综述：重新构建兽医疫苗质量控制：将替代检测方法纳入基于生命周期的监管框架

《Veterinary Immunology and Immunopathology》：Reframing Veterinary Vaccine Quality Control: Integrating Alternative Assays within Lifecycle-Based Regulatory Frameworks

兽医疫苗质量评估正从传统动物试验转向整合分子生物学、细胞实验、免疫化学及多组学方法等非动物替代技术，以符合3R原则和提升效率。

　　

Mohamed Samy Abousenna

埃及开罗农业研究中心兽医生物制品评估中心，邮政信箱131，11381

摘要

兽医疫苗的质量保证传统上依赖于基于动物的效力、安全性和有效性测试，包括挑战保护和体内滴度测定。尽管这些方法历来被视为监管的黄金标准，但它们越来越多地受到伦理考虑、高成本、有限的处理能力和漫长时间线的限制。作为回应，现在有强大的科学和监管动力支持替代方法，以减少或替代动物使用，同时保持对疫苗性能的信心。本综述批判性地审视了在3R框架（替代、减少和优化）内用于兽医疫苗评估的非动物和减少动物使用的方法。我们综合了五个方法领域的进展：分子和基因定量（包括qPCR、数字PCR和DIVA策略）；基于细胞的和体外功能效力测定；免疫化学和即时检测平台；物理化学和分析表征；以及系统级的免疫学和多组学方法。对于每个类别，我们讨论了科学原理、分析性能、验证要求以及监管接受度，重点是与WOAH和VICH指南的一致性。文中还解决了与测定标准化、参考材料、基础设施和实验室间重复性相关的实际挑战。通过涉及牲畜、伴侣动物和家禽疫苗（包括口蹄疫、结节性皮肤病、狂犬病和禽流感）的特定案例研究，展示了如何利用综合的、基于证据的策略来支持批次放行、一致性测试和许可后的监测。总体而言，这些证据支持向数据丰富、基于机制的质量控制框架的转变，从而提高效率、符合伦理要求，并增强监管信心。

引言

兽医生物制品的疫苗质量保证是确保产品在上市前具有效力、安全性和适当免疫原性的关键监管要求。传统上，疫苗质量保证依赖于基于动物的效力和挑战测试。虽然这些方法历来被视为监管的“黄金标准”，但它们存在显著的限制，包括漫长的时间线（通常为4-12周）、高昂的运营成本（每批数千美元），以及与动物使用和痛苦相关的重大伦理问题（Russell和Burch，1959；Abousenna等人，2021）。

近年来，科学界和监管机构强烈支持替代和创新的质量控制方法，以减少对动物测试的依赖，同时保持对疫苗性能的信心。这些努力符合3R原则（替代、减少和优化），旨在提高疫苗质量评估的速度和分析分辨率（Burden等人，2015；Prescott和Lidster，2017；Abousenna等人，2026）。国际监管机构，包括世界动物卫生组织（WOAH）和国际兽药技术要求协调委员会（VICH），越来越多地认可并鼓励在科学上有正当理由的情况下使用经过验证的体外和免疫化学替代方法（VICH，2007，VICH，2011；世界动物卫生组织WOAH，2024a）。

这一范式转变有几个关键驱动因素。首先，伦理考量起着核心作用，因为社会对动物福利的关注日益增加，这转化为监管压力——特别是在欧盟，要求根据3R框架尽量减少科学测试中的动物使用（Russell和Burch，1959；欧盟委员会，2010；Daneshian等人，2015）。其次，经济因素也很重要；体内测试需要专门的动物设施、受过培训的人员和延长的观察期，这大大增加了生产成本并限制了可扩展性（Rich和Perry，2011；Knight-Jones和Rushton，2013）。第三，速度和处理能力变得越来越关键，特别是在流行病或地方性疾病情况下，批次放行的延迟可能会影响疫苗的可用性和疫情控制。替代方法，如抗原定量测定、体外免疫测定和分子读数，可以将测试时间从几周缩短到几天，而不影响分析的严谨性（Moreira等人，2020；Abousenna等人，2026）。第四，分析精度和重复性的进步突显了传统挑战模型的局限性，后者可能受到生物变异性和主观临床评分的影响。相比之下，现代定量平台通常提供更客观、敏感和可重复的疫苗一致性和抗原完整性测量（Findlay和Dillard，2007；Huggett等人，2013）。最后，将疫苗质量保证纳入“同一健康”框架进一步支持采用快速、适应现场需求和数据丰富的方法。加速的疫苗评估和上市后监测有助于改善动物群体中的免疫覆盖率和病原体传播监测，从而加强人畜共患病预防和控制策略（Gibbs，2014；Mackenzie和Jeggo，2019）。

介绍

兽医生物制品的疫苗质量保证是确保产品效力、安全性和在上市前诱导适当免疫原性的关键监管要求。传统上，疫苗质量保证依赖于基于动物的效力和挑战测试。尽管这些方法历来被视为监管的“黄金标准”，但它们存在重大限制，包括漫长的时间线（通常为4-12周）、高昂的运营成本（每批数千美元），以及与动物使用和痛苦相关的重大伦理问题（Russell和Burch，1959；Abousenna等人，2021）。

近年来，科学界和监管机构强烈支持替代和创新的质量控制方法，以减少对动物测试的依赖，同时保持对疫苗性能的信心。这些努力符合3R原则（替代、减少和优化），旨在提高疫苗质量评估的速度和分析分辨率（Burden等人，2015；Prescott和Lidster，2017；Abousenna等人，2026）。国际监管机构，包括世界动物卫生组织（WOAH）和国际兽药技术要求协调委员会（VICH），越来越多地认可并鼓励在科学上有正当理由的情况下使用经过验证的体外和免疫化学替代方法（VICH，2007，VICH，2011；世界动物卫生组织WOAH，2024a）。

有几个关键驱动因素支持这一范式转变。首先，伦理要求起着核心作用，因为社会对动物福利的关注日益增加，这转化为监管压力——特别是在欧盟，要求根据3R框架尽量减少科学测试中的动物使用（Russell和Burch，1959；欧盟委员会，2010；Daneshian等人，2015）。其次，经济因素也很重要；体内测试需要专门的动物设施、受过培训的人员和延长的观察期，这大大增加了生产成本并限制了可扩展性（Rich和Perry，2011；Knight-Jones和Rushton，2013）。第三，速度和处理能力越来越关键，特别是在流行病或地方性疾病情况下，批次放行的延迟可能会影响疫苗的可用性和疫情控制。替代方法，如抗原定量测定、体外免疫测定和分子读数，可以将测试时间从几周缩短到几天，而不影响分析的严谨性（Moreira等人，2020；Abousenna等人，2026）。第四，分析精度和重复性的进步突显了传统挑战模型的局限性，后者可能受到生物变异性和主观临床评分的影响。相比之下，现代定量平台通常提供更客观、敏感和可重复的疫苗一致性和抗原完整性测量（Findlay和Dillard，2007；Huggett等人，2013）。最后，将疫苗质量保证纳入“同一健康”框架进一步支持采用快速、适应现场需求和数据丰富的方法。加速的疫苗评估和上市后监测有助于改善动物群体中的免疫覆盖率和病原体传播监测，从而加强人畜共患病预防和控制策略（Gibbs，2014；Mackenzie和Jeggo，2019）。

部分摘录

概念框架：替代方法的战略性使用

在兽医疫苗评估中应用替代方法最好在基于证据的框架内理解，而不是立即替代传统的体内测试。在这种范式中，来自多个互补且机制不同的平台的数据（包括分子、免疫化学、基于细胞和物理化学的测定）被整合起来，以支持关于疫苗质量、一致性和预期免疫学性能的结论（Rathore等）

兽医疫苗评估的替代和创新方法

分子生物学、免疫学和分析技术的进步使得开发了旨在减少或替代兽医疫苗评估中动物使用的替代方法。这些方法解决了传统体内测试的局限性，包括伦理问题、高成本、长时间线和生物变异性。替代方法不是作为所有基于动物的测试的直接替代品，而是越来越多地应用于综合评估中

WOAH陆地手册标准

WOAH陆地手册为兽医诊断测定和疫苗质量控制建立了国际统一的标准，为动物健康领域的测定验证和监管接受提供了主要参考（世界动物卫生组织WOAH，2024a；世界动物卫生组织WOAH，2024b）。核心原则包括：（i）全面的验证要求，涵盖分析灵敏度、特异性、准确性、精确度、稳健性和适用性

生物安全和实验室基础设施

实施替代和先进的分析方法需要适当的生物安全防护、基础设施和受过培训的人员，以确保数据完整性和操作员安全。分子测定，包括qPCR和基于测序的方法，需要物理隔离的实验室区域和单向工作流程（样本准备→扩增→检测），以最小化交叉污染。基于细胞培养的测定需要认证的生物安全柜和CO?

口蹄疫（FMD）

口蹄疫（FMD）疫苗传统上是由灭活的全病毒制备的，疫苗效力历来通过动物挑战或PD??效力测试进行评估。监管指南仍然认为基于PD??/VNT的方法是生物效力的参考，但在验证的体外替代方法方面取得了实质性进展，这些方法可以量化完整的免疫原性146S颗粒和抗原质量，以支持批次放行并减少动物使用（

当前挑战

尽管取得了实质性进展，但仍有几个限制因素阻碍了替代方法在兽医疫苗评估中的广泛应用。首先，方法验证仍然需要大量资源，需要大量的数据集来证明其与现有体内测试的等效性或优越性。其次，监管差异仍然存在，不同地区和机构的接受标准和验证期望各不相同。第三，免疫相关因素的定义不完整

验证策略

替代方法的验证应采用适合其用途的方法，明确界定预期用途和接受标准（Magnusson & ?rnemark，2014）。分析验证应解决特异性、灵敏度、准确性、精确度、线性和稳健性（Andreasson等人，2015）。在适用的情况下，必须通过与多个疫苗批次和相关菌株的体内保护的相关性来证明生物学相关性。多站点验证

结论

兽医疫苗评估正在经历一场由伦理要求、科学创新和不断变化的监管期望驱动的根本性转变。虽然基于动物的效力和挑战测试历来是疫苗质量保证的基础，但它们在成本、处理能力、变异性和动物福利方面的局限性日益限制了它们的常规应用。分子、细胞、免疫化学、物理化学和系统级方法的进步现在

伦理批准

不适用

参与同意

不适用。

出版同意

不适用。

未引用的参考文献

(Beck等人，2013；Domon和Aebersold，2006；Junnu等人，2014；美国食品药品监督管理局，2020；世界卫生组织，2022；世界动物卫生组织（WOAH），2022a)

资金

未收到任何资金

CRediT作者贡献声明

Mohamed Samy Abousenna：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草案，可视化，验证，资源，方法学，调查，正式分析，数据管理，概念化。

利益冲突

作者声明他们没有任何利益冲突。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。