用于定量和增强检测不饱和短链脂肪酸（FAHFAs）的分析方法的发展

《Analytica Chimica Acta》：Development of Analytical Methods for the Quantification and Enhanced Detection of Unsaturated Short-Chain FAHFAs

短链脂肪酸酯化羟基脂肪酸（SFAHFAs）是肠道内重要的内源性脂质，参与代谢和炎症调节。本研究合成30种未饱和SFAHFAs标准品，建立两种LC-MS/MS分析方法：直接分析法和2-(2-吡啶基)乙胺衍生化法，后者灵敏度提升1000倍（LOD 0.0005 fmol）。通过小鼠肥胖模型和人类轻度认知障碍样本分析，发现运动促进SFAHFA升高，肥胖饮食降低饱和SFAHFA，而人类认知障碍组无明显变化，提示疾病和样本基质特异性。研究为肠道脂质代谢相关疾病提供高灵敏度分析方法。

　　

Rachana M. Gangadhara | Perumalsamy Parasuraman | Divyavani Gowda | Hariom Yadav | Ganesh V. Halade | Shu-Ping Hui | Siddabasave Gowda B. Gowda

日本北海道大学全球食品资源研究生院，札幌

摘要

羟基脂肪酸的短链脂肪酸酯（SFAHFAs）是一类主要存在于肠道中的内源性脂质，在代谢和炎症调节中发挥着重要作用。先前的研究已经使用经过验证的分析方法实现了饱和SFAHFAs的化学合成和定量分析。然而，由于不饱和SFAHFAs的合成复杂性及其在生物样本中的天然低丰度，其检测和定量仍然具有挑战性。在本研究中，我们合成了包含三十种异构不饱和SFAHFAs的综合性内部库，以促进两种基于LC–MS/MS的分析方法的发展：(i) 无需衍生化的直接分析方法以实现可靠定量；(ii) 基于2-(2-吡啶基)乙胺衍生化的灵敏度增强方法。液相色谱-串联质谱技术经过优化，能够实现灵敏且选择性的定量，检测限在0.5至5 fmol之间，定量限在5至50 fmol之间。未衍生化方法用于分析小鼠和人类样本中的粪便SFAHFAs。研究发现，运动增加了饱和和不饱和SFAHFAs的水平，而致肥胖饮食则选择性地降低了饱和SFAHFAs的水平。相比之下，轻度认知障碍患者的粪便样本与健康对照组相比没有显著差异，这表明可能存在疾病和样本特异性的变异性。使用2-(2-吡啶基)乙胺的化学衍生化方法将检测灵敏度提高了约1000倍，检测限为0.0005至0.001 fmol，定量限为0.005至0.01 fmol。本研究提出了一种用于不饱和SFAHFAs的合成、定量和检测的分析方法，为进一步探索其与肠道菌群失调相关的代谢紊乱的作用奠定了基础。

引言

脂质是参与细胞结构、能量产生和信号传导途径的重要生物分子。脂质分析的最新进展已经鉴定出具有显著生理作用的独特生物活性脂质[1]。羟基脂肪酸的脂肪酸酯（FAHFAs）属于脂肪酸酰基家族，由脂肪酸与羟基脂肪酸酯化形成，与代谢健康密切相关[2]。FAHFA的水平通过酶促途径（如脂肪甘油三酯脂肪酶介导的生物合成）动态调节，并受饮食、组织类型和激素状态等因素的影响[3][4]。这些脂质作为信号分子，表现出强大的生物活性，包括抗炎、抗氧化和抗糖尿病作用，并已知能提高胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性[5][6][7][8]。利用液相色谱/串联质谱（LC–MS/MS）的靶向脂质组学技术的发展，实现了FAHFA区域和立体异构体的准确检测，揭示了它们的结构复杂性和功能多样性[9][10][11][12]。尽管取得了显著进展，许多FAHFA种类仍未被充分表征，阐明其在不同代谢状态下的调控机制和作用仍然是重要的研究领域。

通过非靶向脂质组学研究，我们发现了一类新的FAHFAs亚类，称为羟基脂肪酸的短链脂肪酸酯（SFAHFAs）[13]。这些脂质由短链脂肪酸（如乙酸、丙酸和丁酸）与长链羟基脂肪酸酯化形成，主要存在于肠道中[14]。先前的研究表明，高脂饮食喂养的大鼠结肠内容物中的SFAHFAs水平较低，而流感感染小鼠的粪便中SFAHFAs水平较高，表明这些脂质对代谢压力有动态响应[13][15]。有趣的是，抗生素处理显著降低了小鼠和人类粪便样本中丙酸和丁酸衍生的SFAHFAs的水平，表明其产生依赖于肠道微生物群的活性[16][17]。在感染Campylobacter jejuni的鸡的盲肠内容物中观察到某些SFAHFAs（如羟基十五烷酸的丁酸酯和己酸的戊酸酯）水平升高，低蛋白饮食喂养的猪仔中也观察到了类似的现象[18][19]。磷脂酶A2 IIA（Pla2g2a）缺乏的小鼠粪便样本中SFAHFAs浓度较低，表明该酶具有调节作用[20]，而在乙醇喂养小鼠的结肠冲洗样本中进一步观察到乙酸衍生的SFAHFAs减少[21]。最近的一项研究显示，65岁及以上患有神经认知障碍的个体的粪便样本中SFAHFAs水平降低[22]。这一发现强调了这些脂质在肠道和大脑健康中的作用，突显了它们在代谢、感染和神经系统疾病等多种条件下的重要性。总体而言，这些发现表明SFAHFAs是宿主与微生物群之间的关键介质，可能作为肠道健康的潜在生物标志物。

现有的SFAHFAs分析方法主要依赖于半定量方法，但由于这些脂质在生物样本中的丰度较低，往往缺乏足够的精度。准确定量需要使用靶向分析方法；然而，由于缺乏商业可用标准品，这类方法的开发进展受到限制。为了解决这一限制，我们之前合成了全面的饱和SFAHFA标准品，并建立了经过验证的LC–MS/MS方法进行靶向定量[23]。尽管这种方法对饱和物种有效，但不饱和SFAHFAs尚未得到充分表征，也未进行定量研究。在早期研究中，我们采用了mCPBA（间氯过氧苯甲酸）氧化脂质双双键的鉴定策略；然而，缺乏真实标准品限制了该方法的定量精度[15]。与饱和脂质相比，不饱和脂质具有更高的膜流动性、改变的受体结合特性和不同的信号功能，精确定量不饱和SFAHFAs可能会揭示肠道脂质代谢的先前未被认识到的方面[24]。

在本研究中，我们从六种不饱和脂肪酸（C16–C24）合成了三十种不饱和SFAHFAs异构标准品和四种同位素标记的内标（IS），并开发并优化了LC–MS/MS方法用于不饱和SFAHFAs的绝对定量。通过整合饱和和不饱和异构体的分析，我们建立了一个涵盖所有SFAHFAs谱型的统一LC–MS/MS平台。该工作流程应用于接受致肥胖饮食并进行了运动干预的小鼠以及轻度认知障碍人类的粪便样本。为了提高检测灵敏度，首次采用了2-(2-吡啶基)乙胺（PEA）衍生化方法进行SFAHFAs的检测和结构表征。这种方法能够全面且定量地评估SFAHFAs，并为阐明其在肠道和相关代谢紊乱中的作用提供了新的机会。

材料

乙酰氯、丙酰氯、己酰氯、亚油酸、乙醚（Et₂O）、液相色谱-质谱（LC–MS）级氯仿（CHCl₃）、异丙醇和硫酰氯购自Fujifilm Wako Pure Chemical Industries（日本东京）。乙酸-d₄、三乙胺（TEA）和2-(2-吡啶基)乙胺（PEA）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。棕榈油酸、油酸、芥酸、神经酸、氘代氯仿（CDCl₃）和丁酰

不饱和SFAHFAs的化学合成

建立了一种用于克级生产一系列不饱和SFAHFAs的顺序合成方法，如图1所示。从市售的碳链长度为C16:1、C18:1、C18:2、C20:1和C24:1的不饱和脂肪酸开始，第一步是在室温下通过锂二异丙胺（LDA）介导的烯醇化反应形成α-羟基化产物，使用先前报道的方法生成不饱和2-羟基脂肪酸（2-HFAs）

结论

在本研究中，我们成功合成了不饱和SFAHFAs标准品，并开发了一种可靠的LC–MS/MS方法对其进行精确和灵敏的定量。该方法显示出高灵敏度，检测限在低飞摩尔范围内。结合先前开发的饱和SFAHFAs标准品，能够在22分钟的分析时间内全面分析85种分子物种。这突显了该方法的效率和可靠性。

AI披露

本手稿的制备过程中未使用AI辅助技术（仅用于检查语法和拼写）。

CRediT作者贡献声明

Shu-Ping Hui：撰写 – 审稿与编辑、资源获取。 Siddabasave Gowda B. Gowda：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、资源管理、方法论、研究、资金获取、概念化。 Perumalsamy Parasuraman：撰写 – 审稿与编辑、方法论、数据管理。 Divyavani Gowda：撰写 – 审稿与编辑、可视化、方法论、数据管理。 Hariom Yadav：撰写 – 审稿与编辑、资源管理。 Ganesh V. Halade：

利益冲突声明

作者没有需要披露的利益冲突。

数据可用性

数据可应相应作者的要求提供。

资助

本研究得到了日本学术振兴会和JST SPRING（资助编号JPMJSP2119）的支持。该研究还得到了日本学术振兴会 KAKENHI（资助编号：25K00258、25K15935）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢全球食品、土地和水资源中心（GCF）和北海道大学对研究费用的支持。同时感谢Editage Japan提供的英语语言编辑服务。作者还感谢Microbiome in Aging Gut and Brain（MiaGB）联盟提供用于本研究的人类样本。

缩写列表

FAHFA

羟基脂肪酸的脂肪酸酯

SFAHFA

羟基脂肪酸的短链脂肪酸酯

2-AAHPA

2-乙酸的羟基棕榈油酸酯

2-PAHPA

2-丙酸的羟基棕榈油酸酯

2-BAHPA

2-丁酸的羟基棕榈油酸酯

2-VAHPA

2-戊酸的羟基棕榈油酸酯

2-CAHPA

2-己酸的羟基棕榈酸酯

2-AAHOA

2-乙酸的羟基油酸酯

2-PAHOA

2-丙酸的羟基油酸酯

2-BAHOA

2-丁酸