《Vibrational Spectroscopy》：Surface-enhanced Raman spectroscopy for the characterization of filtrate portions of blood serum samples of Multiple Myeloma patients using 50?kDa filtration devices and Ag-NPs as SERS substrate
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本研究通过50 kDa超滤离心分离血清低分子量组分（LMWF），结合SERS和AgNPs增强检测灵敏度，发现MM患者与健康人群滤液在561、797、988、1167和1538 cm?1处存在显著差异，PLS-DA模型AUC为0.9204，证实该方法可有效鉴别MM。
阿迪拉·伊斯梅尔（Adeela Ismail）、萨姆拉·阿什法克（Samra Ashfaq）、穆罕默德·伊尔凡·马吉德（Muhammad Irfan Majeed）、哈克·纳瓦兹（Haq Nawaz）、诺辛·拉希德（Nosheen Rashid）、纳贾·阿尔瓦迪（Najah Alwadie）、拉莱布·基兰（Laraib Kiran）、阿拉·迪塔（Allah Ditta）、里夫沙·拉巴尼（Rifsha Rabbani）、福齐亚·萨夫拉兹（Fozia Sarfraz）、阿里杰（Areej）、赛拉·拉姆赞（Saira Ramzan）、法尔扎娜·沙米姆（Farzana Shamim）、穆罕默德·阿尔斯兰（Muhammad Arslan）、穆罕默德·伊姆兰（Muhammad Imran）
巴基斯坦费萨拉巴德农业大学（University of Agriculture Faisalabad）化学系，费萨拉巴德38000
摘要
多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma, MM）是一种血液系统癌症，其特征是骨髓中浆细胞的异常增生，因此需要可靠且无创的诊断方法。表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, SERS）是一种有效工具，可用于区分血清样本中的MM相关生物标志物。血清由低分子量组分（Low-Molecular-Weight Fraction, LMWF）和高分子量组分（High-Molecular-Weight Fraction, HMWF）的生物分子组成。由于HMWF生物分子可能会掩盖LMWF，而后者被认为是早期疾病诊断的关键生物标志物，因此本研究的主要目的是通过50 kDa超滤离心装置处理后分离LMWF组分，并对其进行SERS分析。过滤过程会产生HMWF残留物和LMWF滤液，其中包含分子量低于50 kDa的生物分子。SERS被用来分析MM和健康样本的滤液部分，成功区分了疾病样本与健康样本的滤液。银纳米颗粒（Silver Nanoparticles, AgNPs）作为SERS基底，增强了滤液生物分子的拉曼信号，从而提高了检测灵敏度。区分疾病样本和健康样本的关键SERS光谱峰位于561、797、988、1167和1538 cm?1。通过主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）进行维度降维和偏最小二乘判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis, PLS-DA）等统计工具，进一步提升了SERS的诊断能力。PLS-DA模型的效率通过接收者操作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线进行评估，其曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）值为0.9204，表明该模型在样本分类方面表现优异。
引言
多发性骨髓瘤（MM），也称为浆细胞骨髓瘤，是一种严重的血液系统癌症，其特征是骨髓中恶性浆细胞的异常增殖，导致一系列临床并发症。在老年人中，它是第二常见的血液系统癌症[1]。这种情况在发达国家尤为普遍，包括澳大利亚、西欧和美国，这些地区的发病率最高。2020年，美国记录了约32,000例新病例，占当年所有恶性肿瘤的1.8%[2]，因此MM位列第14大常见肿瘤[3]。MM主要影响老年人，美国的中位诊断年龄为69岁，超过60%的病例发生在65岁及以上的人群中，而55岁以下的人群中发病率不到15%[4]。MM的风险因素包括年龄较大、男性性别、黑人种族、浆细胞疾病家族史以及肥胖。其中，肥胖是唯一可以控制的危险因素[5],[6]。MM的诊断依据CRAB标准，包括高钙血症引起的器官损伤、肾功能衰竭、贫血和骨病变[7],[8]。2014年，国际骨髓瘤工作组（International Myeloma Working Group, IMWG）通过添加三个特定生物标志物（SLiM标准）扩展了MM的诊断标准。只要存在这些生物标志物中的任何一个，就可以诊断出该癌症：骨髓中克隆浆细胞比例达到60%或以上（BMPC），血清游离轻链（Free Light Chain, FLC）比率大于或等于100，或者通过MRI检测到一个或多个病灶（≥5 mm）[9]。标准临床实践中，诊断恶性肿瘤通常需要一系列检查，如实验室分析[10]、尿液检测[11]、骨髓活检[12]、干细胞移植[13]、Bence-Jones蛋白热试验[14]、放射学评估[15]以及血清蛋白电泳[16]。然而，这些方法存在显著缺点，如耗时、具有侵入性且成本高昂。这凸显了对更快、无创且经济高效的MM诊断方法的需求[17]。为了克服上述技术的局限性，采用了拉曼光谱技术。这是一种经济高效、快速且可靠的方法，因能在分子层面预测疾病而被广泛用于疾病诊断[18]。这种振动光谱技术对于识别血清生物分子（如蛋白质、脂质和DNA）的光谱变化非常有效[19]。血液、尿液和血清中都含有多种与疾病相关的生物标志物[20]。体液作为无创癌症筛查和监测的关键介质，因为它们含有可检测的疾病特异性生物标志物[21]。然而，血清的复杂性和低生物标志物浓度常常导致拉曼信号较弱，从而增加了检测和识别的难度[22],[23]。表面增强拉曼光谱（SERS）作为一种高度敏感和专业的分析方法，满足了生物医学科学的需求，提供了显著的信号增强[24]。SERS的高效率、低成本和少量样本需求使其成为疾病检测的理想技术[22],[25]。SERS在分析血清样本以诊断多种疾病（如乳腺癌[18]、卵巢癌[26]、伤寒[27]、乙型肝炎[28]、丙型肝炎[29]等）方面具有巨大潜力。以往关于MM的研究主要使用拉曼光谱和SERS进行血清分析[30],[31]。拉曼光谱用于区分耐药性和敏感性MM细胞系[30]。拉曼光谱分层技术用于通过外泌体分析MM患者[32]。共聚焦拉曼显微镜用于研究MM细胞对蛋白酶体抑制剂的反应[33]。另一项研究结合无标记SERS和多变量分析来非侵入性地区分MM血清样本[17]。与以往的研究不同，本研究采用50 kDa离心过滤从健康和MM受试者的血清中分离LMWF，然后使用AgNPs进行SERS分析，以检测50 kDa滤液样本中的疾病特异性生物分子特征。通过比较滤液的SERS光谱，可以识别MM患者LMWF中的显著生物分子变化，从而与健康个体区分开来。据我们所知，这是首次使用50 kDa过滤技术表征MM血清滤液的研究，为MM检测提供了一种新方法。在化学计量学中，采用PCA和PLS-DA等统计技术分析这些血清样本的SERS光谱组，实现了不同MM阶段与健康对照组的分类和区分。
血液血清样本的采集与制备
血液样本来自巴基斯坦木尔坦Nishtar医院的MM患者和健康人群。本研究共包含60个样本，其中40个来自1-4期的MM患者，20个来自健康个体。样本收集在含有氟化钠或EDTA的试管中，然后进行血清提取。首先通过3000 rpm离心10分钟分离血清。为了获得LMWF，将300 μL血清加载到50 kDa Amicon Ultra-2 mL过滤装置（Merck）中
健康和MM血清滤液的平均SERS光谱比较分析
图1显示了来自健康个体和MM患者的50 kDa血清滤液的平均SERS光谱。MM患者和健康个体血清滤液之间的关键光谱差异用三种类型的线条表示：实线、虚线和点划线。实线代表在所有MM癌症阶段都存在但在健康血清中不存在的峰；虚线表示两种光谱共有的峰结论
本研究开发了一种基于SERS的新技术，用于分析MM患者50 kDa血浆蛋白质组，显示出在检测人类血清中疾病特异性生物分子改变方面的显著效果。结果基于561、625、651、674、836、854、955、988、1167和1538 cm?1处的关键光谱峰，成功区分了健康对照组和不同阶段的MM患者。这一区分是通过分离富含生物分子的血清LMWF实现的
作者贡献
阿迪拉·伊斯梅尔（Adeela Ismail）和萨姆拉·阿什法克（Samra Ashfaq）完成了大部分实验工作，并参与了初稿的撰写、审阅和关键编辑。穆罕默德·伊尔凡·马吉德（Muhammad Irfan Majeed）和哈克·纳瓦兹（Haq Nawaz）监督了整个研究工作并提供了方法指导。纳贾·阿尔瓦迪（Najah Alwadie）和穆罕默德·伊姆兰（Muhammad Imran）提供了财务支持、资源以及关键审查和技术指导，使得项目得以完成。拉莱布·基兰（Laraib Kiran）和里夫沙·拉巴尼（Rifsha Rabbani）也参与了研究出版同意
所有作者均同意发表本文。伦理声明
本研究严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于保护人类受试者的指南（45 CFR 46），并获得了巴基斯坦木尔坦Nishtar医科大学机构伦理审查委员会（IERB）的批准（参考编号2230，日期2024年2月2日）。所有受试者均签署了知情同意书。资金声明
作者感谢沙特阿拉伯利雅得Princess Nourah bint Abdulrahman大学的研究支持项目（项目编号PNURSP2026R478）。作者还感谢沙特阿拉伯King Khalid大学的研究与研究生院通过大型研究项目（项目编号RGP-2/691/46）提供的支持。利益冲突声明
作者没有可能影响本研究结果公正性、客观性或解释的财务或个人利益。
