一种基于适配体-自噬-连接化合物策略的创新蓖麻毒素降解解毒剂

《International Journal of Biological Macromolecules》：An innovative ricin-degrading antidote based on aptamer-autophagy-tethering compound strategy

靶向降解内毒素的aptamer-ATTEC策略研究为生物威胁提供新疗法。

　　

Jiawei Zhang|Zhenfang Xu|Shuangshuang Liu|Xiwei Wang|Feiyan Wang|Yunhui Chen|Xueling Ma|Danhao Li|Aiping Zheng|Weiguo Shi|Liang Xu

中国人民解放军军事医学科学院，北京，100850

摘要

蓖麻毒素因其高毒性和易获取性被归类为B类生物威胁剂，对公共安全构成重大威胁。目前尚无有效的解毒剂获得批准，而包括小分子抑制剂、抗体和疫苗在内的医疗对策的开发面临诸多挑战。在这项研究中，我们基于适配体-自噬体连接化合物（aptamer-ATTEC）策略设计了创新的蓖麻毒素降解解毒剂。通过点击化学方法将高亲和力蓖麻毒素适配体与LC3募集结构域结合，构建了一系列aptamer-ATTEC嵌合体。最优化合物DP3-D-B0在分子、细胞和动物水平上均表现出强大的抗蓖麻毒素效果。实验结果证实，DP3-D-B0能够形成一种细胞内三元复合物（LC3-ATTEC-蓖麻毒素），该复合物劫持自噬机制以实现溶酶体介导的降解。此外，当同时给药时，DP3-D-B0还能部分阻断蓖麻毒素的细胞外摄取。这项工作扩展了ATTEC技术的应用范围，并为靶向降解外源性毒素提供了新策略，从而推动了针对生物威胁剂的治疗药物研发。

引言

蓖麻毒素是一种从蓖麻籽（Ricinus communis）中提取的强效毒素（II型核糖体失活蛋白）[1]，由于其易于获取和生产，对生物安全构成严重威胁[2]、[3]。在被细胞内吞后，蓖麻毒素全毒素会逆向运输到内质网（ER）腔内，其链间二硫键被内质网中的氧化还原酶（尤其是蛋白二硫异构酶PDI）催化断裂，导致全毒素分解为RTA和RTB两个亚基[4]。分离出的RTA随后逆向转运到宿主细胞质中，在28S rRNA的sarcin–ricin环中特异性地去除腺嘌呤残基，从而不可逆地抑制蛋白质合成[5]、[6]。这一过程同时引发核糖体毒性应激，激活应激相关信号通路，并最终导致细胞凋亡[7]。

目前尚无批准的蓖麻毒素中毒治疗药物，临床管理仅限于支持性治疗，这种方法的疗效窗口狭窄且死亡率较高[8]。开发有效的对策在疗效、成本、耐受性和治疗指数方面面临诸多挑战。虽然抗体（例如Yu等人报道的基于腺相关病毒（AAV）基因转移的免疫治疗策略[9]）具有很强的中和能力，但其应用受到无法进入细胞内毒素和复杂制造过程的限制。小分子抑制剂（如PTA [10]、Retro2 [11]）在药代动力学和生产可扩展性方面具有优势，但针对蓖麻毒素活性位点的效力不足——这是一个具有大腔和高极性的难以成药的目标——并且可能存在毒性问题。疫苗（如RiVax [12]）在动物模型中显示出较高的预防效果，但仅适用于暴露前预防[13]。

与传统需要化学计量比靶点占位的抑制剂不同，靶向蛋白质降解（TPD）策略能够在催化计量比下发挥强大效果，为应对“难以成药”的目标提供了有前景的途径[14]、[15]。尽管PROTAC、HyT、AUTAC和AUTOTAC等TPD技术正在快速发展，但现有方法主要集中在内源性疾病相关蛋白上。值得注意的是，针对蓖麻毒素等外源性毒素的降解仍是TPD领域尚未探索的领域。此外，由于蓖麻毒素A链亚基仅含有两个赖氨酸残基，依赖泛素化途径的降解策略（如PROTAC）受到泛素化位点缺乏和配体可及性限制。

自噬介导的降解是一种具有广泛底物多样性的有前景的治疗策略，不仅能消除可溶性蛋白质，还能清除蛋白质聚集体和受损的细胞器[16]、[17]。由Lu团队开创的自噬体连接化合物（ATTEC）策略使用双功能小分子将目标蛋白配体与LC3结合结构域连接起来[18]。ATTEC通过LC3直接将底物锚定到自噬体膜上，触发其被自噬体吞噬、随后与溶酶体融合并降解——整个过程无需泛素化或干扰整体自噬机制[19]。与其他TPD策略相比，这种方法可能更适用于降解蓖麻毒素。

在这项研究中，我们基于aptamer-ATTEC策略提出了一种针对外源性蓖麻毒素的首创解毒剂。这种嵌合解毒剂包含一个高亲和力DNA适配体，该适配体作为目标蛋白（POI）配体，通过柔性间隔区与LC3募集结构域相连。其中和毒素的机制包括两个方面：一方面通过高亲和力结合直接抑制蓖麻毒素介导的核糖体脱嘌呤作用；另一方面同时招募蓖麻毒素和LC3，形成LC3-ATTEC-蓖麻毒素三元复合物，从而劫持自噬机制实现溶酶体介导的降解（图1）。该策略通过分子和细胞筛选、机制研究以及体外和体内疗效与安全性评估得到了严格验证。我们的工作开创了利用TPD降解外源性毒素的新方法，扩展了ATTEC技术的应用范围，并为针对生物威胁剂的对策开发提供了平台。

试剂和材料

叠氮修饰的核酸适配体（A-B0、BB0、CB0和DB0）由Tsingke Biotechnology Co., Ltd.（北京，中国）合成。化学试剂包括乙酰苯甲酸乙酯（CAS: 94–02-0）、floroglucinol二水合物（CAS: 6099-90-7）、三氟乙酸（CAS: 76–05-1）、6-碘-1-己炔（CAS: 2468-56-6）、丙炔基溴（CAS: 106–96-7）、3-(2-碘乙氧基)丙-1-炔（CAS: 164118–56-3）、3-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)丙-1-炔（CAS: 1287660–82-5）和5-(N-甲基-N-异丁基)-氨酰脲

蓖麻毒素靶向ATTEC嵌合体解毒剂的化学合成

根据方案1中详述的合成策略，我们通过定点炔基化已建立的LC3结合配体5,7-二羟基-4-苯并香豆素（DP）[20]，设计并合成了四种LC3募集头剂（DP1–DP4）。每种衍生物都具有独特的炔基结构，可作为后续连接的生物正交接头。DP及其炔基化衍生物（DP1–DP4）的化学结构通过全面的光谱表征得到了明确确认

结论

基于aptamer-ATTEC策略，我们设计并合成了一系列针对蓖麻毒素的嵌合降解剂。领先分子DP3-D-B0在保护细胞免受蓖麻毒素诱导的细胞毒性及抑制其脱嘌呤活性方面表现出显著效果，其在动物模型中的保护效果得到了进一步验证。其机制与形成细胞内三元复合物（LC3-ATTEC-蓖麻毒素）有关，该复合物劫持自噬机制实现溶酶体介导的降解

CRediT作者贡献声明

Jiawei Zhang：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，概念构思。Zhenfang Xu：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，形式分析。Shuangshuang Liu：数据管理。Xiwei Wang：概念构思。Feiyan Wang：资源提供。Yunhui Chen：方法学研究。Xueling Ma：项目管理，概念构思。Danhao Li：验证，形式分析。Aiping Zheng：监督，资金获取。Weiguo Shi：项目管理。Liang Xu：撰写 – 审稿与

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。