《Annals of the New York Academy of Sciences》：Reassessing Transketolase Assays: Methodological Considerations for Detecting Functional Thiamine Deficiency
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这篇综述深入探讨了转酮醇酶（TKT）活性检测作为一种评估功能性硫胺素（维生素B1）状态工具的最新进展。文章不仅评估了检测前变量、方法学和数据呈现策略，还强调了通过优化检测条件和解读框架，TKT活性检测能更有效地在临床、转化和生态学背景下鉴别真实的硫胺素缺乏、受损的酶利用或改变的酶特性，从而超越其传统的筛查角色，成为探究酶功能与辅因子依赖性的有力工具。
维生素B1，即硫胺素，是生命体必需的营养素。其活性形式硫胺素二磷酸（TDP）是连接糖酵解与三羧酸循环、代谢磷酸戊糖途径（PPP）中糖和氨基酸等多种关键酶的必需辅因子。硫胺素缺乏在人类和动物群体中依然普遍，可能由降解、摄入不足、吸收受损或代谢需求增加导致。传统的检测方法，如高效液相色谱法（HPLC）或质谱法直接定量硫胺素形式，虽然能提供浓度信息，但面临技术挑战和高成本。而功能性评估——即测量硫胺素依赖酶（如转酮醇酶）的活性——提供了评估硫胺素利用状态的独特视角。
1 引言
转酮olase（TKT）是一种TDP依赖性酶，催化PPP非氧化阶段的限速反应。因此，测量TKT在有无外源性TDP条件下的活性，可以评估细胞内功能性硫胺素的可用性，这被称为红细胞转酮醇酶活性系数（ETKAC）测定。这一方法不仅能筛查缺乏症，还为探究酶功能和辅因子依赖性提供了机会。TKT活性改变与多种疾病状态相关，例如韦尼克-科尔萨科夫综合征（常与慢性酒精使用和硫胺素缺乏相关）、阿尔茨海默病患者大脑及糖尿病患者红细胞中TKT活性降低。相反，在几种癌症中TKT活性增加，这可能通过增强PPP通量支持核苷酸合成和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）生产，从而促进肿瘤生长。尽管在一些发达国家，主食强化政策降低了硫胺素缺乏的普遍性，但在高碳水化合物饮食、肥胖、减重手术、克罗恩病、妊娠剧吐和酒精使用障碍等情况下，缺乏风险依然存在。值得注意的是，美国CDC国家健康与营养检查调查等大型项目中，硫胺素的血浆水平测量远少于其他维生素，凸显了开发和优化功能性评估工具的重要性。
2 硫胺素状态的评估方法
评估长期硫胺素状态首选全血，因为血浆水平主要反映近期摄入。硫胺素在细胞内被磷酸化为TDP，而人体约80%的TDP存在于红细胞内。实验室评估通常采用色谱法，但存在挑战。替代方法是测定ETKAC，即在有和无外源性TDP条件下测量TKT活性。当硫胺素不足时，补充TDP会增加TKT活性，其相对于基础活性的百分比增加反映了内源性TDP的饱和程度。在人类红细胞中，补充与基础TKT活性比（ETKAC）≤1.15（活化百分比≤15%）表示硫胺素充足；>1.15表示不足；>1.25表示严重缺乏。TKT检测可在微孔板格式中进行，降低了仪器和维护成本。然而，两种方法都缺乏普遍应用的标准和参考材料，导致实验室间变异。与直接TDP测量相比，TKT活性检测的结果一致性不一。某些情况下，基础TKT活性与红细胞TDP浓度的相关性可能优于ETKAC。低TKT活性可能反映了硫胺素磷酸化不足、TKT表达低、存在内源性抑制剂或对硫胺素的亲和力改变。因此，将色谱法和酶学法结合使用，可以更全面地了解系统硫胺素的物理可用性与其功能利用能力。除了人类红细胞，TKT活性也在其他物种（如鱼类、鸟类）的组织中测量，用于研究生态学相关的硫胺素缺乏，这凸显了在不同生物背景下应用和解释TKT检测的共性与差异。
3 TKT的生化作用概述
TKT是PPP非氧化阶段的关键调节器和限速酶。在非氧化阶段，核酮糖-5-磷酸（Ru5P）被转化为核糖-5-磷酸（R5P）和木酮糖-5-磷酸（X5P），它们作为TKT的底物。TKT催化从X5P（供体）向R5P或赤藓糖-4-磷酸（E4P）（受体）的二碳单元转移，分别形成景天庚酮糖-7-磷酸（S7P）和甘油醛-3-磷酸（G3P），或果糖-6-磷酸（F6P）和G3P。PPP为核苷酸生物合成提供R5P，并为维持氧化还原平衡、支持脂肪酸、DNA、氨基酸和胆固醇合成以及外源性物质代谢提供至关重要的NADPH。因此，TKT活性直接影响合成代谢能力、抗氧化防御和细胞生长。
4 TKT的结构与相互作用
哺乳动物、细菌、酵母和植物的TKT单体质量约为70-75 kDa，但以140-150 kDa的同型二聚体形式发挥作用。二聚化是浓度依赖性的，TDP在单体间的结合稳定了全酶并防止其解离成无活性的脱辅基形式。对酵母TKT的研究最为广泛。TKT需要二价阳离子以实现最佳活性。重组动力学取决于TKT蛋白浓度和辅酶可用性。酵母TKT的两个活性位点表现出不同的金属亲和力，一个高，一个低。TDP与活性位点残基形成氢键，并与二价辅助因子产生静电相互作用。氧硫胺素焦磷酸是强效抑制剂。一些抑制由于磷酸根离子本身也有报道。相比之下，羟基丙酮酸和羟基苯基丙酮酸充当竞争性供体底物。在酵母和大肠杆菌中，已描述了具有高TDP亲和力和低TDP亲和力的TKT亚群，它们的相对丰度受氧化应激调节。温度最适点反映了生物体的生理特性。这些生化特性构成了任何基于TKT的功能检测的约束条件。
5 使用TKT活性监测硫胺素缺乏
ETKAC的测定需要在基础条件和补充外源性TDP后测量溶血产物中的TKT活性。红细胞是评估功能性硫胺素状态的实用样本类型，因为它们的硫胺素耗尽速率与其他不易获取的组织大致相同。此外，这些细胞缺乏线粒体，完全依赖PPP的氧化阶段来维持NADPH水平，使它们对PPP的依赖对于维持NADPH水平至关重要。红细胞不能进行蛋白质合成，因此它们的TKT水平反映了其前体细胞的表达。由于红细胞中的大部分硫胺素以TDP形式存在，ETKA测量为生物可利用的硫胺素提供了合理的替代指标。
6 TKT检测程序
大多数现代TKT检测遵循的方案是，通过涉及α-甘油磷酸脱氢酶-丙糖磷酸异构酶（α-GDH-TPI）的偶联酶反应监测NADH氧化。在过量R5P存在下，有或无X5P，340 nm处外源性NADH的消耗率反映了TKT活性。选择适当的斜率测定窗口至关重要。尽管这个分光光度框架被广泛采用，但方法学变异仍然很大，特别是在底物选择、预孵育步骤和缓冲液组成方面。一些方案包括R5P和X5P作为TKT底物，而另一些仅使用R5P。X5P非常昂贵。内源性非氧化PPP酶RPIA和RPE可相互转化Ru5P、R5P和X5P。在生理条件下，提供过量的R5P可以避免对上游酶的依赖。我们的数据同样表明，外源性X5P对于鱼肝TKT检测是不必要的。除了底物考虑，偶联检测需提供外源性α-GDH-TPI。检测温度应选择在经验上对TKT和辅助酶都有效的范围内。对于人类红细胞，孵育最好在37°C和pH 7.6的100 mM Tris-HCl缓冲液中进行。较高浓度的Tris会抑制纯化的酵母TKT。二硫苏糖醇（DTT）已被证明可以增加活性。尽管缺乏对预孵育程序的系统比较，但在裂解的红细胞中，与TDP预孵育15分钟似乎足以使脱辅基酶重组。尽管存在历史差异，最近在人类红细胞中标准化方法的努力无疑将增加检测的一致性。类似的努力需要验证TKT检测并在其他组织类型中建立标准化方案。
7 镁的影响
在影响TKT活性的变量中，镁的可用性值得特别关注。虽然Mg2+是全TKT组装所必需的，但其对测量活性的影响很大程度上取决于酶的基线TDP饱和状态以及组织特异性的生化背景。一些TKT程序包括氯化镁作为外源性Mg2+来源。虽然这对于菠菜TKT的最大活性是必要的，但据报道，对于大鼠肝脏或红细胞中的TKT活性来说不是必需的。然而，这种区别可能反映了样本中内源性Mg2+可用性的差异。Mg2+通常不添加到红细胞TKT检测方案中。我们在湖鳟鱼肝脏中的工作同样显示，在高添加Mg2+浓度下有抑制作用，但添加约0.5 mM Mg2+可明显增加TKT活性。我们不能排除这些鱼类存在饮食性Mg2+缺乏，并且不同检测中Mg2+需求的明显变异可能反映了其内源性可用性的差异。临床数据支持这种背景依赖性。不向体外检测中添加Mg2+意味着比活性反映了TDP和Mg2+的可用性。在纯化系统中，Mg2+降低了TDP的Km，这意味着当Mg2+充足时，可以用更低的TDP浓度达到相同的TKT活性水平。因此，运行不添加Mg2+的样本可能会产生受较低TDP Km影响的TKT值，因而高度依赖于内源性Mg2+水平。相比之下，向TKT检测中添加Mg2+可以通过分离TDP反应性来简化解释，但这样做会产生功能性硫胺素状态的非生理性测量，因为它覆盖了源自内源性循环Mg2+水平的活性。我们的湖鳟鱼肝脏数据突出了一个实际后果：添加Mg2+在绝对值上增加了基础和TDP补充后的活性，但不成比例。在此数据中，Mg2+成比例地更大程度地增加了基础活性。因此，Mg2+人为地降低了补充与基础比和计算出的潜伏期，这可能潜在地掩盖功能性硫胺素缺乏。如果不添加Mg2+，内源性Mg2+高的样本（例如，由于饮食充足）可能比Mg2+缺乏的样本显示出更高的基础TKT活性，即使TDP水平相似。这可能有助于解释直接测量的TDP与基于TKT的功能检测之间的不完全相关性。对于处于临界值的ETKAC样本，评估样本的Mg2+状态可以改善实验室测量与硫胺素缺乏临床症状之间的一致性。镁还影响其他几种硫胺素依赖或硫胺素加工酶的活性。重要的是，血清镁仅代表全身镁的一小部分，不一定反映细胞内或红细胞的镁可用性。这种差异可能有助于解释为什么在血清检测中归类为“镁充足”的患者可能仍然表现出有限的TKT反应性——配对测试方案可以帮助解决这一差距。
8 TKT活性的数据呈现
鉴于TKT检测中存在许多生化和程序上的差异，结果的数学表达方式对于准确解释至关重要。因此，本节区分了常用的报告指标，包括比活性、活化比、潜伏期和TPP效应，并阐明了每一项如何反映酶行为的不同方面。尽管术语ETK和AETK源于红细胞，但它们在其他组织类型中与基础和TDP补充后的活性同义。这些速率可以基于组织质量归一化报告，或当归一化为总蛋白或血红蛋白时作为比活性报告。组织归一化速率更反映给定样本内的综合代谢能力，而蛋白质归一化活性则考虑了提取效率和相对TKT丰度。对于红细胞，更常见的是，结果表示为ETKA比（AETK/ETK），它作为硫胺素可用性的功能指标，对绝对酶含量不太敏感。其他描述符包括潜伏期，定义为脱辅基形式的酶比例，以及TPP效应，代表补充后活性的增加倍数。尽管在数学上相关，但这些参数强调了酶活性的不同方面。潜伏期表示无活性的部分，而TPP效应强调激活的程度。文献中的术语各不相同，这使得必须在每个报告内解释术语。
