通过计算方法从头设计一种针对LIMD2的α螺旋肽，可以抑制乳腺癌细胞的增殖

《International Journal of Biological Macromolecules》：Computational de novo design of an α-helical peptide targeting LIMD2 suppresses breast cancer cell proliferation

LIMD2过表达促进癌症进展，本研究开发计算设计流程生成靶向LIMD2的α-螺旋肽抑制剂，通过MD模拟识别关键结合位点，结合RFDiffusion、ProteinMPNN和Rosetta优化设计，17种低毒肽经ITC验证其中3种具有结合活性，最佳肽MSPEERAALAR在体外显著抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。

　　

黄秋燕|余玉帅|黄凯|朱正文|王兴龙|宋创伟

福建医科大学临床肿瘤学院乳腺外科，福建癌症医院，福州，福建，350014，中国

摘要

LIMD2（含LIM结构域的蛋白2）的过表达通过增强细胞迁移和抑制细胞凋亡来促进癌症进展。在这里，我们报告了一种用于从头设计LIMD2靶向肽抑制剂的计算流程。我们确定了LIMD2上的三个关键结合位点，这些位点形成了一个立体三角形，并且仅使用RFdiffusion在预定义的腔体内生成受几何约束的骨架，这一步骤不涉及亲和力评分，但在序列设计之前确保了空间兼容性。为了提高结构稳定性，我们使用ProteinMPNN将序列设计限制为α-螺旋肽。通过深度学习模型PEP-PPI评估了LIMD2与设计肽之间的预测结合亲和力，前100个候选肽使用Rosetta Build模块和FlexPepDock进行了结构建模和优化。前20个肽经过了毒性预测，最终合成了17个无毒性的肽，并通过等温滴定量热法（ITC）进行了实验验证，其中三个肽显示出可测量的结合亲和力，最好的肽亲和力为93.7 μM。在体外实验中，这些顶级肽（MSPEERAALAR）对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468的肿瘤细胞增殖表现出抑制作用，突显了它们作为肿瘤抑制剂的潜力。此外，我们分析了肽抑制剂与LIMD2的结合机制，揭示了肽中的关键结合残基，强调了设计结合位点以与目标结合的重要性。本研究提出了一种稳健的功能性肽从头设计策略，并确定了具有进一步抗肿瘤药物开发潜力的LIMD2靶向肽。

引言

LIMD2（含LIM结构域的蛋白2）的过表达与多种肿瘤类型有关，尤其是那些以细胞运动性增加、侵袭性增强、转移性高和预后不良为特征的肿瘤[1]，[2]。LIMD2主要位于侵袭性癌细胞的细胞质中，特别是在膜皱褶和 focal adhesions 处，并且据报道可以在细胞质和细胞核之间动态穿梭。这种过表达在三阴性乳腺癌（TNBC）和侵袭性导管癌中尤为明显[3]。通过体外和体内研究一致表明，耗尽或敲除LIMD2可以抑制肿瘤进展。其机制涉及癌细胞迁移的减少和 focal adhesion 动态的破坏，从而共同降低了转移能力[4]。此外，LIMD2的失活已被证明可以减弱关键的致癌信号通路，包括整合素连接激酶（ILK）、上皮-间质转化（EMT）和MAPK/ERK级联反应，这些通路与肿瘤的侵袭性密切相关[5]，[6]。LIMD2-ILK相互作用在肿瘤进展中的关键作用得到了强调，因为其破坏会损害细胞迁移和转移潜力。从机制上讲，这种相互作用驱动了LIMD2介导的ILK激活，进而增强了 focal adhesion 的更新和肌动蛋白细胞骨架的重塑。乳腺癌（BC）仍然是全球女性中最常见的恶性肿瘤[7]。根据2020年全球癌症统计数据，乳腺癌的发病率超过了肺癌，估计有230万新病例，占所有新诊断癌症的11.7%，并且导致约68.5万人死亡，是全球第五大癌症相关死亡原因[8]。值得注意的是，敲低LIMD2显著削弱了高度侵袭性乳腺癌细胞的迁移能力[1]。

早期的结构研究已经确定了LIMD2的关键功能界面，并表明靶向其与整合素连接激酶（ILK）的相互作用是一种有前景的策略，以抑制肿瘤转移[1]，[9]，尽管针对这种蛋白的临床批准的小分子或肽类药物的报告很少。与此一致，初步研究也提出了LIMD2作为单克隆抗体和肽抑制剂开发的候选目标，强调了LIMD2是一个可行但尚未充分探索的抗癌药物发现目标[10]。因此，靶向LIMD2可能代表了一种抑制乳腺癌侵袭和进展的有前景的治疗策略。

肽类治疗剂作为一种有效的蛋白质抑制剂出现，具有高特异性、低毒性和靶向蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的能力，而这些相互作用通常被认为是“难以用传统小分子实现的”[11]，[12]。这些肽可以模仿天然配体或作为拮抗剂来阻断与疾病相关的蛋白质的活性，从而破坏参与癌症、炎症和其他病理状态的的关键信号通路[13]。基于肽的药物的成功不断得到证明，2019年的市场价值超过了700亿美元[14]。在乳腺癌和前列腺癌中，如促黄体生成激素（LHRH）激动剂如莱普罗利德和戈舍瑞林等激素相关肽被广泛用于抑制激素产生并减缓肿瘤进展[15]，[16]。此外，正在开发肽-药物偶联物（PDCs）和肿瘤导向肽等新兴策略，以增强靶向药物递送，减少全身毒性，并改善治疗效果[17]。在乳腺癌中，基于肽的药物具有显著的前景。在激素受体阳性的亚型中，LHRH激动剂通过降低雌激素水平来抑制肿瘤生长[18]。此外，针对肿瘤相关抗原的肽基疫苗，如HER2衍生肽，正在研究其诱导强效抗肿瘤免疫反应的潜力，特别是在三阴性乳腺癌（TNBC）等具有挑战性的病例中[19]。

肽基药物的设计通常涉及几种关键方法。目标识别和肽筛选技术，如噬菌体展示、mRNA展示和组合肽库被用来发现具有高结合亲和力和特异性的肽序列[20]。基于结构的设计起着关键作用，使用X射线晶体学、NMR光谱和分子对接等方法来分析肽-目标复合物的三维结构[21]。这种结构洞察用于指导肽的合理优化，以改善结合相互作用和生物活性。鉴于天然肽在体内通常不稳定或迅速降解，经常引入化学修饰以提高其稳定性、生物利用度和半衰期[22]。由于相对较低的实验成本，肽类药物的合理设计越来越受到关注。肽类药物的设计通常是一个自上而下的过程：从构建肽库开始，然后通过分子对接识别高亲和力候选物，最后通过体外测试验证生物活性肽[23]。最近，生成式深度学习方法的发展，如RFDiffusion[24]、ProteinMPNN[25]和RFDesign[26]，为基于蛋白质的结合剂的开发提供了新的策略。

同时，出现了几种以肽为重点的生成性和引导性设计框架。例如，PepPrCLIP利用对比学习来优化肽-蛋白质识别[27]，EvoBind整合进化信息用于肽结合剂发现[28]，PepMLM应用掩码语言模型进行肽-蛋白质相互作用预测[29]，PepTune通过大规模变换器模型探索序列优化[30]。这些方法主要强调在有限的结构约束下进行序列级生成或亲和力预测。然而，在本研究中，我们的设计目标是在LIMD2的预定义溶剂可及腔体内生成α-螺旋肽骨架，这一过程由分子动力学分析得出的空间锚定残基指导。这种结构条件下的骨架放置需要对肽的方向和二级结构稳定性进行明确的几何控制。因此，我们选择了RFDiffusion，它能够在空间约束下从头生成骨架，并且与下游的结构优化工作流程兼容。

在这项研究中，我们探索了针对LIMD2（一种相对简单且较小的蛋白质靶标）的肽结合剂的从头设计。首先，我们进行了分子动力学（MD）模拟，以揭示LIMD2在溶液中的动态行为，从而指导潜在结合位点的识别。基于这些发现，我们使用RFDiffusion（一种通过扩散模型迭代优化新蛋白质结构的深度学习方法）设计了肽骨架。鉴于在溶液中10-12个残基的骨架跨度是灵活的，我们旨在选择一个能够形成稳定二级结构的骨架。在选择骨架后，我们使用了ProteinMPNN（一个基于深度学习的模块），该模块通过学习已知蛋白质结构的模式来优化序列-结构兼容性，以分配与α-螺旋支架最兼容的氨基酸序列。该模块迭代评估残基相互作用和空间约束，生成了一组预计能够稳定折叠的同时保持目标骨架构象的多样化序列。为了快速缩小候选库的范围，我们使用了PepPAP（一种基于深度学习的方法）来预测肽-蛋白质结合亲和力[31]。最后，使用Rosetta和FlexPepDock[32]来优化结合相互作用并预测顶级肽与LIMD2的结合亲和力。我们使用等温滴定量热法（ITC）实验验证了这些候选物的结合亲和力，并在乳腺癌细胞上进行了体外研究。基于阳性结果，我们进一步通过MD模拟研究了结合机制。

材料

重组人LIMD2蛋白（His标记，纯度>90%）购自（ab167895，Abcam，上海，中国）。购买LIMD2蛋白后进行SDS-PAGE验证（图S1）。所有肽均使用固相肽合成（SPPS）技术合成，并从GenScript（南京，中国）获得。它们的纯度通过高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）确认，超过了90%。细胞培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素...

针对LIMD2的结合骨架的合理设计

为了设计针对LIMD2的肽结合剂，我们最初旨在识别一个在肽结合时能够稳定整体结构的内部对接位点。然而，LIMD2的结构分析显示其结构由一个α-螺旋和四个短β-链组成，其间散布着多个灵活的环，表明该结构缺乏整体刚性（图1A）。MD模拟显示环区域（特别是K60和G80附近）具有高度灵活性，不太可能形成...

结论和研究局限性

在这项研究中，我们开发了一种基于结构的从头设计流程，用于生成和验证针对LIMD2的肽抑制剂，LIMD2是一种与癌症进展有关的LIM结构域蛋白，但目前缺乏特定的治疗调节剂。通过详细的MD模拟，我们确定了LIMD2上适合结合剂结合的结构稳定且溶剂可及的腔体。利用RFdiffusion和ProteinMPNN，我们成功生成了螺旋肽骨架和相应的序列...

CRediT作者贡献声明

黄秋燕：验证、资源提供、数据分析、概念化。余玉帅：数据分析、数据管理、概念化。黄凯：可视化、方法论。朱正文：验证、软件。王兴龙：可视化、监督。宋创伟：写作-审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念化。

资金声明

本研究得到了福建省自然科学基金（2024?J011084）和吴洁平医学基金会（320.6750.2025-21-46）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们衷心感谢福建省自然科学基金（2024?J011084）和吴洁平医学基金会（320.6750.2025-21-46）提供的财务支持。