环糊精-电动色谱法分离生物蝶呤对映体的方法开发

《Journal of Chromatography Open》：Development of a cyclodextrin-electrokinetic chromatography methodology for the separation of biopterin enantiomers

　　

本研究介绍了一种基于环糊精-电动色谱（cyclodextrin-electrokinetic chromatography, CD-EKC）的分析方法开发过程，以实现生物蝶呤（biopterin）的对映体分离。生物蝶呤是一种具有生物学意义的分子，在哺乳动物中作为芳香族氨基酸羟化酶（aromatic amino acid hydroxylases）的辅因子发挥重要作用。研究人员系统研究了不同实验和仪器变量（如缓冲液种类和pH、手性选择剂及其浓度、毛细管长度、分离电压和温度）对手性分离的影响。在优化条件下（1.0% 硫酸化-β-环糊精（sulfated-β-cyclodextrin, S-β-CD）溶于100 mM 甲酸盐缓冲液（formate buffer），pH 2.2），生物蝶呤对映体在不到7.0分钟内实现分离，分辨率为2.5。根据国际协调会议（International Council for Harmonization, ICH）指南，评估了所开发方法的线性、精密度和检测/定量限等分析特性。D-生物蝶呤和L-生物蝶呤的检测限分别为0.12 μg/mL和0.13 μg/mL。为展示该方法的应用潜力，研究人员选择尿液作为生物基质。分析前，尿液样品用二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）处理，以防止生物蝶呤的氧化-还原变化。对加标尿液样品的分析表明，D-和L-对映体的平均回收率分别为（105 ± 5）%和（102 ± 8）%。

**论文解读：环糊精-电动色谱法分离生物蝶呤对映体的方法开发**

**研究背景与意义**
生物蝶呤（biopterin）是一类含2-氨基-4-羟基蝶啶环的分子，在细胞氧化还原调节、神经递质生物合成和免疫系统活动中起关键作用。其中，四氢生物蝶呤（tetrahydrobiopterin, BH₄）作为芳香族氨基酸羟化酶（如色氨酸羟化酶、苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶）及一氧化氮合酶等的辅因子，参与多巴胺和血清素等神经递质的合成。BH₄缺乏可导致苯丙氨酸积累、神经系统疾病和心血管异常。虽然生物蝶呤本身无催化活性，但分析其含量可反映BH₄的周转与稳定性，因此常通过尿液（BH₄的主要排泄途径）测定。然而，生物蝶呤仅L-对映体具有生物活性，D-对映体或外消旋体的出现可能指示氧化降解或非酶促转化。目前仅有两项文献报道了生物蝶呤的对映体分析，但均未采用电动色谱（electrokinetic chromatography, EKC）技术。EKC凭借高通用性、分离效率、易调节条件及低试剂消耗等优势，已成为手性分离的成熟手段。为填补这一空白，研究人员开发了首个基于环糊精（cyclodextrin, CD）作为手性选择剂的EKC方法（CD-EKC），用于生物蝶呤对映体的分离，并验证其在尿液基质中的适用性。相关成果发表在《Journal of Chromatography Open》。

**关键方法概述**
研究人员采用CD-EKC技术，以硫酸化-β-环糊精（S-β-CD）为手性选择剂，在100 mM甲酸盐缓冲液（pH 2.2）中，使用未涂覆熔融石英毛细管（内径50 μm，有效长度40 cm），在反向电压（-30 kV）和25 °C条件下分离生物蝶呤对映体。尿液样本取自健康志愿者，经冷冻、解冻、离心、过滤后，加入二硫苏糖醇（DTT）防止氧化还原变化，无需预浓缩步骤。方法验证遵循ICH指南，通过标准曲线和标准加入法评估线性、精密度、检测限等。

**研究结果**
**3.1 CD-EKC方法开发**
研究人员首先通过不同pH缓冲液确定生物蝶呤的净电荷：在pH 2.2时带正电，pH 7.0和9.0时带负电。据此设计了两种策略：在中性pH下用中性CDs（13种）未获分离；在酸性pH下用阴离子CDs，其中S-β-CD和磷酸化-β-CD（P-β-CD）实现分离。优化浓度后，1.0%（w/v）S-β-CD在有效长度40 cm、-30 kV、25 °C条件下，于6.1 min内达到分辨率2.5，且D-生物蝶呤先于L-生物蝶呤迁移。
**3.2 分析特性评价**
通过外标法验证线性（1-15 μg/mL），相关系数>0.997，ANOVA检验p>0.05，截距置信区间包含零且斜率不包含零，两对映体响应因子在0.8-1.2内，可视为等效。精密度评估（仪器精密度、方法精密度、中间精密度）的RSD均≤7.3%。LOD和LOQ分别为D-生物蝶呤0.12/0.40 μg/mL，L-生物蝶呤0.13/0.42 μg/mL。
**3.3尿液样品应用**
尿液加标实验显示，加入0.2 μg/mL DTT可有效防止生物蝶呤还原为二氢生物蝶呤（BH₂）。标准加入法与标准曲线的斜率置信区间无显著差异（95%置信水平），证实无基质干扰。加标回收率（6、8、10 μg/mL）为D-生物蝶呤（105±5）%、L-生物蝶呤（102±8）%。空白尿液未检出生物蝶呤，推测因个体间浓度差异及采样非晨尿或24小时尿，但加标尿样的电泳图证明方法可行，且通过预浓缩可进一步降低检测限。

**讨论与结论**
研究人员讨论了DTT处理在防止生物蝶呤氧化还原变化中的关键作用，并指出虽未在健康人尿液检出天然生物蝶呤，但方法灵敏度足以测定高于LOQ的浓度，未来可通过预浓缩增强适用性。结论部分翻译：本研究首次开发了一种基于CD-EKC的分析方法，成功实现了生物蝶呤的对映体分离。通过系统优化缓冲液性质与pH、手性选择剂类型与浓度、毛细管长度、分离电压和温度等变量，在最优条件（1.0% S-β-CD溶于100 mM甲酸盐缓冲液pH 2.2，有效长度40 cm，-30 kV，25 °C）下，生物蝶呤对映体于7 min内分离，分辨率2.5。该方法经线性、精密度和准确度验证，符合ICH要求，并成功应用于尿液样品（生物蝶呤主要排泄基质）的手性分析。未采用预浓缩，但DTT添加对防止氧化还原变化至关重要。虽未在分析样品中检出天然生物蝶呤，但加标尿样分析表明该方法在蝶呤代谢相关研究中具有潜在应用价值，结合预浓缩策略可进一步提升其检测能力，为生物蝶呤对映体分离提供了创新路径。