自组装界面的抗污能力依赖于官能团：通过模拟与实验相结合的方法来提升基于适配体的生物传感器的性能

《Applied Surface Science》：Functional group-dependent antifouling ability of self-assembled interface: a combined simulation and experimental study for enhancing aptamer-based biosensor

抗生物膜涂层设计及分子动力学模拟在FET生物传感器中的应用研究，通过比较不同功能基团自组装单分子层（SAMs）对血清白蛋白（HSA）的抗吸附性能，结合实验验证，发现MTG和ADT修饰的传感器对3-羟基-DL-色氨酸（3-HK）检测限低至6.6 fM，且在血清中表现出优异的恢复率。

　　

陈宇|童家军|刘毅伟|青太平|曹觉贤|刘晓峰

湖南先进传感与信息技术研究院，湘潭大学智能碳材料与先进传感湖南省重点实验室，中国湖南省湘潭市411105

摘要

基于适配体的电生物传感器在复杂的生物系统中面临着非特异性吸附和德拜屏蔽的挑战。小分子自组装单层（SAMs）作为阻挡层具有潜力，因为它们对适配体构象的影响最小，并且具有固有的抗污性能。然而，SAM抗污性能与官能团化学性质之间的不明确关系阻碍了合理的设计。我们利用人血清白蛋白（HSA）作为模型蛋白，通过分子动力学模拟和实验分析系统研究了不同官能团的SAM在金膜上的抗污性能。通过综合评估（包括吸附速率、残基、相互作用能、氢键数量和实验结果），不同SAM在HSA上的抗污能力排序如下：MTG > ADT > ME ≈ MESNA > TGA > CYS。同时，通过构建基于适配体的场效应晶体管（FET）生物传感器来检测3-羟基-DL-色氨酸（3-HK），验证了SAM改性的抗污效果和生物传感性能。该生物传感器的检测范围为1 fM至100 nM，检测限低至6.6 fM。此外，MTG改性的生物传感器在血清中的回收率表现出色（92.5%至108%）。本研究为设计具有抗污涂层的生物传感器提供了结构-性能关系的指导。

引言

电分析方法，包括电化学和场效应晶体管（FET）技术[1]，[2]，[3]，[4]，广泛应用于环境质量控制/分析、临床诊断和食品安全检测[5]，[6]。生物传感器中的关键识别元件通常包括酶、抗体和适配体。其中，适配体[7]是短单链核酸，不仅像抗体一样对各种目标表现出高亲和力和特异性，而且体积更小，化学修饰也更容易[8]，[9]，[10]，[11]，[12]。适配体的这些特性使它们成为生物传感应用的最佳识别元件[13]，[14]。然而，在基于适配体的电化学生物传感器的实际应用中仍存在几个关键挑战，非特异性吸附和德拜屏蔽效应是最主要的障碍[15]。在复杂的生物样本中，非特异性结合会严重降低检测准确性，导致假阳性、信号清晰度降低和目标检测受阻[12]，[16]。此外，在高离子强度的生理样本中，传感深度严格限制在德拜屏蔽长度内。因此，即使高性能的抗污材料，如聚合物刷和凝胶，如果其厚度超过这个临界范围，也会不可避免地降低传感器的灵敏度。因此，开发一个能够有效防止不需要的生物分子粘附同时避免电子信号屏蔽的强大抗污传感平台对于提高临床环境中的生物传感器性能至关重要。

在过去十年中，聚合物刷在防止电生物传感器表面受到非特异性生物污染方面非常有效[17]，[18]，[19]，[20]。然而，在高离子强度溶液中，聚合物刷的德拜屏蔽长度较短，这使得相关应用变得困难[21]。当信号报告物的作用超出德拜长度时，静电相互作用会被屏蔽，导致短程力（例如氢键、疏水效应）成为识别的主要驱动力。这种现象大大降低了特异性和灵敏度。这些策略，如聚合物刷、凝胶[22]，[23]和蛋白质阻挡[24]，过于厚重，会在生物传感界面屏蔽德拜长度以外的信号结合，从而阻止传导[25]。此外，用适配体改性的FET生物传感器的操作依赖于目标结合的适配体形成更高阶的结构，与未结合的目标相比[26]。这种构象变化会导致导电信号的变化。因此，长链抗污分子的交联及其相关的空间阻碍可能会抑制适配体的构象转变，最终导致传感机制的失败。尽管抗污性能较弱，小分子SAMs更适合用作电生物传感器的阻挡层[27]。

亲水性抗污分子[28]，[29]和两性离子系统[30]，[31]，[32]，[33]是电生物传感中的重要策略。亲水基团和带电功能团通过电子捐赠/接受相互作用在决定抗污性能方面起着关键作用[34]。疏水层，如全氟烷烃衍生物、金刚烷基化合物和类脂结构也表现出优异的抗污性能[35]，[36]，[37]。它们的性质来源于通过空间排斥和界面能量调节起作用的关键功能团。同时，两性离子化合物由于其优异的两亲性而在抗污性能方面表现出色。它们相反电荷的基团与水分子形成强氢键，形成密集的水合层，有效防止生物分子粘附[32]，[33]。到目前为止，不同功能团的具体抗污机制尚不完全清楚，可能导致对不同污染物的响应差异。

本研究评估了具有不同官能团的SAM对人血清白蛋白（HSA）的抗污性能。该研究结合了分子动力学模拟和实验，并展示了这些SAM在FET生物传感器中的应用（图1）。计算建模对于解码SAM表面与抗污效果之间的分子级相关性至关重要。这些模拟能够详细表征SAM-HSA界面的结构构象、界面动力学和结合机制。此外，通过表征实验验证其效果，并从多个角度观察蛋白质的吸附情况也是不可或缺的。这种综合的实验-理论策略揭示了官能团依赖的蛋白质吸附抗性的机制。此外，还开发了一种利用适配体的FET生物传感器来检测3-羟基-DL-色氨酸（3-HK）。3-HK是色氨酸代谢途径中的一个关键节点[38]。它不仅作为评估免疫和神经炎症的敏感生物标志物，还具有固有的神经毒性[39]，[40]。临床方法，如LC-MS/MS，为其在疾病分层和治疗效果监测中的应用提供了基础。在健康人群中，参考上限通常低于0.13 μM，实际平均浓度更低（约12 nM）[41]，[42]。这强调了高灵敏度和精确量化3-HK的必要性。然而，血浆中HSA的浓度（0.5–0.75 mM）大约是3-HK的10^4倍。鉴于HSA容易吸附在裸金电极上[43]，即使是最微小的非特异性吸附也会对生物传感器界面造成显著挑战，严重影响3-HK检测的准确性和灵敏度。因此，有效抑制HSA的污染对于在复杂系统中可靠检测低丰度目标（如3-HK）至关重要。实验结果表明，用MTG和ADT阻挡的FET生物传感器在血清样本中对3-HK的检测表现出色。所得到的结构-性能关系基于适合生物传感器传感界面的抗污涂层的设计原则。

部分摘录

模拟模型

为了关注分子之间的主要相互作用并提高计算效率，我们仅使用了Au（111）晶格结构作为金基底的金属结构。具有不同官能团的小分子的分子式分别为2-巯基乙醇（ME，C2H6OS）、2-巯基乙烷磺酸（MESNA，C2H6O3S2）、甲基硫甘醇（MTG，C3H6O2S）、1-金刚烷硫醇（ADT，C10H17S）、硫甘酸（TGA，C2H4O2S）和半胱氨酸（CYS，C3H7NO2S）。拓扑文件

通过MD模拟研究不同SAM的抗污效果

我们通过构建和优化初始模型获得了最佳模拟条件（初始距离为0.8 nm，HSA位于底部，CNaCl = 136 mM），详细信息可以在补充说明和图S5-7中找到。在这些条件下，我们使用全原子分子动力学模拟（图2a）研究了小分子与HSA之间的相互作用。均方根误差（RMSD）表明HSA构象在大约30 ns时保持稳定（

结论

在这项研究中，我们系统比较了具有不同官能团的小分子SAM的抗污性能，并通过理论模拟和实验验证了它们之间的关系。模拟结果显示，CYS（氨基和羧基）在HSA上表现出最高的吸附残基和氢键数量，以及与HSA最强的相互作用能量。TGA（羧基）和ME（羟基）排名第二，其中ME容易吸引

CRediT作者贡献声明

陈宇：撰写——原始草稿、方法论、研究、形式分析、数据管理、概念化。童家军：研究、形式分析。刘毅伟：研究、形式分析。青太平：研究、数据管理。曹觉贤：撰写——审阅与编辑、资源、项目管理。刘晓峰：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家研究与发展计划（项目编号：2022YFB3204400）、国家自然科学基金（22204136、62404193和U22A20617）、湖南省自然科学基金（项目编号：2024JJ6425）、湖南省教育厅科学研究基金（23B0140）以及湘潭市科学技术局的关键项目（编号：ZX-ZD20240001）的支持。