通过DART-MS技术对大麻进行法医分析时检测到的质子化大麻素二聚体进行研究：一项结合质谱与计算的方法

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Investigating the Protonated Cannabinoid Dimer Detected in the Forensic Analysis of Cannabis by DART-MS: A Combined Mass Spectrometry and Computational Study

　　高分辨率图像
下载MS PowerPoint幻灯片

实时直接分析——高分辨率质谱（DART-HRMS）能够快速对大麻样本进行化学分析。这种方法在标称m/z 315处显示出一个明显的信号，这是质子化异构大麻素（如Δ9-四氢大麻酚（Δ9-THC）、大麻二酚（CBD）、大麻色烯（CBC）、Δ8-THC和大麻酸（CBT）的特征。有趣的是，这些大麻素的标准品光谱在标称m/z 629处也显示出一个峰，对应于质子化的二聚体物种[2M + H]+。为了阐明这些离子的可能结构，对五种大麻素的质子化同聚体和异聚体组合进行了密度泛函理论计算。计算表明，CBDH+••CBD、Δ9-THCH+••Δ9-THC和Δ8-THCH+••CBC是最稳定的。群体分析进一步显示了温度依赖性，在240 K以下Δ8-THCH+••CBC是主要物种，而在240–800 K范围内CBDH+••CBD变得最为丰富。这些发现意味着，在DART气体温度为623 K时，在大麻中检测到的m/z 629处的峰主要归因于CBDH+••CBD。相反，由于大麻中的CBD含量极低，因此预计大麻不会在m/z 629处显示该质量峰。实验性的DART-HRMS和场脱附（FD）-MS测量验证了这一预测。结果支持这样的结论：在m/z 629处观察到的峰代表CBDH+••CBD加合物，而不是大麻的天然产物分子标记物，并且它提供了一种快速可靠的质量方法，通过DART-HRMS区分大麻和大麻。

特别问题
作为《美国质谱学会杂志》“质谱在安全和法医应用”特刊的一部分发表。

1. 引言
根据《联合国麻醉药品单一公约》，大麻属植物（其中最常见的是C. sativa）被列为第一类毒品。(1) 尽管如此，它仍然是世界上使用最广泛的精神活性物质。根据不同国家的规定，持有这些物质的处罚从轻微的（例如，持有少量属于轻罪或非刑事违法行为）到死刑不等。由于销售、持有和使用的潜在风险非常高，负责确保法律遵守的执法机构必须拥有可靠的方法来确认其身份。在这方面，世界各地的犯罪实验室一直依赖气相色谱-质谱（GC-MS）分析来检测其主要精神活性成分Δ9-四氢大麻酚（Δ9-THC），并通过光学显微镜观察植物材料中的特征性毛状结构（囊状毛）来确认物质是否为大麻。

使大麻立法复杂化的因素之一是，有些大麻品种作为农业商品具有经济价值，用于工业和商业用途。在美国，联邦政府通过2018年《农业改进法案》将大麻分为两类：正式定义中，大麻是指干重中Δ9-THC含量≤0.3%的植物材料，而Δ9-THC含量>0.3%的则被视为大麻。(2) 由于前者是合法产品，后者是受处罚的第一类物质，因此执法机构有责任对查获的材料进行鉴定，以确定其是否为合法的大麻或非法的大麻。这非常繁琐，因为量化THC浓度需要时间；常规分析所需的消耗品成本高昂；并且需要大量人力资源来进行分析。因此，人们正在努力开发能够快速高效地法医区分大麻和大麻的方法，以克服上述挑战。在可用的替代方法中，环境电离质谱（AIMS）方法似乎特别适合，因为可以绕过样品制备步骤，直接分析原始形式的样品，分析通量高，消耗品使用量少，与常用传统方法相比节省了大量时间。

目前，在美国犯罪实验室中，实时直接分析——高分辨率质谱（DART-HRMS）的应用最为广泛。虽然它通常不用于确认性分析（因为它不像GC-MS那样使用色谱维度来提供额外的样品鉴定信息），但它可以通过快速筛选样品来指示是否存在特征性大麻素，从而缩短分析时间。然而，如果DART-HRMS的应用能够扩展到定量目标分析物以及区分大麻和大麻，其在犯罪实验室中的实用性将进一步提高。最近的研究表明，DART-MS可用于快速定性检测植物材料和其他复杂基质（如食品和个人护理产品）中的植物大麻素。(3,4) 还有研究表明，对DART-MS得到的化学谱进行多变量统计分析可以实现对大麻品种的分类。(5) 另一项研究将化学计量学应用于大麻DART-MS数据，成功以100%的准确率区分了大麻和大麻。(6) 在该研究中，确定了有助于随机森林预测模型正确分类大麻和大麻样品的最重要的m/z值子集，其中最重要的是在大麻样品中观察到的m/z 629处的质量，该质量与[2 x C21H30O2 + H]+相对应。C21H30O2的分子式对应于Δ9-THC及其异构体，因此m/z 629可能代表C21H30O2分子的质子化二聚体。

在DART-MS中，检测到分析物的质子化二聚体并不罕见。例如，在哈瓦那辣椒的DART-HRMS分析中检测到了辣椒素（化学式C18H27NO3）的质子化二聚体。(7) 对硝酸酯炸药前体糖醇的DART-HRMS分析显示了铵加合物单体[M + NH4]+、质子化二聚体[2M + H]+和铵加合物二聚体[2M + NH4]+。(8) 然而，虽然m/z 629处的质量可能是C21H30O2的质子化二聚体，但从原理上讲，该质量也可能代表一种缩合二聚体（即大麻的特异性天然产物二聚体的质子化形式）。最近，一类植物大麻素缩合二聚体通过高分辨率电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）、GC-MS和核磁共振（NMR）光谱进行了分离和结构鉴定。(9,10) 它们包括大麻二酚（CBD）的缩合二聚体（CBDCD）和THC的缩合二聚体（THCCD）。(9) 这两种二聚体都由两个大麻素单元通过亚甲基桥连接。(9,10) (见图1) 这些分子的发现可能表明存在其他大麻素缩合二聚体或其他天然产物，这些产物可以解释在DART-HRMS分析中观察到的m/z 629。在这项工作中，我们试图确定m/z 629的身份，因为它是一个可靠的标记物，能够通过DART-HRMS快速准确地识别大麻植物材料。

图1
图1. 大麻植物材料中发现的代表性大麻素异构体和THC及CBD的缩合二聚体（分别为THCCD和CBDCD）。这些异构体的化学式均为C21H30O2（计算值314.2246）。

如果m/z 629是C21H30O2分子的质子化二聚体，那么有几种可能性，因为这种单体式对应于Δ8-THC、Δ9-THC、Δ10-THC、CBD、大麻色烯（CBC）、大麻环醇（CBL）和大麻酸（CBT）(见图1)。这些包括各种同聚体，如[Δ8-THC••Δ8-THC + H]+、[Δ9-THC••Δ9-THC + H]+、[CBD••CBD + H]+、[CBC••CBC + H]+和/或[CBT••CBT + H]+，以及由不同大麻素异构体对组成的各种异聚体组合。另一方面，m/z 629也可能代表大麻特有的天然代谢物的质子化前体。本研究结合了DART-MS、计算化学和场脱附质谱（FD-MS）来研究由Δ8-THC、Δ9-THC、CBD、CBC和CBT组成的质子结合大麻素二聚体及其存在的可能性。其他Δ9-THC异构体（如Δ10-THC和CBL）未包括在内，因为它们在大麻中的含量极低。理论计算提供了优化的几何结构、结合能以及解释可能复合物相对稳定性的相互作用类型。结合能计算和群体分析揭示了质子结合二聚体的身份及其丰度，以及DART-HRMS测量时的温度依赖性。此外，FD-MS研究表明，m/z 629并不是仅存在于大麻中的独特缩合二聚体的结果。

2. 实验和理论方法
2.1. 化学标准和气体
Δ8-THC、Δ9-THC、CBD、CBC和CBT大麻素的标准参考品购自Cayman Chemical（美国密歇根州安娜堡）。聚乙二醇（PEG 600）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。氮气和超高纯度氦气购自AirGas（美国路易斯安那州巴顿鲁日）。

2.2. DART-HRMS方法
质谱采用IonSense Inc.（美国马萨诸塞州索格斯）的DART-SVP离子源以正离子模式收集，该离子源与JEOL AccuTOF高分辨率飞行时间（TOF）质谱仪（美国马萨诸塞州皮博迪）相连。DART源的设置如下：栅极电压250 V；气体温度350 °C；氦气流量2 L/min。质谱仪的设置如下：孔径1电压20 V；环形透镜电压和孔径2电压5 V；峰值电压600 V；检测器电压2100 V；分辨率10,000（半高宽fwhm）；质谱数据采集速率每秒2个谱图；质量范围m/z 60–1000。所有大麻素溶液均采用毛细管采样方法进行DART-HRMS分析。该方法涉及将玻璃熔点毛细管（Corning Incorporated，美国马萨诸塞州特克斯伯里）的封闭端浸入溶液中，并将其置于DART离子源和质谱仪入口之间的开放间隙中约5秒。每种溶液重复分析三次，所有采集均使用PEG 600作为质量校准物。质谱转换、校准、平均、背景减除和峰中心化使用msAxel软件（JEOL USA，马萨诸塞州皮博迪）完成。质谱分析使用RBC Software（美国新罕布什尔州朴次茅斯）的Mass Mountaineer软件套件进行。

将0.1 mL的Δ8-THC、Δ9-THC、CBD、CBC和CBT标准参考物质（CRMs）（甲醇中的浓度为1000 μg/mL）分别置于不同的小瓶中（VWR International LLC，美国宾夕法尼亚州拉德诺）。再将所有五种CRMs的0.1 mL混合物置于一个单独的小瓶中，总体积为0.5 mL的大麻素混合物。蒸发掉所有六个小瓶中的甲醇溶剂。每个小瓶中剩余的固体残留物（每种化合物100 μg，混合物总共500 μg）用0.05 mL（50 μL）甲醇重新配制。最终，Δ8-THC、Δ9-THC、CBD、CBC和CBT化合物在溶液中的浓度以及大麻素混合物的浓度均为2,000 μg/mL。在DART-HRMS分析前，样品需涡旋以确保化合物完全溶解。

2.3. FD-HRMS方法
场脱附（FD）质谱使用配备电子电离/场电离/场脱附（EI/FI/FD）离子源的JEOL AccuTOF GC-Alpha反射飞行时间质谱仪获得。将约1 μL的Δ9-THC和（单独的）CBD CRMs（甲醇中的浓度为1000 μg/mL，Cerilliant，美国德克萨斯州朗德罗克）作为液体接头施加到JEOL 10-μm场脱附发射器上，使用JEOL场脱附采样装置。FD发射器被加热到40 mA，并以每分钟26 mA的速率升温，以解吸样品。质谱的分辨率设置为30,000 fwhm，m/z范围为10–800，光谱采集速率为每秒1个谱图。质谱仪在EI模式下使用全氟三戊基胺（Scientific Instrument Services，美国新泽西州Ringoes）进行校准，以确保质量测量的准确性。在FD测量的最后0.5分钟内，通过自动参考入口引入十八烷基环四硅氧烷（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）作为质量漂移校正剂。

2.4 计算方法
起始反应物及其各种可能的质子结合二聚体复合物的几何结构使用M06–2X混合密度泛函理论（DFT）（11）以及标准的Pople型6–311++G(2d,2p)基组（12,13）进行了完全优化。据报道，M06–2X泛函在确定多种化学应用的能量和氢键相互作用方面表现出优异的性能（11,14?16）。选择M06–2X泛函主要是因为其高可靠性和相对较低的计算成本。进行了谐振振动频率计算，以表征势能面上所有局部最小值对应的结构。本研究中检查的所有单体和各种可能的质子结合二聚体复合物仅显示出正频率，未检测到虚频率。零点振动能量校正采用了M06–2X/6–311+G(2d,2p)水平的缩放因子0.967（17,18）。我们还使用较大的6–311++G(3df,3pd)基组，在相同的M06–2X水平下对反应物和所有可能的质子结合二聚体复合物进行了单点能量计算，以获得更准确的结果。所有反应物和质子结合二聚体的最终能量是使用在M06–2X/6–311++G(3df,3pd)水平下获得的单点能量计算得出的，并应用了在M06–2X/6–311+G(2d,2p)水平下获得的零点能量（ZPE）校正。所有可能的质子结合二聚体的结合能（ΔEbind）使用公式1计算得出。每个质子结合二聚体的结合能是相应质子结合二聚体的能量与相应的质子化单体和中性单体能量之和之差。
Δ??bind=??dimer?(??R1+??R2)

在公式1中，Edimer表示质子结合二聚体的能量，??R1和??R2分别表示它们的质子化和中性单体的能量。此外，我们还使用公式2估算了所有研究的质子结合二聚体的焓（ΔH）。
Δ??=??dimer?(??R1+??R2)

在公式2中，Hdimer表示质子结合二聚体的焓，??R1和??R2分别表示它们的质子化和中性单体的焓。所有质子结合二聚体的结合能和焓都是相对于它们在M06–2X/6–311++G(3df,3pd)//M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平下的相应分离单体计算的。所有电子结构计算均使用Gaussian 16软件（19）完成。在支持信息中提供了在M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平下优化的所有反应物、质子化单体和质子化二聚体的Gaussian输出文件。

我们研究了温度对本文考虑的各种可能的质子结合同质和异质二聚体种群的影响。通过使用公式3（20,21）计算每个质子结合二聚体的摩尔分数（Xi）来进行种群分析。
X??=????exp(?Δ??RT)∑????=1????exp(?Δ??RT)

在公式3中，R是气体常数，T是绝对温度（以K为单位），ΔH表示第i个质子结合二聚体在绝对零度下的相对生成热。配分函数（qi）是相应质子结合二聚体的平动、振动、旋转和电子配分函数的乘积。这些配分函数是根据使用当前M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平计算得到的振动频率和旋转常数计算得出的。使用标准的统计力学公式来计算配分函数（22）。所有质子结合二聚体的ΔH值是在M06–2X/6–311++G(3df,3pd)//M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平下计算的（见表S1）。

3. 结果与讨论
3.1 大气压电喷雾质谱（DART-HRMS）分析大麻、大麻素Δ9-THC及其大麻素异构体
如前所述，可以通过对大麻和大麻素的DART-HRMS谱图进行化学计量处理来轻松准确地区分它们（6）。此外，发现一个对大麻具有诊断性的关键质量是标称m/z 629。图2显示了大麻和大麻的代表性DART质谱图，分别说明了m/z 629的存在与否。由于这个质量与[2M + H+]一致，其中M对应于C21H30O2，而这个公式又与几种Δ9-THC异构体相对应，我们首先确定了对纯化的Δ9-THC及其在大麻植物材料中常见的异构体的DART-HRMS分析是否也会显示这个质量。图2显示了在软电离条件下（即孔径电压为20 V）以正离子模式获得的Δ8-THC、Δ9-THC、CBD、CBC和这五种大麻素混合物的代表性DART质谱图。每种溶液在标称m/z 315处都显示了一个基峰，这与Δ8-THC、Δ9-THC、CBD和CBT的质子化质量[M + H]+（[C21H30O2 + H]+）在m/z 315处一致。m/z 60–314范围内的较低强度峰（即低于质子化前体离子的强度）表明发生了某种程度的碎片化或存在杂质。在[M + H]+以上检测到的峰（即在这种情况下大于m/z 315）通常表明形成了各种加合物。特别是在所有样品中都检测到一个标称m/z 629的峰，其相对强度分别为CBT、CBD和Δ9-THC中的0.03%，Δ8-THC中的0.04%，以及CBC中的0.7%，其高分辨率质量与两种化学式为C21H30O2的前体分子的质子化质量一致（即[(C21H30O2)2 + H]+或[2M + H]+），对应于质子化的同质二聚体：Δ8-THCH+••Δ8-THC、Δ9-THCH+••Δ9-THC、CBDH+••CBD、CBCH+••CBC和CBTH+••CBT。对于含有等量Δ8-THC、Δ9-THC、CBD和CBT的溶液，[2M + H]+可能表明存在质子化的同质二聚体或一种（或多种）可能的质子化异质二聚体（例如CBD••Δ9-THC、CBC••CBT、Δ9-THC••CBT等）。鉴于纯化的Δ9-THC及其异构体在其DART质谱图中都显示了与[2M + H+]一致的峰，并且这些化合物通常存在于植物材料中，我们接下来通过评估可能的同质和异质二聚体的相对稳定性来确定m/z 629的结构身份，从而判断哪种可能性最大。这是通过计算方法来实现的。

图2
图2. 大麻（THC浓度15%w/w）和大麻（THC浓度0.07%w/w）花；Δ8-THC、Δ9-THC、CBD、CBC和CBT溶液；以及Δ8-THC + Δ9-THC + CBD + CBC + CBT混合物的DART质谱图。标称m/z 315处的峰代表[M + H]+峰，而在m/z 629处检测到的峰表明存在质子结合的大麻素二聚体[2M + H+]。

3.2 大麻素二聚体的理论计算
3.2.1 CBD、Δ9-THC、CBC、Δ8-THC和CBT的优化几何结构确定
CBD、CBC、Δ9-THC和CBT是构型异构体。它们在M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平下获得的优化几何结构如图3所示。与先前的研究一致（23），CBD的结构显示了两个酚类?OH基团的氧原子与环己烯环上的H原子之间的两个分子内氢键，计算得到的O••H距离分别为2.26 ?和2.33 ?。在Δ9-THC的情况下，结构显示了酚类?OH基团的氧原子与环己烯环上两个不同H原子之间的两个分子内氢键，O••H距离分别为2.62 ?和2.73 ?。CBC结构有一个酚类?OH基团，但其双环系统中的醚氧没有定向或配置成能够形成稳定的分子内氢键。因此，CBC缺乏适合的供体-受体对来进行分子内氢键结合。相比之下，Δ8-THC的结构显示了酚类?OH氧与环己烯环上两个不同H原子之间的两个分子内氢键，O••H距离分别为2.29 ?和2.87 ?。CBT结构由四个融合的环组成，使分子处于紧凑的构象中。两个醚氧通过吸引电子密度和缓解环应变来增强其稳定性（见图3）。这些结构特征共同使得CBT比本研究中研究的其他大麻素更稳定。在ZPE校正后的M06–2X/6–311++G(3df,3pd)//M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平下计算的相对能量表明，Δ9-THC、Δ8-THC和CBT比CBD稳定约13.8、18.1和19.0 kcal mol–1，而CBC比CBD稳定约0.5 kcal mol–1。

图3
图3. 在M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平下优化的CBD、CBC、Δ9-THC、Δ8-THC和CBT的几何结构。灰色、白色和红色分别代表碳、氢和氧原子。

3.2.2 质子化CBD、Δ9-THC、CBC、Δ8-THC和CBT的优化几何结构确定
为了更深入地了解本研究中观察到的质谱特征，采用了DFT计算来研究CBD、Δ9-THC、CBC、Δ8-THC和CBT的潜在质子结合二聚体结构。作为初步步骤，优化了所有五种大麻素单体的质子化形式，以评估它们相应二聚体的结构可能性。根据它们不同的化学环境，在所有分子中识别出多个质子化位点，并相应地进行了标记（见图S1）。从这项分析中可以看出，CBD和Δ8-THC具有9个不同的质子化位点，而CBT、Δ9-THC和CBC分别具有5个、10个和11个可能的质子化位点。这些质子化单体的完全优化结构分别显示在图S2–S6中。

3.2.3 同质二聚体的能量和结构确定
接下来，在相同的理论水平上探讨了可能的质子结合同质二聚体CBDH+••CBD、THCH+••THC、CBCH+••CBC、Δ8-THCH+••Δ8-THC和CBTH+••CBT的结构。在M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平下优化的CBD和Δ9-THC的三个最稳定结构如图4所示，而图5展示了在同一理论水平下优化的CBC、Δ8-THC和CBT的质子结合同质二聚体的最稳定结构。其余较不稳定的结构显示在图S7–S14中。以图4a和S7中的CBD为例，各种可能的质子化CBD同质二聚体复合物的结构被标记为CBDH+-X••CBD（X = 1–9），其中X = 1–9表示CBD内质子化位点的不同结构（见图S1）。各种可能的结合相互作用用CBD的质子化单体和中性CBD分子之间的虚线表示。此外，在这些图（图S7–S14）中显示了在M06–2X/6–311++G(3df,3pd)//M06–2X/6–311++G(2d,2p)理论水平下获得的所有质子结合大麻素同质二聚体的结合能值。

图4
图4. 在M06–2X/6–311++G(2d,2p)理论水平下优化的CBD和Δ9-THC的三个最稳定的质子结合同质二聚体结构：(a) 质子化的CBD与中性CBD相互作用；(b) 质子化的Δ9-THC与中性Δ9-THC的?OH基团相互作用；(c) 质子化的Δ9-THC与中性Δ9-THC中的吡喃环的O原子相互作用。键长以?为单位。结合能（B.E.）是在M06–2X/6–311++G(3df,3pd)//M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平下计算的。碳、氢和氧原子分别用灰色、白色和红色表示。

图5
图5. 在M06–2X/6–311++G(2d,2p)理论水平下优化的CBC、Δ8-THC和CBT的三个最稳定的质子结合同质二聚体结构：(a) 质子化的CBC与中性CBT中的吡喃环的O原子相互作用；(b) 质子化的Δ8-THC与中性Δ8-THC中的吡喃环的O原子相互作用；(c) 质子化的CBT与中性CBT中的O原子相互作用。键长以?为单位。结合能（B.E.）是在M06–2X/6–311++G(3df,3pd)//M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平下计算的。碳、氢和氧原子分别用灰色、白色和红色表示。

图4a和图S7的结果表明，CBDH+-2••CBD同质二聚体的结构最稳定，其结合能为?60.0 kcal mol–1。在这个二聚体中，最初结合在C2位点的质子迁移到C3位点，形成CBDH+-2••CBD二聚体。这种二聚体的高稳定性主要源于质子化CBD的苯环上的H原子与中性CBD的O原子之间的分子间氢键，其键长为2.58 ?。此外，还有三种其他的氢键相互作用也对其稳定性有所贡献：一种是质子化CBD中的–OH基团的H原子与中性CBD分子中的OH基团的O原子之间的氢键，键长为1.71 ?；另外两种是中性CBD分子中的?CH2基团的H原子与质子化CBD中的–OH基团的O原子之间的氢键，相应的H–O键长分别为2.48 ?和2.69 ?。在本研究中鉴定出的所有其他可能的质子结合CBD同二聚体中也观察到了类似的氢键相互作用（见图4a和图S7）。结果表明，这些质子结合CBD同二聚体的结合能范围为10.5至24.5 kcal mol–1（见图4a和图S7）。这表明CBDH+-2••CBD同二聚体的稳定性比其他可能的质子化CBD二聚体高出约35.5–49.5 kcal mol–1。计算出的结合能表明，除了CBDH+-2••CBD外，其他不太稳定的质子结合CBD同二聚体不太可能对整体群体产生显著影响。

在研究的下一步中，Δ9-THC的质子结合同二聚体（THCH+••THC）也在相同的理论水平上进行了优化。各种可能的Δ9-THCH+••Δ9-THC结构被标记为THCH+-Y••THC（Y = 1–10），其中Y表示THC内的质子化位点，这些结构分别显示在图4b、4c、S8和S9中。THC具有一个三环结构，包括一个与吡喃环融合的苯环，以及一个连接到苯环上的–OH基团。由于这种结构排列，质子化的THC可以通过两种主要的结合模式与第二个THC分子发生分子间相互作用。在第一种模式下，质子化的Δ9-THC通过氢键与中性Δ9-THC分子中的–OH基团相互作用（见图4b和图S8）；在第二种模式下，质子化的Δ9-THC与中性Δ9-THC分子中的吡喃环的氧原子形成氢键（见图4c和图S9）。通过探索这些不同的结合模式，确定了最稳定的Δ9-THC质子结合二聚体结构。图4b和S8的结果表明，THCH+-6••THC是最稳定的同二聚体，其结合能为?48.5 kcal mol–1，而其他可能的Δ9-THC同二聚体的结合能较低。在几何优化过程中观察到，最初位于C6位置的质子移动到了C5位置，从而形成了THCH+-6••THC二聚体（见图S1和图4b）。优化后的结构显示，THCH+的H原子与中性THC的O原子之间存在一个分子间离子氢键（IHB），键长为2.18 ?；同时，中性THC的吡喃环的O原子与质子化THC的–OH基团的H原子之间也存在一个氢键，键长为2.90 ?。在所有其他可能的质子化THC同二聚体及其与中性THC分子中的–OH基团的相互作用中也观察到了类似的IHB和普通氢键相互作用。根据这些结果，THCH+-6••THC二聚体的稳定性比其他同二聚体高出15.5–35.4 kcal mol–1。

图4c和S9的结果显示，THCH+-2••THC二聚体的结合能为?60.8 kcal mol–1，表明其稳定性高于其他可能的同二聚体，在这种二聚体中，质子化的THC与中性THC的吡喃环的O原子相互作用。在几何优化过程中观察到，最初位于C2位置的质子移动到了C3位置，形成了THCH+-2••THC二聚体（见图4c和S3）。优化后的结构显示，质子化的Δ9-THC的氢原子与中性THC的吡喃环的氧原子之间存在一个IHB，键长为2.51 ?；此外，中性THC的吡喃环的O原子与质子化THC的–OH基团的H原子之间还形成了一个常规氢键，键长为1.84 ?。这些相互作用使得THCH+-2••THC二聚体的稳定性比其他二聚体配置高出约6.0–46.5 kcal mol–1。在由Δ9-THC形成的其他潜在同二聚体中也观察到了类似的相互作用模式。结合能计算表明，涉及质子化Δ9-THC与中性Δ9-THC的吡喃环O原子相互作用的二聚体在能量上比涉及与中性Δ9-THC分子中的–OH基团相互作用的二聚体更有优势。

研究了由质子化的CBC和中性CBC分子形成的各种可能的质子结合CBCH+••CBC同二聚体，相应的质子化CBC单体结构显示在图S4中。通过质子化CBC与CBC单体中的O位点或–OH位点相互作用形成的各种可能的质子结合CBC同二聚体的优化结构分别显示在图5a以及图S10和S11中。在这些图中，各种可能的CBCH+••CBC同二聚体的结构被标记为CBCH+-Z••CBC（Z = 1–11），其中Z表示CBC内的质子化位点，这些结构显示在图S1和S4中。从图5a可以看出，最稳定的结构是CBCH+-1••CBC，其结合能为?42.1 kcal mol–1。这种稳定性主要归因于质子化氧原子（位于酚基团中）与中性CBC中的二氢吡喃环的氧原子之间形成的强分子间IHB，键长为1.47 ?。此外，质子化CBC中的羟基的O原子与中性CBC的酚环上的H原子之间还存在另一个分子间氢键，键长为2.98 ?。结果表明，CBCH+-1••CBC的稳定性比该类其他可能的二聚体高出约16.0–28.6 kcal mol–1。其他可能的质子化二聚体复合物的稳定性主要是由于分子间IHB相互作用的结果，这些相互作用类似于CBCH+-1••CBC结构中的相互作用（见图5a和图S10）。

还研究了由质子化的CBC与CBC的–OH基团相互作用形成的各种可能的质子结合CBCH+••CBC同二聚体，相应的质子化CBC单体结构显示在图S4中。通过质子化CBC与CBC单体中的O位点或–OH位点相互作用形成的各种可能的质子结合CBCH+••CBC同二聚体的优化结构分别显示在图5a以及图S10和S11中。从图5a可以看出，最稳定的结构是CBCH+-1••CBC，其结合能为?42.1 kcal mol–1。这种稳定性主要得益于质子化氧原子（位于酚基团中）与中性CBC中的二氢吡喃环的氧原子之间形成的强分子间IHB。此外，质子化CBC中的羟基的O原子与中性CBC的酚环上的H原子之间还存在一个常规氢键，键长为2.98 ?。这些相互作用使得CBCH+-1••CBC二聚体的稳定性比其他二聚体配置高出约6.0–46.5 kcal mol–1。在由Δ9-THC形成的其他潜在同二聚体中也观察到了类似的相互作用模式。结合能计算表明，涉及质子化Δ9-THC与中性Δ9-THC的吡喃环O原子相互作用的二聚体在能量上比涉及与中性Δ9-THC分子中的–OH基团相互作用的二聚体更有优势。

研究了由质子化的CBC和中性CBC分子形成的各种可能的质子结合CBCH+••CBC同二聚体，相应的质子化CBC单体结构显示在图S4中。通过质子化CBC与CBC单体中的O位点或–OH位点相互作用形成的各种可能的质子结合CBCH+••CBC同二聚体的优化结构分别显示在图5a以及图S10和S11中。在这些图中，各种可能的CBCH+••CBC同二聚体的结构被标记为CBCH+-Z••CBC（Z = 1–11），其中Z表示CBC内的质子化位点。从图5a可以看出，最稳定的结构是CBCH+-1••CBC，其结合能为?42.1 kcal mol–1。这种稳定性主要归因于质子化氧原子（位于酚基团中）与中性CBC中的二氢吡喃环的氧原子之间形成的强分子间IHB，键长为1.47 ?。此外，质子化CBC中的羟基的O原子与中性CBC的酚环上的H原子之间还存在另一个分子间氢键，键长为2.98 ?。结果表明，CBCH+-1••CBC的稳定性比该类其他可能的二聚体高出约16.0–28.6 kcal mol–1。其他可能的质子化二聚体复合物的稳定性主要是由于分子间IHB相互作用的结果，这些相互作用与CBCH+-1••CBC结构中的相互作用类似（见图5a和图S10）。

还研究了由质子化的CBC与CBC的–OH基团相互作用形成的几种潜在的CBCH+••CBC二聚体。根据图S11中的结果，CBCH+-1••CBC结构是这一系列二聚体中最稳定的，其结合能为约?32.9 kcal mol–1。这种稳定性源于质子化CBC中的羟基的H原子与另一个CBC中的羟基的O原子之间的分子间IHB。其他剩余的质子化CBC二聚体的结合能范围为?10.4至?25.4 kcal mol–1。这些值表明，这些复合物的稳定性比CBCH+-1••CBC结构低约7.5–22.5 kcal mol–1。在所有质子化CBC二聚体复合物中也观察到了类似的离子和普通氢键相互作用（见图S11）。

通过质子化的Δ8-THC与另一个Δ8-THC的O位点或–OH位点相互作用，形成了各种可能的Δ8-THC质子结合同二聚体。所得到的各种可能的Δ8-THCH+-N••Δ8-THC（N = 1–9）同二聚体分别显示在图5b、S12和S13中。图5b和S12表明，Δ8-THCH+-6••Δ8-THC是最稳定的，其结合能为?49.9 kcal mol–1。该二聚体的结构显示，Δ8-THCH+-6与另一个Δ8-THC分子的O位点之间存在一个强IHB相互作用，相应的键长为2.50 ?（见图5b）。此外，还观察到了氢键相互作用，键长为2.30 ?。这种二聚体结构的稳定性比其他可能的二聚体高出约4.5–31.3 kcal mol–1。这一类中较不稳定的同二聚体也具有类似的相互作用类型（见图5b和图S12）。图S13展示了通过质子化的Δ8-THCH+与中性Δ8-THC的OH基团相互作用形成的各种质子结合Δ8-THCH+••Δ8-THC同二聚体。最稳定的同二聚体结构是Δ8-THCH+-1与另一个Δ8-THC的–OH基团形成的复合物（见图S13），其结合能为约?33.5 kcal mol–1。其他可能的二聚体配置的结合能范围为?6.6至?30.0 kcal mol–1。这些结果表明，通过质子化Δ8-THC与另一个Δ8-THC单体的O位点相互作用形成的二聚体通常比通过–OH位点相互作用形成的二聚体更稳定（见图5b、S12和S13）。

通过考虑所有可能的质子化CBT异构体（见图S6）与中性CBT的相互作用，研究了CBTH+-M••CBT（M = 1–5）的质子结合同二聚体。识别出了多种质子结合二聚体结构，其中三种最稳定的结构显示在图5c中，其余的结构显示在图S14中。在这些结构中，CBTH+-3••CBT复合物的稳定性最高，其结合能为约?44.2 kcal mol–1，显著高于其他候选二聚体。结构分析显示，CBTH+-3中的质子转移到了相邻CBT分子的吡喃环的O原子上，形成了一个短的O–H键，键长为1.01 ?。这个质子同时与相邻苯环的碳原子发生稳定相互作用，增强了整体的结合强度。从能量上看，CBTH+-3••CBT比本研究中研究的其他CBT二聚体稳定约22.2–31.2 kcal mol–1（见图5c和S14）。

3.2.4. 杂二聚体的能量和结构确定

我们研究了CBD、Δ9-THC、CBC、Δ8-THC和CBT之间可以形成的各种质子结合杂二聚体。首先，我们使用上述相同的计算方法研究了CBD和Δ9-THC的质子结合杂二聚体（CBDH+••Δ9-THC和Δ9-THCH+••CBD）。从结构上看，CBD具有一个连接到环己烯环的苯环，苯环上连接有两个–OH基团；而THC具有一个由苯环和吡喃环融合而成的三环系统，并包含一个–OH基团。这些结构差异导致在形成杂二聚体时产生了不同的相互作用模式。质子化的CBD可以通过两种主要方式与Δ9-THC相互作用：一种是通过与Δ9-THC中的–OH基团形成氢键；另一种是通过与Δ9-THC中的吡喃环的O原子相互作用。同样，质子化的Δ9-THC也可以与中性CBD分子形成杂二聚体。最稳定的CBDH+-X••Δ9-THC（X = 1–9）和Δ9-THCH+-Y••CBD（Y = 1–10）类型的质子结合杂二聚体在M06–2X/6–311++G(2d,2p)理论水平上进行了优化，并在图6中展示。其他不太稳定的杂二聚体结构显示在图S15至S17中。结果表明，CBDH+-3••Δ9-THC是这类研究中稳定性最高的二聚体，其结合能为?51.8 kcal mol–1。这种二聚体的稳定性主要归因于质子化CBD的氢原子与Δ9-THC的OH基团氧原子之间的分子间IHB，键长为2.30 ?。在该复合物中还观察到了另外三个氢键：一个是质子化CBD的OH基团的氧原子与THC中的两个不同环己烯环氢原子之间的氢键，键长分别为2.60 ?和2.87 ?；另一个是吡喃环的O原子与质子化CBD中的–CH2基团的H原子之间的氢键，键长为2.91 ?（见图6a）。通过质子化CBD与Δ9-THC的–OH基团相互作用形成的其他可能的质子化二聚体的结合能范围为?10.3至?26.8 kcal mol–1（见图6a和图S15）。所有这些质子化二聚体复合物都表现出IHB和普通氢键相互作用以实现稳定性。这些结合能表明，它们的稳定性低于CBDH+-3••THC。因此，它们不会对整体群体产生显著贡献。

图6在M06–2X/6–311++G(2d,2p)理论水平上优化的CBD和Δ9-THC三种最稳定的质子结合异二聚体结构：(a)质子化的CBD与中性Δ9-THC的-OH基团相互作用；(b)质子化的CBD与中性Δ9-THC中吡喃环的O原子相互作用；(c)质子化的Δ9-THC与中性CBD相互作用。键长以埃为单位报告。结合能（B.E.）是在M06–2X/6–311++G(3df,3pd)//M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平上计算的。碳、氢和氧原子分别用灰色、白色和红色表示。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片。

根据图6b和S16所示的结果，CBDH+-3••THC被认为更稳定，其结合能为-51.1 kcal mol–1，这比质子化的CBD与中性Δ9-THC中的吡喃环的O原子相互作用时形成的其他可能的二聚体更稳定。在质子化的CBD的质子与中性Δ9-THC分子的羟基O原子之间观察到了分子间的氢键（IHB）相互作用，键长为2.70 ?。此外，在CBDH+-3••THC二聚体复合物中，还观察到了O-H键长为2.59和2.77 ?的分子间氢键。这一类别中其他可能二聚体的结合能介于-14.3至-39.7 kcal mol–1之间，表明它们的稳定性比CBDH+-3••THC二聚体低约14.8至37.0 kcal mol–1。目前的计算结果表明，由质子化的CBD与Δ9-THC的吡喃环的O原子相互作用形成的异二聚体比由质子化的CBD与Δ9-THC的-OH基团相互作用形成的异二聚体更稳定（见图6a、6b、S15和S16）。

当质子化的Δ9-THC与中性CBD分子相互作用时形成的三种最稳定的异二聚体结构显示在图6c中。其中，THCH+-6••CBD二聚体最为稳定，其结合能为-55.7 kcal mol–1。该结构清楚地显示了Δ9-THC的质子与中性CBD的羟基O原子之间的分子间氢键的形成，键长为2.41 ?。在所有THCH+••CBD二聚体中都观察到了类似的离子键和常规氢键相互作用。基于结合能的比较，THCH+-6••CBD比其他THCH+••CBD二聚体稳定约17.1–45.3 kcal mol–1。这表明这类中较不稳定的异二聚体（见图S17）在平衡条件下不太可能对总体分布产生显著影响。我们还发现，THCH+-6••CBD复合物的结合能比稳定的CBDH+-3••THC二聚体稳定3.9–4.6 kcal mol–1（见图6）。

接下来，我们研究了CBD和Δ9-THC与CBC、Δ8-THC和CBT的质子结合异二聚体。计算结果表明，CBDH+-2和Δ9-THCH+-2更倾向于与CBC、Δ8-THC和CBT形成稳定的复合物。这些二聚体最稳定的、经过完全优化的结构显示在图7中。具体来说，图7a展示了CBDH+-2与CBC、Δ8-THC或CBT单体相互作用形成的最稳定的CBD基异二聚体。图7b显示了由Δ9-THCH+-3与CBC、Δ8-THC或CBT单体结合形成的类似Δ9-THC基二聚体。由于预测较不稳定的异构体的数量可以忽略不计，因此只进一步分析了每组中最稳定的物种。在所有候选物中，CBDH+-2••CBC和Δ9-THCH+-3••Δ8-THC最为稳定，其结合能分别为-58.6和-45.4 kcal mol–1。这些异二聚体的稳定性分别比各自系列中的其他可能异二聚体高约2.9–35.2 kcal mol–1和3.8–12.8 kcal mol–1。结构分析表明，它们的增强稳定性源于氢键以及质子与苯环π电子密度之间的强相互作用（见图7）。

接下来，我们探讨了CBC与CBD、Δ9-THC、Δ8-THC和CBT的质子结合异二聚体的潜在形成。所有可能的质子结合异二聚体都是通过考虑质子化的CBC单体与任何一种中性分子（CBD、Δ9-THC、Δ8-THC或CBT）在同一理论水平上的相互作用来优化的。最稳定的质子结合异二聚体，即CBCH+••CBD、CBCH+••Δ9-THC、CBCH+••Δ8-THC和CBCH+••CBT，显示在图8a中。由于预计较不稳定的异构体的数量可以忽略不计，因此没有进一步研究较不稳定的质子结合二聚体。从图8a可以看出，CBCH+-1••CBD被确定为最稳定的复合物，其结合能为-42.8 kcal mol–1，比其他最稳定的CBC质子结合异二聚体稳定约1–2 kcal mol–1。此外，所有结构都表明CBCH+-1与其他大麻素（CBD、Δ9-THC、Δ8-THC和CBT）形成了最稳定的复合物。这些异二聚体中的相互作用特征是强氢键（IHB），键长范围为1.04至1.47 ?（见图8a）。

然后，我们研究了质子化的Δ8-THC与CBD、Δ9-THC、CBC和CBT的异二聚体形成。所有可能的二聚体都是使用相同的计算协议优化的，考虑了质子化的Δ8-THC物种与中性CBD、Δ9-THC、CBC或CBT分子之间的相互作用。最稳定的Δ8-THCH+••CBD、Δ8-THCH+••Δ9-THC、Δ8-THCH+••CBC和Δ8-THCH+••CBT配置显示在图8b中，而较不稳定的二聚体由于对二聚体总数的贡献可以忽略不计而被排除在外。在这些复合物中，Δ8-THCH+-6••CBC复合物最为稳定，其结合能为-61.2 kcal mol–1，比其他质子结合Δ8-THC二聚体稳定约3.2–14.9 kcal mol–1。在这些复合物中，Δ8-THCH+-6上的质子经常转移到相邻的苯碳原子上或Δ9-THC或CBT分子的吡喃环氧原子上，形成强氢键（见图8b）。此外，这些复合物中还包括与中性伴侣的苯环的传统氢键和质子-π相互作用（见图8b）。

在下一步中，研究了质子化的CBT（CBTH+）与中性大麻素CBD、Δ9-THC、CBC和Δ8-THC之间的质子结合异二聚体的形成。最稳定的复合物如CBTH+••CBD、CBTH+••Δ9-THC、CBTH+••CBC和CBTH+••Δ8-THC显示在图8c中。在CBT的质子化位点中，CBTH+-3异构体与所有四种大麻素的结合最强。CBTH+-3••CBD异二聚体被发现最为稳定，其结合能为-49.4 kcal mol–1，比其他异二聚体低约4.9–5.8 kcal mol–1。结构分析显示，质子从CBTH+-3的环碳原子转移到中性伴侣的羟基或吡喃环的氧原子上，然后与氧原子形成强分子间相互作用，并且还与中性分子的苯环π电子密度相互作用，键长范围为1.32至2.25 ?。

计算结果表明，任何质子化的单体都可以以多种方向与CBD、Δ9-THC、CBC、Δ8-THC或CBT相互作用。计算出的结合能表明，由Δ9-THC、CBC、Δ8-THC和CBT的吡喃环O位点上的相互作用形成的质子结合二聚体最为稳定。结果还表明，CBDH+-2••CBD和Δ9-THCH+-2••Δ9-THC的结合能分别为-60.0和-60.8 kcal mol–1，比所有其他研究的同二聚体更稳定。相比之下，Δ8-THCH+-6••CBC的结合能为-61.2 kcal mol–1，比这里研究的所有其他异二聚体更稳定。此外，结果还表明，Δ8-THCH+-6••CBC比本研究中发现的最稳定的同二聚体（如CBDH+-2••CBD和Δ9-THCH+-2••Δ9-THC）稳定约0.4–1.2 kcal mol–1。

在研究m/z 629的结构身份时，需要考虑的一个重要因素是温度对稳定性以及由此导致的最稳定质子结合二聚体数量的影响，因为通过DART-HRMS观察到这一质量是在350 °C的温度设置下进行的。因此，我们研究了温度如何影响CBD、Δ9-THC、CBC、Δ8-THC和CBT形成的各种质子结合同二聚体和异二聚体的数量。通过使用方程3计算每个质子结合二聚体复合物的摩尔分数（Xi）来确定数量分布。然后将所有复合物的摩尔分数值（以百分比表示）绘制在50–800 K的温度范围内，如图9所示。结果表明，最稳定的Δ8-THCH+-6••CBC（红线）二聚体的相对浓度随着温度的升高而显著降低，从50 K时的98.8%降至800 K时的4.5%。第二稳定的复合物Δ9-THCH+-2••Δ9-THC（粉线）的数量从50 K时的1%略微增加到100 K时的2%；然而，在更高温度下其摩尔分数变得可以忽略不计。第三稳定的复合物CBDH+-2••CBD（海军蓝线）表现出相反的趋势。其在50至100 K之间的数量可以忽略不计，但随着温度的升高而显著增加。例如，其摩尔分数从100 K时的3%增加到500 K时的78%，然后在800 K时降至55%（见图9）。

尽管这三个复合物之间的结合能差异很小（见图8b和4），但它们的数量在研究的温度范围内有显著差异。CBDH+-2••CBD的高数量主要源于其振动配分函数相对于Δ8-THCH+-6••CBC和Δ9-THCH+-2••Δ9-THC在相同温度下的显著更大贡献。结果还表明，在50–400 K范围内，Δ9-THCH+-6••CBD（紫线）和CBDH+-2••CBC（绿线）的摩尔分数可以忽略不计（见图9）。在400 K以上，Δ8-THCH+-6••CBD（紫线）和CBDH+-2••CBC（绿线）的浓度分别从1%增加到18%和2%。CBCH+-1••CBC（青线）的摩尔分数在50至600 K之间保持可以忽略不计，但在600至800 K之间从3%增加到15%。总体而言，结果表明：(1) 在240 K以下，最稳定的Δ8-THCH+-6••CBC是主导物种；(2) 在240–800 K范围内，CBDH+-2••CBD成为最丰富的二聚体。然而，需要考虑的一个重要因素是之前报告的观察结果，即DART气体流（在样品引入的离子源和质谱仪入口之间）的温度通常低于分析师设定的温度。对于本研究中使用的仪器，确定从DART出来的亚稳态氦气流的温度比DART硬件设定的350 °C低约100 °C（见图S18）。这引发了这样一个问题：在采样间隙中发生的温度下降是否会导致最丰富二聚体身份的变化。然而，如图9所示的结果表明，CBD二聚体在足够宽的温度范围内占主导地位，包括比分析师设定的350 °C低300 °C以上的DART气体流温度。这是一个重要的观察结果，表明在这种情况下，在离子源和质谱仪入口之间的采样空间中观察到的DART气体温度变化并不会改变实验结果。我们之前已经提到，DART-HRMS分析是重复三次进行的，并且在所有光谱中都一致观察到了m/z 629。然而，由于图9中报告的摩尔分数结果是计算得出的，因此这个质量的相对强度趋势的一致性并没有通过误差条体现出来。所有质子结合的二聚体复合物的焓（ΔH）是在M06–2X/6–311++G(3df,3pd)//M06–2X/6–311++G(2d,2p)水平上计算的，在这种情况下，主要的误差来源可能是计算出的ΔH值。使用M06–2X功能组和较大的6–311++G(3df,3pd)基组预计会在ΔH值中引入约1–2 kcal mol–1的不确定性。为了评估这种不确定性对种群分布的影响，我们采用了±2 kcal mol–1的上限值，并通过系统地将所有质子结合的二聚体复合物的ΔH值增加或减少2 kcal mol–1来进行敏感性分析。结果显示，均匀地增加或减少所有质子结合的二聚体的ΔH值2 kcal mol–1并不会改变使用方程3计算出的它们的相对摩尔分数。这是因为相同的系统误差被应用到了所有质子结合的二聚体复合物上，因此它们的摩尔分数没有受到影响。因此，在图9中包含误差条是不合适的，因为假设的理论不确定性并不会导致计算出的种群分布有任何有意义的变化。

3.4. 大麻和 marijuana 样品的 FD-MS 分析
DART-HRMS 分析观察到的 m/z 629 标记物的另一种可能性是，它可能是一种大麻特有的生物标志物。如果是这种情况，那么在通过 DART-HRMS 分析纯化的 Δ9-THC、CBD 及其各种异构体时，不应该能够检测到这个质量。然而，尽管这些标准品是通过合成方法制备的（而不是从可能含有微量 m/z 629 生物标志物的植物来源中提取的），我们仍然在所有通过 DART-HRMS 分析的认证参考标准品中检测到了这个质量。这表明这个质量不太可能是大麻特有的天然产物。尽管如此，我们还是通过 FD-MS 分析了从合成得到的 CBD 和 Δ9-THC 参考标准品以及大麻和 marijuana 植物材料，探讨了存在 m/z 629 生物标志物的可能性。FD（26,27）是一种样品引入和电离方法，最初由 Beckey 在 1969 年（28）提出，作为场电离（FI）的改进版本。（29?31）场电离依赖于气体相分子向由碳纳米 whisker 构成的发射器中的电子隧穿。当对发射器施加高电压时，会在纳米 whisker 的尖端产生非常高的电场。（32）FI 是一种软电离方法，可以从有机分子产生分子离子，且几乎没有或没有碎片化；而场脱附是指样品直接施加到发射器上的情况。重要的是，FD 可以从大的饱和或不饱和烃类产生分子离子和非质子化的二聚体。因此，这种方法被认为适合用于探测 m/z 629 生物标志物的存在，因为：（a）如果这种分子存在于植物材料中，它将以标称 m/z 628 的分子离子（阳离子自由基）的形式被检测到；（b）如果 m/z 629 是在 DART-MS 测量过程中生成的气相二聚体，那么在 FD 分析中不仅在大麻和 marijuana 植物材料中，而且在通过合成得到的纯化参考标准品中也会被检测到。

图 S19 显示了通过合成方法制备的 CBD 和 Δ9-THC 的真实标准品的 FD 质谱。两者都在标称 m/z 628 处显示出一个峰，与 2M+• 一致（其中 M = m/z 314）。这些结果表明，DART-HRMS 在大麻样品中观察到的 m/z 629 峰，与 [2M + H]+ 一致，是在 DART-HRMS 分析过程中生成的气相加合物，在 FD-MS 实验中代表相应的非质子化二聚体。其检测特征表明样品中含有相对较高水平的 CBD（例如大麻）。

4. 结论和对 m/z 629 结构身份的影响
在正离子模式下，DART-HRMS 可以检测到不同类型分子的多种离子，包括 [M + H]+、[M + NH4]+、[M + M + H]+ 或 [2M + H]+、[2M + NH4]+、[M + O + H]+、[2(M – 2H) + H]+ 和 [M – H2O + H]+ 等。（7,8,33?36）正如这里所展示的，DART-HRMS 分析观察到的质子化二聚体可以采取 [2M + H]+（如 CBDH+••CBD 或 Δ9-THCH+••Δ9-THC）或 [M + M’ + H]+（如 CBDH+••Δ9-THC 或 Δ9-THCH+••CBD）的形式。然而，检测到的二聚体离子的结构特征取决于几个因素。例如，样品中感兴趣的分析物的浓度会影响质子化二聚体复合物的峰强度。（36?39）这是因为质子化二聚体信号的生成涉及两个分子（例如 CBD 和 THC，或 CBD 和 CBC 等），而不仅仅是一个分子。（39）另一个影响二聚体检测的因素是分子经历的碎片化程度。通常情况下，随着孔径 1 电压的增加，二聚体信号的强度会降低（因为会引发进一步的碎片化。（34）因此，在碰撞诱导解离条件下（例如，在孔径 1 电压为 90 V 时），观察到由两个前体分子组成的质子化二聚体是不太可能的。质量检测器的电压也决定了是否能够检测到二聚体。在我们的研究中，发现在 2000 V 的检测器电压下没有检测到二聚体，但在 2100 V 的电压下，由于信号增强，二聚体很容易被观察到。第四个因素涉及质量精度。例如，如果实验测定的质子化二聚体的质量与计算质量相差太大，那么就很难做出初步鉴定。可能导致这种情况的因素包括：（1）峰强度低；（2）分辨率差；（3）在感兴趣的峰上观察到肩峰，这些肩峰在质心化后会导致质量偏移。（35）

如前所述，这项计算研究是由于对使用 DART-HRMS 区分大麻和 marijuana 品种时具有诊断意义的 m/z 值的结构身份的兴趣而引发的（即标称 m/z 629）。由于观察到的高分辨率质量对应于一个质子化的大麻素二聚体 [C21H30O2 + H]+，并且由于在 DART-HRMS 分析中经常观察到质子化二聚体，因此推测 m/z 629 对应于 [2 C21H30O2 + H]+。然而，由于单体公式对应于多种大麻素异构体（Δ8-THC；Δ9-THC；以及 CBC、CBT 和 CBD）；所有这些异构体都存在于大麻和 marijuana 中（尽管浓度各不相同）；并且可能存在质子化的同质和异质二聚体加合物，因此挑战在于确定在所使用的 DART-HRMS 分析条件下，究竟是哪种异构体导致了 m/z 629，以及为什么它只在大麻中被观察到。测量是在 DART 气体温度设置为 350 °C（相当于 623.15 K）的情况下进行的。根据图 9，在这个温度下，CBDH+-2••CBD（海军蓝线）二聚体排列最为丰富。此外，在 623.15 K 时，Δ9-THCH+-6••CBD 的数量显著少于 CBDH+-2••CBD 二聚体（紫色线）。因此，根据我们的计算，在分析条件下，主要负责在大麻 DART 质谱中出现 m/z 629 的二聚体结构是 CBDH+-2••CBD（图 2）。

本工作得出的结论得到了我们之前涉及大麻和 marijuana 植物材料的研究结果的支持。在所有 41 个含有大量 CBD 和 ≤0.3% Δ9-THC 的大麻样品中都检测到了 m/z 629 的峰。（6）而在通过 DART-HRMS 分析的大麻植物材料中则没有观察到这一现象。尽管在当前研究中，DART-HRMS 分析 Δ9-THC 标准品时观察到了 m/z 629 的峰，但在供应商报告含有 >0.3% Δ9-THC 的 33 个 marijuana 样品的 DART-HR 质谱中并未观察到这一峰。先前的研究表明，基质的复杂性可能会干扰大麻相关分子的检测。（4）这是因为当 Δ9-THC 存在于复杂的基质（如 C. sativa 植物材料或其衍生物）中时，样品中会有数百种其他分子。这增加了其光谱中观察到的峰的数量，可能会掩盖低强度的峰（例如二聚体）。因此，由于大麻植物材料的复杂性和 Δ9-THC••Δ9-THC 二聚体在 DART-HRMS 测量时的较低稳定性，可以推断出 m/z 629 峰的检测可能是由于 CBDH+••CBD 二聚体的存在。

由于其他大麻素与 Δ9-THC 和 CBD 具有相同的分子式（例如 CBC、Δ8-THC 和 CBT），因此也研究了相应的质子化二聚体的形成。计算结果表明，在 DART 气体温度 623.15 K 下，Δ8-THCH+-6••CBC、CBCH+-1••CBC 和 CBDH+-2••CBC 的数量分别为 9%、0.3% 和 4.5%。这一结果表明，如果有的话，这些质子化二聚体对 m/z 629 总质量的贡献可以忽略不计。在大麻素样品中发现的微量 CBC 和 Δ8-THC 通过 Δ8-THCH+-6••CBC、CBCH+-1••CBC 和 CBDH+-2••CBC 参与了二聚体的形成。