一种用于Resmetirom有关物质分析方法的开发与验证及新降解产物的鉴定

《Frontiers in Chemistry》：Development and validation of a novel analytical method for related substances of resmetirom and identification of new degradation products

　　

背景：Resmetirom（MGL-3196）是一种高选择性甲状腺激素受体β（THR-β）激动剂，用于治疗伴有中度至晚期肝纤维化的非肝硬化性非酒精性脂肪性肝炎（NASH）成人患者。有关物质是直接影响活性药物成分（API）安全性和有效性的关键因素。因此，对resmetirom中有关物质的定量检测尤为重要。方法：本研究建立了一种用于分离resmetirom及其有关物质的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法。分析采用Agilent 5 HC C18 (2)色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），在35 °C下进行，检测波长为220 nm。采用梯度洗脱方法，在45 min运行时间内实现了所有杂质的有效分离。最终的HPLC方法使用含0.045%三氟乙酸（TFA）的H₂O/ACN（90/10，v/v）混合物作为流动相A，ACN作为流动相B。梯度洗脱程序如下：0–2 min，10% B→10% B；2–20 min，10% B→50% B；20–30 min，50% B→54% B；30–35 min，54% B→54% B；35–36 min，54% B→10% B；36–45 min，10% B→10% B。流速为1.0 mL/min，进样体积为10 μL。结果：该方法根据国际协调会议（ICH）指南进行了验证，结果表明其具有良好的特异性、稳定性、线性、精密度、重复性和稳健性。此外，研究人员在碱性降解条件下发现了一种新的降解产物，命名为imp-A。利用核磁共振（NMR）和高分辨质谱（HRMS）阐明了其化学结构，该化合物为首次报道。结论：本研究建立的RP-HPLC方法能够准确、可靠地分离和检测resmetirom及其有关物质。该方法操作简单，结果可靠，为resmetirom及其制剂的质控提供了一种实用、高效的分析工具，有助于确保药物产品的安全性和有效性。

**论文解读：Resmetirom有关物质分析方法开发、验证与新降解产物鉴定**

### 研究背景与目的
非肝硬化性非酒精性脂肪性肝炎（NASH，也称代谢功能障碍相关脂肪性肝炎）是一种进行性肝脏疾病，以肝脂肪变性、炎症、肝细胞损伤和逐渐加重的纤维化为特征。当NASH进展至晚期纤维化时，尤其在2型糖尿病患者中，不良临床结局风险显著升高。尽管生活方式干预有助于管理相关代谢紊乱，但实施和维持困难。甲状腺激素受体β（THR-β）在肝细胞中扮演重要角色，调节NASH中常被破坏的代谢过程，肝内甲状腺激素水平降低可能促进NASH发病。在此背景下，2024年3月14日美国食品药品监督管理局批准了resmetirom（MGL-3196）用于治疗伴有中度至重度肝纤维化（F2至F3期）的NASH成人患者。Resmetirom是一种口服药物，选择性激活THR-β（对THR-β的亲和力约为THR-α的28倍），其设计源于哒嗪酮系列化合物，并引入氰基氮杂尿嘧啶基团以增强效力和选择性。然而，截至研究开展时，尚无简便的resmetirom有关物质分析方法报道。合成过程中产生的工艺杂质及降解产物直接影响药物安全性和疗效，因此在工艺制备研究和质控中必须加以考虑。为此，本研究旨在开发并验证一种基于反相高效液相色谱（RP-HPLC）的resmetirom有关物质分析方法，并鉴定新降解产物。该论文发表在《Frontiers in Chemistry》。

### 主要关键技术方法
研究人员采用RP-HPLC技术，使用Agilent 5 HC C18 (2)色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）在35 °C下进行分离，检测波长为220 nm，流动相为含0.045%三氟乙酸（TFA）的H₂O/乙腈（ACN）（90/10，v/v）与ACN，梯度洗脱45 min。方法按照国际协调会议（ICH）指南进行验证，涵盖特异性、线性与范围、准确度、精密度、灵敏度及稳健性。对于新降解产物imp-A，研究人员通过碱性水解制备，经半制备HPLC纯化，并利用核磁共振（NMR，包括¹H NMR、¹³C NMR和二维NMR）及高分辨质谱（HRMS）进行结构确证。所有试剂与标准品均来源于商业供应商（如上海Caerulum Pharma Discovery Co., Ltd等），imp-A在实验室自制。

### 研究结果
**3.1 方法开发**
- **溶剂选择**：溶解性实验显示resmetirom在甲醇中溶解度优于乙腈，且75%甲醇-水溶液可避免析出，故选为溶剂。
- **波长选择**：紫外-可见光谱显示resmetirom及其杂质在220 nm附近均有显著吸收，因此检测波长定为220 nm。
- **色谱柱选择**：比较不同C18柱后，Agilent 5 HC C18 (2)（250 mm × 4.6 mm，5 μm）在H₂O-ACN体系中提供更高分辨率和更低背压。
- **洗脱方式调整**：由于resmetirom呈酸性，加入微量TFA抑制电离并改善峰形。等度洗脱无法完全分离所有组分，最终优化梯度程序（如2.3节所述），使主峰与杂质峰、杂质峰之间的分辨率均满足要求（>1.2）。

**3.2 方法验证**
- **特异性**：系统适用性溶液和混合杂质溶液的色谱图显示，resmetirom与相邻杂质峰分辨率均>1.5，杂质峰之间最小分辨率>1.2，方法适用于样品分析。
- **强制降解试验**：在酸、碱、氧化、热和光降解条件下，resmetirom在酸、热、光下相对稳定，在碱和氧化条件下易降解。所有条件下主峰与杂质峰分辨率>1.5，杂质峰之间分辨率>1.2，物料平衡在95.8%–103.6%范围内。
- **检测限与定量限**：resmetirom及其杂质的检测限（LOD）为0.01–0.03 μg/mL，定量限（LOQ）为0.03–0.09 μg/mL，表明方法灵敏度高。
- **线性与范围**：在LOQ至2.0%分析浓度范围内，所有校准曲线相关系数r>0.99，线性良好。
- **精密度**：连续6次进样，resmetirom和imp A–D的保留时间相对标准偏差（RSD）<0.11%，峰面积RSD<2%，仪器精密度良好。
- **重复性**：6份独立制备的混合溶液分析，各组分峰面积RSD<2%，方法重复性佳。
- **回收率**：在50%、100%、150%三个加标水平下，所有杂质回收率在95%–110%之间，准确度高。
- **稳健性**：微调流动相组成、检测波长、柱温、流速和色谱柱类型，resmetirom与相邻杂质峰最小分辨率>2.44，杂质峰之间最小分辨率>1.26，方法稳健。

**3.3 Imp-A的结构表征**
研究人员通过碱解制备并纯化imp-A，纯度约99.1%。¹H NMR、¹³C NMR及二维NMR结合HRMS数据，确认imp-A的化学结构（如论文图1所示）。该化合物为首次报道的碱性降解产物。

### 讨论与结论
本研究的结论部分指出：该研究成功建立并验证了一种可靠、高效的RP-HPLC方法，用于鉴定新近获批NASH药物resmetirom及其所含杂质。经验证，该方法具有优异的特异性、高灵敏度以及令人满意的线性、精密度、重复性和稳健性。此外，研究人员还发现了一种新的降解产物，并成功解析了其结构。该研究旨在为未来关于resmetirom（首个获批治疗NASH的药物）的研究提供有价值的见解。