物后，轮藻（Chara）叶绿素的荧光变化（F′和Fm′）。其中一种化合物是DCMU（3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲脲），它对光合作用电子传递具有明确的抑制作用。由于DCMU的作用位点位于光系统II（PSII）中，因此该化合物需先穿过质膜和叶绿体膜才能与类囊体结合。研究发现，DCMU在细胞内和细胞外应用后的作用动力学存在差异：从细胞质空间向其结合位点的传输受到质膜的限制，而表面积较大的叶绿体膜对DCMU的渗透几乎没有阻碍。

本研究的主要焦点是H?O?的微注射，该物质可通过水通道蛋白穿过细胞膜[12]，以及通过苹果酸转运体和其他转运蛋白穿过叶绿体膜传递的还原剂（如NADH）[14]、[15]。这些物质可能参与了静止叶绿体之间的长距离通信。H?O?的细胞外应用表明，这种光合作用副产物不仅会改变受刺激区域叶绿体的电子传递途径和叶绿素荧光，还会影响细胞质流动方向下游区域的叶绿体。

NADH的微注射实验进一步证实了该物质在叶绿体长距离通信中的作用，为参与细胞质-叶绿体间还原剂交换的转运蛋白的光依赖性提供了更多证据。

植物材料

实验使用的是R. Brown鉴定出的Chara australis的节间细胞。实验前，分离出的细胞被置于含有0.1 mM KCl、1 mM NaCl和0.1 mM CaCl?（pH值用NaHCO?调节至7.0）的人工池塘水中至少1天。随后将分离出的节间细胞放置在一个透明培养皿中，该培养皿安装在Axiovert-25 CFL显微镜（Zeiss，德国）的载物台上，显微镜配备了Microscopy PAM（脉冲幅度调制）荧光测定仪（Walz，德国）。

质膜是DCMU渗透到结合位点的限速屏障

为了验证微注射方法的有效性，首先进行了3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲脲（DCMU）的细胞外和细胞内注射实验。DCMU是一种作用于光系统II（PSII）水平的电子传递抑制剂，它会中断从PSII初级醌受体Q?到次级醌Q?的电子传递过程，从而导致Q?的还原和叶绿素荧光强度F′的显著升高。

F′的动态变化

讨论

本研究结果表明，微注射是一种有用的物理化学处理方法，可用于巨型轮藻节间细胞，以检测叶绿体靶向物质（DCMU）的传输速率限制机制，以及通过H?O?和还原剂（NADH）介导的微流体细胞内信号传导的各个步骤。

CRediT作者贡献声明

Natalia A. Krupenina：撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验实施。Alexander A. Bulychev：撰写初稿、实验实施、概念构思。Anna V. Alova：撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验实施。Florian von Ruling：撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验实施。Alexey Eremin：撰写、审稿与编辑、方法学设计、资金筹集、概念构思。

资金支持

本研究是在俄罗斯联邦政府向莫斯科国立罗蒙诺索夫大学下达的科学项目（项目编号：121032500058-7）的支持下完成的。OVGU的作者感谢德国研究基金会（项目编号：ER 467/14-1）提供的财务支持。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务关系/个人关联：

Alexey Eremin表示获得了德国研究基金会的财务支持。Alexander Bulychev和Anna Alova与俄罗斯基础研究基金会存在关联，包括资金资助。其他作者声明他们没有已知的财务冲突或可能影响实验结果的个人关联。