综述：基于纳米颗粒方法的生物分子检测方法

《ACS Omega》：Biomolecule Detection Methods Based on Nanoparticle Approaches

　　

利用免化学标记技术如表面增强拉曼光谱（SERS）、表面等离子体共振（SPR）、质谱、色谱技术、荧光方法和电化学技术进行的生物分子分析，被广泛用于检测DNA、RNA和蛋白质。纳米颗粒因其高灵敏度、特异性、快速检测能力、成本效益和高通量而被广泛应用于生物分子检测。本综述特别关注用于植物和农业应用的纳米颗粒赋能生物分子诊断。在本综述中，研究人员将总结利用纳米颗粒的DNA、RNA和蛋白质检测方法的进展。将讨论从最初仅用于大分子检测且无明确检测限的技术（如表面增强拉曼光谱和表面增强红外吸收光谱）发展到表面等离子体共振、质谱、色谱技术和荧光方法等能够实现无标记传感和实时监测生物分子相互作用且具有高灵敏度的方法的演进过程。

**1. 引言**
生物分子分析在临床诊断、食品安全分析、环境监测和药物开发等领域至关重要。DNA、RNA和蛋白质是最常追踪的生物分子，其中DNA检测是众多技术的基础。最常用的检测方法包括聚合酶链式反应（PCR）、定量PCR（qPCR）和荧光原位杂交，但这些方法依赖荧光报告分子，成本高且步骤复杂。因此，步骤少、化学品需求低的方法成为研究热点，例如表面增强拉曼光谱（SERS）、表面等离子体共振（SPR）、质谱和色谱技术。金纳米颗粒（AuNPs）因其独特的光学性质被广泛应用于DNA检测，其尺寸依赖的显色特性源于法拉第早期的胶体研究。尽管法拉第的工作与生物传感无关，但为后来基于纳米颗粒的比色核酸检测奠定了基础。纳米颗粒检测方法具有高灵敏度、特异性、快速响应、成本效益高且适合高通量分析等优势。例如，早孕试纸即采用AuNPs侧向层析技术产生可见颜色信号。然而，AuNPs在DNA检测中面临毒性、功能化不稳定以及需要复杂昂贵设备等挑战。近年来，银、铂、铜等纳米颗粒以及量子点（仍处于早期开发阶段）也被探索用于DNA检测。自1902年伍德观察到金属表面异常衍射现象以来，纳米颗粒已被用于SERS、SPR和质谱等先进方法检测DNA、RNA和蛋白质。目前，基于纳米颗粒的检测方法主要应用于人类和动物的DNA、RNA和蛋白质，而植物方面的应用报道较少，主要由于植物基因组复杂、成本高及操作难度大。本综述重点介绍基于纳米颗粒技术检测植物病原体DNA、RNA和蛋白质的实验方法，并讨论各种方法的优缺点，包括SERS、表面增强红外吸收光谱（SEIRAS）、SPR、质谱、色谱技术、荧光方法和电化学方法。同时详细描述AuNPs的优缺点，并介绍其他用于检测的纳米颗粒，最后展望未来发展方向。

**2. 表面增强拉曼光谱（SERS）**
拉曼光谱可提供丰富的分子振动信息，但灵敏度有限。SERS可将吸附在粗糙金属表面的分子信号增强6-14个数量级，提供详细结构信息或准确定量，实现单分子检测。SERS最初用于检测人类和动物来源的生物分子。2006年，Yu等人利用具有生物相容性的核壳纳米颗粒SERS探针检测HIV相关DNA序列。该方法采用功能化的Ag/SiO₂核壳纳米颗粒作为拉曼标签，同时使用氨基和捕获链功能化的二氧化硅包覆磁纳米颗粒作为固定基质和分离工具。磁分离可减少样品损失和非特异性反应，并浓集杂交产物以放大拉曼信号。对照组实验证实该方法对HIV基因具有高特异性。与动物来源生物分子检测相比，植物来源小分子（如抗氧化剂、花青素和中药成分）的SERS检测报道较少。Li等人利用银枝晶模板SERS分析菜籽油和α-生育酚等脂质，证明该方法在检测脂质氧化变化方面比传统共轭二烯吸收法更灵敏。Zaffino等人利用SERS表征花青素，揭示其在不同pH下的行为及与银纳米颗粒的相互作用，指出苷元与糖苷形式在光谱特征上的差异。SERS还被用于表征草药提取物，一项研究通过SERS监测诺米林去甲基化生成5-去甲基诺米林的过程，并与高效液相色谱（HPLC）比较。结果表明，SERS方法（尤其是溶液法）在定量5-去甲基诺米林时具有更低的校准误差和更高的相关系数，且分析更快、更方便。

**2.1. 表面增强红外吸收光谱（SEIRAS）**
SEIRAS是传统红外光谱的先进变体，通过纳米结构金属薄膜的等离子体共振实现信号增强，增强效应在表面约10nm范围内衰减，适合选择性探测生物膜单层。其基本原理涉及局域电磁场强度、金属/吸附层对吸收的调制以及金属膜的介电性质。Yilmaz等人引入金纳米棒阵列作为SEIRAS平台用于细菌检测。他们利用支持向量机模型分析3100-400和3100-2735 cm^-1光谱区域的训练数据集，实现了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的100%准确率、灵敏度和特异性。主成分分析清晰地将不同细菌种类分开。金纳米棒阵列在玻璃片上垂直排列，提供了稳健的SEIRA平台，优于铝箔和光滑金表面等传统基底，具有更好的重现性和信噪比。

**3. 表面等离子体共振（SPR）**
SPR在无标记传感和实时监测生物分子相互作用方面表现出高灵敏度。Nikkhah等人利用AuNPs的局域表面等离子体共振（LSPR）技术开发了检测番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）的简单、快速、低成本方法。该方法基于核酸适配体诱导的AuNPs颜色变化和LSPR峰强度变化进行比色检测。尽管PCR的检测限（1.5 ng/μL）低于比色法（5 ng/μL），但后者操作简便，无需大型设备，并能区分双生病毒科病毒。Kundu等人报道了基于衰减全反射介导LSPR（ATR-LSPR）的辣椒曲叶病毒检测方法，检测限低至1 μg/mL（1 μg/mL = 1 ng/μL? 原文为1 μg/mL，但前面PCR为1.5 ng/μL，注意单位换算，此处按原文）。该方法利用AuNPs和互补寡核苷酸固定探针检测菜豆金色花叶病毒属DNA，通过倏逝波吸收法实现实时观察。Jeon等人引入AuNPs包被的传感器芯片，利用LSPR检测抗草甘膦转基因大豆中的cp4 epsps基因，检测范围为1-100 nM，适合田间检测。

**4. 质谱（MS）**
质谱技术自20世纪90年代初商业化以来，已广泛用于临床病原体、非发酵菌、真菌等快速鉴定。纳米颗粒（如金、TiO₂、硒、Fe₃O₄和铂）被选作小分子分析物、肽和蛋白质分析的基质。其中铂纳米颗粒对蛋白质分析效率最高，可检测上限达25 kDa。Wu等人利用免疫球蛋白G（IgG）功能化的铂纳米颗粒结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS），直接从土壤和根部检测植物相关细菌，成功鉴定了胡萝卜植物中的苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。量子点（QDs）作为功能更先进的纳米材料，可提高MS灵敏度。Wu等人报道利用CdS量子点降解大肠杆菌细胞外多糖，质谱结果显示在300 μL/L浓度下多糖含量从147 mg降至8 mg，表明CdS量子点可用于灭活致病性大肠杆菌和抑制生物膜生长。

**5. 色谱方法**
色谱方法结合AuNPs可实现免扩增、灵敏且可用肉眼观察的DNA检测。Pompa等人利用AuNPs开发了检测Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）基因点突变的方法，检测限低至32 fmol，远优于此前色谱方法的25 pmol。该方法利用短寡核苷酸探针的协同杂交增强稳定性和结合亲和力。该方法进一步被用于植物DNA检测，如黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）的比色检测。Liu等人利用未修饰的AuNPs，基于NaCl诱导的AuNPs颜色变化（红变蓝）实现可视化检测，检测限低至30 pg/L（病毒RNA），甚至通过电泳可达到7.5 pg/L。Sadeghizadeh等人利用DNA-AuNPs探针比色检测不同假单胞菌致病变种，特异性达92%，灵敏度为15 ng/L。Nikkhah等人开发了基于AuNPs的生物传感器检测青枯雷尔氏菌，通过LSPR峰变化或颜色变化（红变紫）实现肉眼观察，可检测0.5 g土壤中15 ng的基因组DNA，且不受土壤中PCR抑制物的影响。

**6. 荧光方法**
荧光方法因其高灵敏度和多功能性被广泛应用于DNA和RNA检测。Yaghmaei等人利用AuNPs和磁纳米颗粒开发了检测铜绿假单胞菌外毒素A基因序列的荧光生物条形码DNA检测方法。该方法将目标特异性DNA探针和短ssDNA生物条形码包被在AuNPs上，磁纳米颗粒包被另一特异性探针，杂交后通过磁场分离，释放条形码DNA并用荧光分光光度法检测，检测限为1.2 ng/mL，回收率98.3%-102%。Kim等人利用反相微乳液法合成Co–B/SiO₂/染料纳米颗粒，基于竞争抑制免疫分析检测草甘膦，检测限低至0.27 nM。Zeng等人开发了用于植物miRNA（miR156）原位检测的荧光纳米传感器，将分子信标负载于15 nm AuNPs上，保护其免受DNase I降解，检测限为1 nM，在拟南芥根中实现了实时荧光成像。Abdullah等人利用抗黄单胞菌抗体与石墨烯量子点及AuNPs的偶联物，基于荧光猝灭原理检测水稻白叶枯病菌，检测限达22 CFU/mL，优于传统培养法、酶联免疫吸附测定（ELISA）和PCR。

**7. 电化学方法**
电化学方法具有高灵敏度、低成本、快速和可微型化等优势。常用检测技术包括电化学发光（ECL）、电化学阻抗谱（EIS）、差分脉冲伏安法（DPV）、循环伏安法（CV）、方波伏安法（SWV）和阳极溶出伏安法（ASV）。纳米颗粒因其大比表面积、易修饰和信号放大能力被广泛用于电化学传感器。Merko?i等人开发了基于AuNPs增强的柑橘衰退病毒电化学生物传感器，通过电沉积AuNPs到丝网印刷碳电极上提高电子传递效率和表面积，利用EIS监测DNA杂交引起的电荷转移电阻（R_ct）变化，检测限为100 nM，实际植物样品回收率90-97%。Lau等人利用胶体AuNPs作为探针检测丁香假单胞菌，结合重组酶聚合酶扩增和生物素标记引物，通过DPV测量AuNPs的电化学还原信号，灵敏度比传统PCR高10000倍。Ghasemi-Varnamkhasti等人开发了还原氧化石墨烯-金纳米颗粒（rGO–AuNP）纳米复合物修饰的石墨电极检测根癌农杆菌，线性范围1.0×10^-4至1.0 nM，检测限0.87×10^-4 nM，可重复使用4次，4℃下稳定30天。Ai等人利用去铁铁蛋白包封的铜纳米颗粒构建无标记电化学生物传感器检测miRNA，通过EIS测量电子转移电阻变化，检测限低至3.5 fM，并成功应用于拟南芥种子中脱落酸对miRNA-159a表达的影响研究。

**8. 展望**
未来基于纳米颗粒的生物分子检测方法应聚焦于提高灵敏度、降低成本、加快速度、增强便携性和环境友好性。电化学方法完美满足这些要求，成为高关注领域。电化学传感器可微型化、仪器简单、读数快速。AuNPs因与含硫醇生物分子强特异性相互作用而被广泛使用。例如，SARS-CoV-2刺突蛋白可与金和硅电极形成共价键但界面行为不同。新型电极设计如金包被磁纳米颗粒作为分散电极，可直接检测全血中的microRNA生物标志物，检测限低至10 aM，比现有技术灵敏1000万倍。未来还应探索更多纳米颗粒传感策略以应对植物系统的复杂性。纳米颗粒可作为信号放大器、固定支架、催化增强剂或电子传递介质，材料选择应基于检测策略和应用场景。光学方法（SERS、SPR）提供超高灵敏度和无标记检测，但需复杂仪器；荧光方法可实现高灵敏度和多路复用，但受光漂白和背景干扰影响；色谱方法操作简单成本低，但定量精度有限；质谱方法特异性强但设备昂贵；电化学传感器则因低成本、快速响应、易微型化和便携性而特别适合农业诊断。未来研究需解决测定重现性、长期稳定性、表面功能化稳健性以及在复杂农业样品中的验证等问题。表面增强拉曼光谱和表面增强红外吸收光谱目前仅适用于大分子检测且未显示检测限，而SPR、质谱、色谱和荧光方法在无标记传感和实时监测方面表现出色。电化学方法有望推动现场检测设备的发展，为农民或农业专家提供快速检测和治疗作物病害的工具，从而提高作物产量。