综述：超越序列：mRNA治疗中的化学与拓扑设计及创新

《Chemical Reviews》：Beyond the Sequence: Chemical and Topological Design and Innovations in mRNA Therapeutics

　　

信使RNA（mRNA）已迅速崛起为一种变革性治疗模式，其在传染病、肿瘤学和遗传性疾病中的广泛应用即为明证。mRNA的化学可编程性使得研究人员能够通过引入跨分子的合成修饰——从帽结构、非翻译区（UTRs）、编码序列（CDS）到多聚腺苷酸（poly(A)）尾，以及从碱基、骨架到核糖糖基——来调节其功能。超越序列层面的设计，最新进展引入了新的控制维度：拓扑工程。环状RNA、分支结构和合成套索结构正在重塑研究人员对RNA稳定性、免疫原性和翻译的理解。本综述调查了mRNA化学与拓扑工程的最新进展，重点强调四个关键领域：（1）扩展可获取mRNA修饰谱系的酶促、化学和杂合方法；（2）线性、环状和分支mRNA拓扑结构的合成策略；（3）控制翻译效率、衰变和免疫激活的结构-活性关系；以及（4）对下一代基于mRNA的治疗的意义。通过整合化学合成、合成生物学和RNA结构设计，研究人员正开始解锁工程化mRNA分子的全部治疗潜力。

论文主体内容总结如下：

1. 引言
mRNA技术已引发生物医学研究的范式转变，其内在可编程性、简化制造和良好安全性（尤其避免基因组整合）突显其在预防性疫苗、基因编辑、癌症免疫治疗和蛋白质替代疗法中的临床潜力。2005年引入合成核苷修饰（如m⁵C、Ψ、m⁶A、s²U）通过体外转录（IVT）显著降低非修饰RNA诱导的先天免疫应答并大幅增强蛋白质产量，开启了mRNA治疗新时代。

1.1 天然mRNA的结构与功能元件
天然mRNA包含五个主要元件：5′帽结构、5′非翻译区（5′ UTR）、编码序列（CDS）、3′非翻译区（3′ UTR）和多聚腺苷酸（poly(A)）尾。帽结构（如Cap0、Cap1、Cap2）通过结合帽结合蛋白调节mRNA稳定性、核输出和翻译，且2′-O-甲基化参与区分自身与非自身mRNA的免疫感应。5′ UTR通过序列上下文、二级结构和化学修饰调控翻译起始；其优化通过合成生物学、大规模平行筛选和机器学习实现。CDS通过密码子最优性影响翻译效率和mRNA稳定性，密码子优化可最大化蛋白质产量。3′ UTR含有富含AU元件（AREs）和microRNA结合位点等顺式调控元件，影响RNA定位、翻译效率和衰变；高内涵筛选用于优化3′ UTR。poly(A)尾（通常50-200 nt）与poly(A)结合蛋白（PABP）或去腺苷化复合物相互作用，保护mRNA免受酶解或触发衰变，并通过与帽-eIF4E复合物形成“伪环”结构增强翻译起始。内部化学修饰（如m⁶A、Ψ、m⁵C）调控RNA加工、翻译、衰变和免疫识别，为工程化合成mRNA提供资源。

1.2 合成mRNA的生命周期及其与内源翻译机器的相互作用
合成mRNA首先通过递送载体（如脂质纳米颗粒LNP）进入细胞，经内吞和内体逃逸释放至胞质。内体逃逸是LNP介导治疗的主要瓶颈，<5%的转染RNA进入胞质。释放后，mRNA通过帽依赖性翻译起始途径：帽结合蛋白eIF4E识别m⁷G帽，形成eIF4F复合物，招募43S预起始复合物（PIC）扫描AUG起始密码子，组装80S核糖体进行蛋白质合成。翻译效率（TE）定义为每mRNA分子单位时间产生的蛋白量。mRNA在胞质中遭受外切酶和内切酶介导的衰变途径，包括3′→5′衰变（去腺苷化后经外切酶降解）、5′→3′衰变（脱帽后经XRN1降解）和内切核酸酶切割。理解这些机制有助于合理设计抵抗降解的化学修饰。

2. mRNA修饰的合成方法学
合成方法包括：共转录掺入（通过IVT）、转录后化学/化学酶促修饰、全化学合成和化学酶促合成（杂合合成）。IVT使用T7 RNA聚合酶从DNA模板合成RNA，可进行共转录加帽（二核苷酸帽类似物、三核苷酸帽类似物如CleanCap^?）和NTP替代（如Ψ、m¹Ψ、m⁵C）进行内部序列修饰。工程化DNA聚合酶（如Tgo TGK突变体）扩展了修饰核苷酸底物范围，实现区域特异性修饰。转录后修饰包括：使用病毒加帽酶（VCE）进行mRNA加帽，2′-OH酰化反应（可逆封闭增强稳定性），3′端化学和酶促修饰（如NaIO₄氧化-还原胺化、poly(A)聚合酶引入修饰、T4 RNA连接酶通过pCp试剂标记），tRNA修饰酶（如Tias、TGT）介导的位点特异性修饰，以及遗传密码扩展技术利用非天然碱基对（UBPs）实现位点特异性标记。全化学合成通过固相亚磷酰胺化学制备寡核苷酸（≤100 nt）并结合化学加帽，已实现107 nt可翻译mRNA的合成。化学酶促合成（杂合合成）结合酶促转录的可扩展性和化学合成的结构多样性，如信使-寡核苷酸缀合RNA（mocRNAs）和连接使能的mRNA-寡核苷酸组装（LEGO）技术，实现模块化、位点特异性修饰，并支持拓扑工程。

3. RNA拓扑结构的合成方法学
环状RNA（circRNA）合成方法包括：化学环化（使用BrCN或EDC等缩合剂，适合短RNA）、反向剪接（利用Group I内含子PIE策略，可达5 kb）、自催化核酶（Tornado系统用于细胞内核酶辅助环化）、酶促连接（T4 RNA连接酶或DNA连接酶利用同源臂或splint DNA）、化学酶促环化（LEGO技术结合T4 RNA连接酶I和RtcB连接酶，兼容修饰核苷酸）。分支RNA合成方法包括：通过主链分支（脱氧核酶催化2′,5′-磷酸二酯键形成，或固相合成使用正交保护基）、通过碱基修饰分支（点击化学如CuAAC组装，产生抗脱支酶的分支结构）、通过非共价杂交分支（碱基配对引入功能性分支）。

4. 合成mRNA的纯化方法
纯化至关重要。沉淀法去除大部分底物但无效去除RNA副产物。色谱法：反相高效液相色谱（RP-HPLC）是金标准，可有效去除截短产物和双链RNA（dsRNA），使翻译水平提升10-1000倍。其他包括尺寸排阻、离子交换、寡聚(dT)亲和色谱和纤维素色谱。RNA编码纯化手柄：利用疏水性标签（如N⁶-苄基腺苷、光笼疏水标签）通过RP-HPLC分离加帽mRNA，之后通过UV处理恢复天然帽结构。酶促纯化：RNase III去除dsRNA，RNase R降解线性RNA富集circRNA，poly(A)聚合酶（PAP）对线性杂质加尾后通过寡聚(dT)捕获。

5. 化学修饰的结构-活性关系（SAR）
帽修饰：使用二核苷酸、三核苷酸或四核苷酸帽类似物，以及病毒加帽酶或化学酶促合成，系统研究m⁷G修饰（如LNA、苄基）、三磷酸修饰（如BH₃、S取代）和第一个核苷酸修饰（如2′-OMe、LNA）对eIF4E结合、脱帽抗性和翻译效率的影响。LEGO技术实现了前六个核苷酸位点特异性修饰，发现LNAm⁷G和LNA修饰增强翻译效率达10倍。CDS修饰：Ψ和m¹Ψ全替代显著降低免疫原性、增强翻译，机制涉及调控先天免疫感应和翻译解码动力学。但m¹Ψ可能引起+1核糖体移码。其他修饰如5moU、m⁵C增强蛋白生产，而m⁶A、s²U降低翻译。位点特异性修饰（如m⁵C、2′-OMe）显示位置依赖性效果。磷酸骨架硫代磷酸酯修饰适度增加翻译。UTR修饰：5′ UTR内m⁶A实现帽非依赖性翻译，区域特异性硫代磷酸酯修饰增强起始速率。LEGO揭示5′ UTR前六个核苷酸的修饰（如2′OMe×6、LNA×6）增强稳定性和翻译。poly(A)尾修饰：3′端化学衍生化、酶促引入修饰核苷酸（如ATPαS、ATPαBH₃）和化学酶促合成（如末端硫代磷酸酯、2′MOE）增强稳定性，总蛋白产量提升3-6倍。

6. RNA拓扑结构-活性关系
分支mRNA：多尾mRNA通过化学酶促组装多个poly(A)尾（点击化学），结合化学修饰（2′MOE、PS），延长表达持续时间，在体内实现多重基因编辑效率提升。多帽mRNA在5′端引入双帽结构，通过增强与eIF4E相互作用提升翻译效率2倍，并联合化学修饰实现15倍蛋白产量提升。环状RNA（circRNA）因无末端避免外切酶降解，稳定性增强，通过IRES或m⁶A驱动翻译。优化序列和纯化后蛋白表达优于线性mRNA，但翻译效率仍低于帽依赖性线性mRNA。有帽环状RNA（QRNA）：通过将分支帽结构引入circRNA，同时实现高稳定性和帽依赖性翻译，翻译效率较未修饰circRNA提升27-144倍。反式作用元件：通过杂交将帽或poly(A)模拟物顺式或反式连接至mRNA，可驱动或增强翻译，揭示“帽邻近”机制。

7. 治疗与科学应用
化学修饰和拓扑工程mRNA已应用于细胞重编程与干细胞工程（高效诱导iPSC，效率达90%）、传染病疫苗（SARS-CoV-2 mRNA疫苗使用Cap1和m¹Ψ，引发强抗体和Th1免疫；多价流感疫苗）、癌症免疫治疗（mRNA癌症疫苗如树突状细胞疫苗和脂质体RNA疫苗；个性化新抗原疫苗；mRNA编码治疗蛋白如CAR-T、双特异性抗体、细胞因子）、基因编辑（CRISPR-Cas9 mRNA/m¹Ψ LNP实现高效肝基因编辑；碱基编辑器mRNA/5moU纠正点突变；分支poly(A)尾优化Cas9 mRNA实现低剂量多重编辑）、酶/蛋白质替代疗法（促红细胞生成素EPO、甲基丙二酰辅酶A变位酶MUT、丙酰辅酶A羧化酶PCC的mRNA治疗，其中PCC mRNA已进入临床试验）。

8. 挑战与展望
关键挑战包括：最大化mRNA药代动力学窗口（需更长效表达）、通过扩展化学空间增强翻译效率（需更先进的合成方法实现位点特异性修饰）、细胞类型特异性和靶向递送（如miRNA响应元件、RNA编辑开关）、改善内体逃逸（机制不明）、多重mRNA治疗（多基因靶向）、可扩展制造与分布（需简化修改流程和改善冷链稳定性）。未来mRNA将如小分子药物一样被精密化学设计，成为可编程、模块化、多功能的平台。