通过转录组分析和LC-MS/MS技术鉴定Ostrinia furnacalis口腔分泌物中的蛋白质 孙新燕、 胡伟、 王丹、 朱美晨、 辛翠萍、 杨文波、 李慧敏、 曹彦勇

《Insects》：Identification of Oral Secretion Proteins in Ostrinia furnacalis by Transcriptome and LC-MS/MS Analyses Xinyan Sun, Wei Hu, Dan Wang, Meichen Zhu, Cuiping Xin, Wenbo Yang, Huimin Li and Yanyong Cao

　　**简单摘要**
亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）是中国主要玉米生产区的一种破坏性鳞翅目害虫，其幼虫在玉米的关键生长阶段通过钻蛀取食导致严重的产量损失，并通过制造病原体可进入的取食伤口引发次生玉米病害。由于口腔分泌物（OS）在昆虫-植物相互作用中起着关键作用，我们利用整合转录组学–LC-MS/MS方法鉴定了O. furnacalis口腔分泌物中的成分蛋白。生物信息学分析预测了可能参与调节害虫取食行为和诱导玉米防御反应的效应蛋白，如蛋白酶、脱氢酶和过氧化物酶FE4。这项研究丰富了人们对O. furnacalis与其植物宿主之间相互作用机制的理解，并为咀嚼性植食性昆虫口腔分泌物的研究提供了有价值的参考。

**摘要**
亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）的口腔分泌物（OS）在其与宿主植物的相互作用中起着关键作用。为了系统地表征OS的组成和潜在功能，我们使用结合转录组学和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法，从人工饲养的O. furnacalis中鉴定了245种功能注释蛋白。进一步的生物信息学分析预测了16种效应蛋白。随后进行了组织特异性表达检测，以量化这些效应蛋白在唾液腺、肠道和残留组织中的转录水平。在这些基因中，OfGDH2、OfPero2、OfPero3和OfCBP在唾液腺中高表达，OfGDH3、OfRGD、OfEST1、OfEST2、OfMET和Offerrin在肠道中高表达，而OfSP34在唾液腺和肠道中均大量表达。这项研究首次系统地描述了O. furnacalis OS的分子谱型，为未来研究该害虫对宿主的适应机制奠定了坚实的基础。

**1. 引言**
亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）是一种极具破坏性的鳞翅目害虫，其幼虫的钻蛀行为导致中国玉米生产遭受严重产量损失[1,2,3]。它广泛分布于中国所有主要的玉米生产区。这种害虫的寄主范围很广，以玉米、高粱、小米和甘蔗等多种经济作物为食，其中玉米受到的损害最为严重。幼虫表现出典型的钻蛀取食习性，在从幼苗建立到灌浆的关键生长阶段都会侵害玉米植株。早期龄期的幼虫取食心叶，而后期龄期的幼虫则钻入茎秆、穗柄和其他重要植物器官[4,5]。这种取食行为不仅直接消耗了光合作用和储存养分的组织，导致产量损失通常在10%到30%之间（在严重受害的田块中甚至超过50%），还通过钻孔破坏植物的维管系统，导致茎秆断裂和倒伏[6,7]。此外，取食伤口成为病原体的入侵点，引发玉米穗腐病和茎基腐病，从而加剧了受害田块的次生病害发生。再加上其高繁殖力和世代重叠的特点，这种害虫极难控制，对中国国家粮食安全构成了持续而严重的威胁[8,9]。

在植物与植食性昆虫的长期共同进化过程中，植物逐渐发展出复杂的抗植食性防御机制来减轻取食造成的损害，而植食性昆虫也进化出了多种反防御机制来规避或克服植物的防御[10,11,12]。昆虫的口腔分泌物（OS）作为昆虫-宿主界面遇到的主要“分子信使”，已被广泛证明能与植物细胞成分相互作用并参与防御信号传导[13,14,15]。目前关于昆虫OS的研究主要集中在刺吸式植食性昆虫上，而对咀嚼式植食性昆虫的研究相对较少。咀嚼式植食性昆虫的OS包括来自昆虫体内不同组织的唾液腺分泌物和肠道反刍物[16]。唾液主要由下颚腺和唇腺分泌，而肠道反刍物则来源于前肠和中肠[17]。这些分泌物具有多种生物学功能，主要可以分为五类[18]：
(1) 解毒：植食性昆虫以含有多种有毒次生代谢物的植物为食，其OS中含有多种解毒相关酶（如细胞色素P450s、脱氢酶），通过代谢转化减轻植物化感物质的毒性[19,20]；
(2) 消化：OS中的消化酶（如淀粉酶、蛋白酶）对植食性昆虫分解食物底物和吸收养分至关重要。例如，Heliconius melpomene成虫的唾液蛋白酶有助于花粉养分的消化利用[21]；
(3) 调节植物防御反应：昆虫唾液中含有抗氧化酶（如过氧化物酶、过氧化氢酶），可以清除宿主植物中的活性氧（ROS），从而降低被宿主识别的概率[22,23]；
(4) 免疫：鳞翅目昆虫的唾液腺分泌与先天免疫防御相关的蛋白质。例如，Helicoverpa zea唾液中的葡萄糖氧化酶（GOX）和溶菌酶具有显著的抗菌活性，使这些植食性昆虫能够抵抗病原微生物的入侵[24,25]；
(5) 调节植物挥发物释放：OS中的生物活性分子可以调节宿主植物的挥发物释放；这种调节会进一步削弱宿主植物吸引天敌的能力，从而间接影响昆虫的生存和繁殖[26]。

作为植物-昆虫相互作用的关键媒介，昆虫OS既包含能触发植物防御的诱导剂，也包含抑制这种反应的效应蛋白。后者对于确定昆虫的寄主范围及其是否能够成功获取所需养分至关重要[27,28]。因此，鉴定植食性昆虫的唾液成分对于筛选效应蛋白和阐明植物-昆虫相互作用的分子机制至关重要。在本研究中，我们利用基于LC-MS/MS的蛋白质组学方法表征了O. furnacalis幼虫OS的成分谱型，并结合组织转录组数据对这些成分进行了注释，从而筛选出可能参与调节植物防御反应的多种效应蛋白。这项工作为理解O. furnacalis与植物之间的相互作用提供了直接的分子见解，并为开发针对性的害虫管理策略提供了新的靶点。

**2. 材料与方法**
2.1. 生物材料
O. furnacalis种群购自济源科云生物有限公司（中国济源）。这些昆虫在14 L:10 D光照周期和26 ± 2 °C的温度下人工饲养。为了获取不同组织的样本，我们解剖了第四龄期幼虫的唾液腺和肠道，并将这些组织与残留组织一起收集在1× PBS缓冲液中。样品以12,000 rpm的速度离心5分钟，去除上清液后，将剩余样品储存在?80 °C。
2.2. 转录组测序
根据制造商的说明，使用Trizol试剂（15596018，ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）从40对唾液腺和50个残留组织（不包括唾液腺）中提取总RNA。然后使用NanoDrop ND-1000（ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）评估总RNA的数量和纯度，并通过Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）评估RNA的完整性。使用寡(dT)磁珠（25-61005，ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）通过两轮纯化特异性捕获含有PolyA的mRNA。捕获的mRNA在94 °C的高温条件下使用NEBNextR镁RNA片段化模块（New England Biolabs，美国马萨诸塞州伊普斯威奇）进行片段化处理5–7分钟。随后使用逆转录酶（1896649，Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）从片段化的RNA合成cDNA。最后，按照标准程序使用Illumina NovaseqTM 6000（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行双端测序。获取离线测序数据后，首先使用Cutadapt 1.9过滤数据以获得高质量测序数据（Clean Data），去除接头、polyA/polyG区域、含有>5% N的读段以及占序列>20%的低质量读段。然后使用FastQC（v0.11.9，Babraham Institute，英国剑桥）确认序列质量，关键指标包括Q20、Q30和清洁数据的GC含量。此外，这些序列被用作原始蛋白质组数据的专用参考数据库。
2.3. 口腔分泌物收集、蛋白质提取和消化
收集OS时，用拇指和食指轻轻夹住第四龄期幼虫，用0.1–10 μL的移液器尖端轻轻触碰口腔。为了获得足够的蛋白质量，从多个批次和时间点收集了三组独立的OS样本。将OS样本收集到试管中并储存在?80 °C。向样本中加入适量的2%脱氧胆酸盐裂解液，在95 °C下加热10分钟，然后用超声波破碎器处理（总时间10分钟，每次处理2秒，间隔2秒）。随后以20,000× g的速度离心20分钟，去除上清液后加入10 mM DTT，在37 °C下用水浸泡1小时，再加入20 mM IAA并在黑暗中孵育30分钟。最后取150 μg蛋白质，加入3 μg胰蛋白酶（蛋白质:酶的比例为50:1），并在37 °C下孵育14–16小时。酶消化的肽段使用固相萃取柱脱盐后真空干燥。干燥的肽段储存在?20 °C。
2.4. 纳米液相色谱-质谱（Nano-LC-MS/MS）分析
将干燥的肽样本用0.1% FA重新溶解，然后以20,000× g的速度离心10分钟。收集上清液并注入自加载C18柱。分离过程使用Thermo Scientific EASY-nLCTM 1200系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行，流速为300 nL/min，采用以下有效梯度：
- 0至103分钟：溶剂B（98% ACN，0.1% FA）线性增加至27%；
- 103–111分钟：溶剂B从27%增加至40%；
- 111–113分钟：溶剂B从40%增加至90%；
- 113–120分钟：90%溶剂B。分离出的肽段通过纳米电喷雾离子化（nano-ElectroSpray Ionization）后转移到Orbitrap ExplorisTM 480质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行DDA（数据依赖性采集）模式检测。参数设置如下：离子源电压2.2 KV；一级MS扫描范围350–1500 m/z；分辨率60,000；归一化AGC目标300%；最大离子注入时间（MIT）20 ms；二级MS碎片化模式HCD。碎片化能量设置为32%；分辨率设置为15,000；动态排除时间60秒。二级MS的起始m/z固定为110；二级碎片化的母离子筛选条件为电荷2+至6+；归一化AGC目标设置为标准值，MIT为22 ms。使用MaxQuant软件（v2.6.6.0，Max Planck Institute of Biochemistry，德国马丁斯里德）分析DDA无标记MS/MS数据，参数设置如下：类型：标准；酶：胰蛋白酶/P；最大遗漏切割次数：2；固定修饰：氨基甲酰甲基（C）；可变修饰：氧化（M）和乙酰（蛋白质N端）；前体质量容忍度：20 ppm；片段质量容忍度：0.05 Da；启用运行间和第二个肽段的匹配。所有其他参数保持默认设置。MS数据通过蛋白质数据库进行转录预测。最小独特肽数量设置为1，PSM和蛋白质水平的FDR阈值设置为1%。将来自污染物或反向修饰的蛋白质去除。
2.5. 生物信息学分析
使用DESeq2对两组数据进行差异基因表达分析。假发现率（FDR）< 0.05且绝对倍数变化≥ 2的基因被鉴定为差异表达基因（DEGs）。通过输入基因表达矩阵，使用Signal2Noise标准化对基因进行排序，计算富集分数和Q值（默认参数），并将|NES| > 1、NOM p值< 0.05和FDR q值< 0.25的GO术语视为两组间显著不同。使用OmicStudio工具（https://www.omicstudio.cn/tool，访问日期2026年3月1日）进行基因本体（GO）分析和Venn分析[30]。SignalP 6.0 Server（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/，访问日期2025年8月9日）用于确定信号肽。SecretomeP-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SecretomeP-2.0/，访问日期2026年3月4日）用于预测非经典分泌蛋白。THMHH Server v. 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/，访问日期2025年8月9日）用于预测蛋白质中的跨膜螺旋结构。定量PCR (qPCR) 分析
从四龄幼虫中提取了20个唾液腺、20个肠道和10个剩余组织（不包括唾液腺和肠道）的样本，并进行了三次生物学重复实验。按照上述方法提取总RNA。使用PrimeScriptTM RT试剂盒和gDNA Eraser (RR047A, TAKARA, Kyoto, Japan) 合成第一链cDNA以去除基因组DNA。使用NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome, 访问日期2026年1月7日) 设计特异性引物。选择O. furnacalis的管家基因elongation factor 1-alpha (EF1a, GeneBank登录号XM_028314033.1) 作为内参。引物列表见表S1。实时qPCR实验使用TB Green? Premix Ex TaqTM II (RR820A, TAKARA, Kyoto, Japan) 试剂盒。反应程序如下：首先在95°C下变性5分钟，然后进行40个循环，每个循环包括95°C 10秒、60°C 20秒和72°C 20秒；接着进行熔解曲线分析，条件分别为95°C 15秒、60°C 1分钟和95°C 15秒。目标基因在不同组织中的相对定量采用2?ΔΔCt方法进行[31]。

3. 结果
3.1. O. furnacalis的转录组分析
为了更全面地了解O. furnacalis的分泌组(OS)组成，使用Illumina NovaseqTM 6000测序平台从唾液腺和剩余组织（不包括唾液腺）中生成cDNA文库。随后对六个cDNA文库（三个唾液腺样本和三个剩余组织样本）进行转录组测序，共获得34.55 G的纯净数据；其中Q30百分比达到96.19%（表S2）。本研究建立的转录组数据库质量高且可靠，适合后续分析。该数据库已存入美国国家生物技术信息中心(NCBI)的Sequence Read Archive (SRA)，登录号为PRJNA1408563。层次聚类热图显示样本间存在强烈相关性（图1a）。为了可视化差异表达基因(DEGs)的分布，构建了火山图。结果显示，在Sg组和Res组之间的比较中鉴定出5812个DEGs，其中1826个基因在唾液腺组织中高表达，3986个基因在剩余组织中高表达（图1b）。随后通过GSEA富集分析这些基因的功能特征。结果显示，唾液腺组织中前三位显著富集的术语是细胞质翻译、胞质大核糖体亚基和核糖体；而在剩余组织中则是中胚层发育、过氧化物酶体和脂肪酸β氧化（图1c）。

3.2. O. furnacalis分泌组的蛋白质组分析
通过LC-MS/MS分析从O. furnacalis分泌组中鉴定出316种蛋白质（表S3）。LC-MS/MS蛋白质组数据已公开存入iProX合作伙伴仓库，数据集标识符为PXD075177。根据功能，这些蛋白质被分为六类：(1) 酶类，包括氧化还原酶、GTP酶、激酶、水解酶、肽酶、葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、蛋白酶、转移酶、裂解酶、异构酶和ATP合成酶；(2) 转运蛋白，包括内质网-高尔基体转运蛋白、高尔基体-质膜转运蛋白、脂质转运蛋白、蛋白质转运蛋白和双链RNA转运蛋白；(3) 细胞骨架蛋白；(4) 结合或调节DNA、RNA、金属离子、几丁质、ATP、碳水化合物和蛋白质的蛋白；(5) 其他非酶类蛋白，如泛素、核糖体蛋白、细胞器蛋白、血清蛋白和信号转导蛋白；(6) 未知蛋白。对鉴定出的蛋白质进行GO分析，前20个代表性GO富集生物过程见图2。GO富集散点图显示，五个显著富集的术语是细胞外区域、细胞外空间、羧酸酯水解酶活性、丝氨酸型内肽酶活性和蛋白水解。

3.3. 分泌组蛋白质的联合分析
在316种鉴定出的蛋白质中，245种具有功能注释。进一步分析实验生成的转录组数据发现，其中207种蛋白质在唾液腺和剩余组织（包括唾液和肠道反刍物）中均有表达。37种蛋白质仅在剩余组织中表达（肠道反刍物），在Sg组中的FPKM值为0；而只有1种蛋白质仅在唾液腺中表达，在Res组中的FPKM值也为0（图3）。图3显示了唾液腺、剩余组织和口腔分泌物中表达蛋白质的关系。分泌蛋白是昆虫唾液蛋白的核心成分，其中通过内质网-高尔基体途径分泌的经典分泌蛋白具有单一信号肽且不含跨膜结构域[31]。基于这一标准，我们通过生物信息学方法分析了这些蛋白质的信号肽和跨膜结构域。结果显示，107种在唾液腺和剩余组织中均表达的蛋白质具有经典分泌蛋白的结构特征（单一信号肽且不含跨膜结构域）；相比之下，32种仅在剩余组织中表达的蛋白质符合这些结构特征。由于其余蛋白质不符合经典分泌蛋白的结构标准，因此推测它们通过非经典分泌途径或其他未知机制进行分泌。使用SecretomeP预测，其中34种蛋白质可能通过非经典分泌途径分泌（表S4）。

3.4. 假定效应蛋白的预测
咀嚼昆虫释放的分泌组(OS)可诱导宿主植物中特定细胞内信号通路的激活。这通过调节细胞信号（如胞质Ca2+升高、质膜去极化、ROS和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路）触发基础免疫反应，最终导致植物激素介导的直接和间接防御[13,32,33,34,35]。这些包括多种酶（金属蛋白酶、蛋白酶抑制剂、剪接结构域丝氨酸蛋白酶、GOX、脂肪酶、过氧化物酶和酯酶）、钙结合蛋白和气味结合化学感受蛋白[27,33]。根据本研究鉴定的蛋白质的功能注释，将假定的效应蛋白分为四类（酶类、解毒蛋白、钙结合蛋白和其他蛋白），并列表于表1。

3.5. 假定效应蛋白基因的组织特异性表达
分泌组是介导昆虫-植物相互作用的关键因素，主要由昆虫唾液腺和肠道组织合成和分泌[48]。编码这些分泌候选蛋白的基因的组织特异性表达模式与其合成部位的组织特性和生物学功能密切相关。阐明这些表达模式是解析这些蛋白功能和机制的关键前提。因此，我们解剖了O. furnacalis的唾液腺和肠道，并使用RT-qPCR检测和分析目标基因在唾液腺、肠道和剩余组织（不包括唾液腺和肠道）中的表达水平和分布特征。值得注意的是，OfGDH2、OfPero2、OfPero3和OfCBP在唾液腺中高表达，OfGDH3、OfRGD、OfEST1、OfEST2、OfMET和Offerrin在肠道中高表达，而OfSP34在唾液腺和肠道中均大量表达（图4）。图4显示了O. furnacalis中假定效应蛋白编码基因的组织特异性表达。基因表达通过使用O. furnacalis组织的cDNA进行qRT-PCR分析。平均值（±SD）代表三次重复实验的结果。同一列中不同的字母表示显著差异（p < 0.05，Tukey’s HSD多重检验）。EF1α管家基因作为内参，相对表达通过2?ΔΔCt方法计算。

4. 讨论
植食性昆虫的取食是一个关键的生物学事件，会触发植物-昆虫相互作用，引起植物的一系列生理和生化代谢变化、细胞信号通路的级联激活以及防御相关基因的表达调控[27,35]。作为关键信号分子的植食性昆虫分泌组已被广泛证实为激活和精确调控植物反应的核心因素。目前研究昆虫分泌组的方法涉及手动收集复杂的分泌组样本（如昆虫唾液和肠道反刍物），然后用于后续的定性和定量分析。结合体外和体内实验，这种方法是目前阐明分泌组介导植物-昆虫相互作用分子机制的重要手段。在本研究中，我们使用LC-MS/MS鉴定出245种具有功能注释的蛋白质。结合转录组结果，分析显示其中207种蛋白质同时存在于唾液腺和肠道反刍物中，37种蛋白质仅来源于肠道反刍物，1种蛋白质仅存在于唾液腺中。基于这些蛋白质的功能注释信息，初步筛选并预测了16种假定效应蛋白。除了LOC114363884在原始表达数据中组内变异较大，两组间无显著差异外，所有其他候选基因在转录组数据中均表现出显著差异（表S4）。此外，qPCR结果显示OfSP7、OfalGDH、Ofpero1和Ofobs-E在唾液腺和肠道中的表达水平极低。鉴于效应蛋白通常需要在这些组织中高表达才能对宿主植物的防御机制发挥作用，因此在唾液腺或肠道中高表达的蛋白质更有可能作为效应蛋白。因此，在本研究中，我们进一步预测OfGDH2、OfGDH3、OfPero2、OfPero3、OfRGD、OfEST1、OfEST2、OfMET、Offerrin和OfSP34为潜在效应蛋白，它们与昆虫取食和植物防御反应有关。

昆虫咀嚼口器释放的分泌组包含由头部腺体主动分泌的唾液和通过食道逆向收缩输送到口腔的肠道反刍物[16,17,49]。我们的研究发现，同时在唾液腺和肠道中表达的蛋白质具有广泛的功能多样性，涵盖基本细胞过程、消化代谢、免疫防御和发育调控。相比之下，肠道特异性蛋白质具有高度专业化的功能，主要参与三个核心生理过程：消化降解、局部免疫和营养利用。两者的功能差异体现在多个方面。在消化酶系统方面，共表达的蛋白质主要包括保守的通用消化酶，如羧肽酶B类和胰蛋白酶碱性A/B/C类，能够降解常见营养底物[50,51]；还包括参与昆虫-宿主相互作用的唾液腺特异性酶（如毒液丝氨酸蛋白酶34类、毒液二肽肽酶4类）以及水解酶（如几丁质酶、β-N-乙酰葡糖胺酶）[52,53,54]。肠道特异性蛋白质则编码专门针对复杂饮食底物的酶（如胶原酶、α-淀粉酶），从而补充肠道消化过程[55]。在免疫防御系统方面，共表达的蛋白质包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶亚单位蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂。这些分子清除氧化应激产物，抑制多种微生物（包括细菌和真菌），并调节酚氧化酶级联反应，从而介导广谱防御[23,56,57,58]。相比之下，肠道特异性蛋白质主要富含肽聚糖识别蛋白(PGRPs)，这些蛋白作为识别革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的核心受体，特异性调节肠道细菌和共生菌群的平衡，防止菌群失调和病原体入侵，从而介导局部靶向免疫[59]。它们协同调节昆虫的关键生物过程，包括食物消化、宿主相互作用和生存防御。

昆虫唾液中的酶是介导植食性昆虫与其宿主植物相互作用的关键功能分子，在营养消化和防御调节中起重要作用，并作为昆虫适应宿主环境的候选因子[21,24,27,60,61]。然而，直接支持这些酶调节功能的证据非常有限，它们在昆虫-植物相互作用中的具体作用机制只能通过组学鉴定和生理生化分析初步推断。这些酶包含多个功能不同的家族。在这些蛋白质中，一些蛋白酶可能会降解植物细胞结构蛋白或选择性切割植物免疫途径中的关键信号成分，从而减弱宿主的防御反应；脱氢酶可能清除植物次生代谢物降解过程中产生的有毒物质，从而减轻植物化学防御的毒性并维持昆虫体内的氧化还原平衡。解毒酶是植食性昆虫克服植物化学防御并实现取食适应的核心功能群，相关研究长期以来一直是昆虫-植物相互作用领域的研究重点和热点。迄今为止，在多个解毒酶家族的研究中已经取得了显著进展。对于羧酯酶而言，对酯酶FE4的研究系统地阐明了其在农药代谢、植物酯类防御物质的解毒以及氧化应激耐受性中的多功能作用。此外，不同昆虫物种中的酯酶FE4同源基因在宿主适应方面表现出物种特异性特征[41,42,62]。过氧化物酶家族的研究主要集中在氧化还原平衡的调节和酚类化合物的解毒上；由Apolygus lucorum中的Al6和Sitobion avenae中的SaE23编码的谷胱甘肽过氧化物酶通过清除植物活性氧（ROS）、抑制程序性细胞死亡（PCD）以及干扰植物防御信号通路来发挥其生物学功能[22,39,40]。这些研究阐明了羧酯酶和过氧化物酶等核心解毒酶的酶学特性和功能分化，揭示了它们在昆虫-宿主共同进化过程中的分子基础，并为解码唾液效应蛋白网络的协调调控机制提供了重要的研究范例。

昆虫唾液中的钙相关蛋白是植食性昆虫调节宿主植物防御并实现取食适应的重要候选效应蛋白[34]。针对刺吸式昆虫（尤其是飞虱）中这些蛋白的研究已经鉴定出一些代表性成员，如EF-hand结构域蛋白（NlSEF1、LsECP1）和钙调蛋白。这些效应蛋白通过结合宿主细胞内的Ca2+、抑制ROS爆发和防御激素通路以及破坏韧皮部物理屏障等机制发挥作用[43,44,63,64]。这种潜在的功能保守性可能是由于植食性昆虫需要对抗宿主植物依赖Ca2+介导的防御反应——这是植物对抗昆虫取食的一种普遍防御策略。相比之下，咀嚼式昆虫唾液中的钙相关蛋白的研究仍处于早期阶段，主要依赖于同源性推断。基于刺吸式昆虫中观察到的功能保守性，可以合理推测咀嚼式昆虫唾液中的钙相关蛋白（例如regucalcin样蛋白和其他O. furnacalis中的钙结合蛋白）可能具有保守的核心功能，如调节宿主Ca2+平衡和抑制植物ROS爆发及防御激素信号传导，以促进取食适应。解析这些蛋白的效应功能为阐明咀嚼式昆虫的损伤机制和探索针对唾液效应蛋白的新抗虫靶点提供了重要的理论基础。

尽管在口腔分泌物中鉴定出的许多蛋白质缺乏典型的N端信号肽，但这些蛋白质仍可能通过非经典分泌途径或其他未知机制释放到细胞外环境中。为了更好地表征它们的分泌潜力，我们使用了SecretomeP进行分泌预测，该工具专门用于识别通过非经典途径分泌的蛋白质[65]。除了经典的依赖于信号肽的分泌途径（经过内质网和高尔基体）外，非经典分泌还包括直接跨膜转运、通过外泌体或微囊泡输出、溶酶体介导的释放以及细胞裂解时的被动释放[66,67,68]。这些替代途径可能解释了口腔分泌物中存在无典型信号肽的蛋白质的原因，从而更全面地了解了O. furnacalis的分泌机制。

本研究仅鉴定出了人工饲养的O. furnacalis幼虫唾液中先前报道的一部分效应蛋白。我们认为这一现象的原因在于，虽然人工饲料满足了幼虫的基本营养需求，但缺乏驱动效应蛋白合成和分泌的关键诱导信号——特别是由玉米细胞壁成分、次生代谢物和取食相关机械刺激自然引发的信号。因此，这些效应蛋白的表达量显著降低。这些发现表明，人工饲料饲养系统在鉴定和功能表征唾液效应蛋白方面存在固有局限性，进一步验证这些效应蛋白的天然表达谱和功能特性需要结合自然宿主饲养系统进行综合分析。为了解决这一局限性，未来可以利用以玉米为食的O. furnacalis幼虫进行的研究，通过比较人工饲养和玉米饲养幼虫的效应蛋白谱型，从而阐明饲料依赖性的效应蛋白表达模式。这种比较分析有助于区分那些不受饮食条件影响而稳定表达的组成性效应蛋白和那些通过与玉米组织相互作用或取食相关机械刺激触发合成的饮食诱导性效应蛋白。这种区分有助于我们更好地理解调控效应蛋白表达的机制以及昆虫-宿主相互作用的分子基础；此外，来自玉米饲养幼虫的数据将有助于验证这些效应蛋白的天然表达水平和功能意义，从而克服人工饲料饲养系统的局限性。

补充材料：
以下支持信息可在此下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/insects17040357/s1
- 表S1：用于qPCR的假定效应蛋白引物；
- 表S2：O. furnacalis转录组结果总结；
- 表S3：通过LC-MS/MS分析鉴定的O. furnacalis唾液分泌蛋白总结；
- 表S4：通过转录组和LC-MS/MS联合分析鉴定的在唾液和肠道中表达的O. furnacalis唾液分泌蛋白总结。