《Frontiers in Oncology》：Generation of NBS1 knockout in Chinese hamster cells revealed ATR role for radiation and etoposide induced DNA damage in absence of NBS1 proteins
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Nijmegen 断裂综合征 (NBS) 是一种因 NBN 基因突变导致的罕见染色体不稳定疾病，与癌症易感性相关，但其在特定细胞模型（如中国仓鼠细胞）中的功能研究存在空白。本研究利用 CRISPR/Cas9 技术成功构建了 NBS1 缺陷的中国仓鼠细胞模型，并系统评估了其对 DNA 损伤剂的敏感性。研究发现，NBS1 缺陷细胞对电离辐射、拓扑异构酶抑制剂等敏感，并且特别依赖 ATR 信号通路来应对特定类型的 DNA 损伤。该模型为深入研究 NBS1 功能、DNA 损伤应答机制，以及开发针对 NBS1 缺陷相关疾病（如癌症）的靶向治疗策略提供了新的有力工具。
在生命维持与繁衍的精密蓝图中，DNA 的稳定性是基石。然而，内源或外源的损伤（如电离辐射、化学药物）会不断挑战这一稳定性，导致 DNA 双链断裂 (DSB) 等严重损伤。细胞演化出了一套复杂的 DNA 损伤应答 (DDR) 系统来感知、传递信号并修复这些损伤，其中 MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) 复合物是关键的感受器。NBS1 蛋白（由 NBN 基因编码）是 MRN 复合物的核心组分，对于激活 ATM 激酶、协调同源重组 (HR) 和非同源末端连接 (NHEJ) 修复途径至关重要。NBN 基因的突变会导致一种罕见的常染色体隐性遗传病——Nijmegen 断裂综合征 (NBS)。NBS 患者表现出包括小头畸形、生长迟缓、免疫缺陷、放射敏感性以及对淋巴恶性肿瘤的强烈易感性在内的多种症状。这凸显了 NBS1 在维持基因组稳定性和预防癌症中的核心作用。
尽管在人类患者细胞系以及小鼠、鸡 DT40 等模式生物中已有 NBS1 缺陷模型，但这些模型各有局限。例如，患者来源的细胞增殖能力有限，遗传背景异质；而中国仓鼠细胞系在辐射生物学和毒理学研究中具有生长迅速、克隆效率高、核型稳定等显著优势，非常适合进行细胞遗传学分析。然而，在优势明显的中国仓鼠系统中，却一直缺乏 NBS1 基因缺陷的突变细胞系。这个空白限制了我们利用该理想模型深入探究 NBS1 在特定遗传背景下的精确功能，以及发掘潜在治疗靶点的能力。为了填补这一空白，并更深入地理解在缺乏功能性 NBS1 时细胞如何应对 DNA 损伤，一项研究在《Frontiers in Oncology》上发表，报道了研究人员利用前沿的基因编辑技术，成功构建了 NBS1 缺陷的中国仓鼠细胞模型，并有了令人瞩目的新发现。
本研究主要采用了以下几项关键技术方法：首先，研究人员利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，针对中国仓鼠 NBS1 基因的外显子6设计向导 RNA (sgRNA)，对中国仓鼠肺来源的 V79 细胞进行编辑，并通过单克隆筛选和测序验证，成功获得了两种不同类型的 NBS1 突变细胞系（NBS1-6 和 NBS1-24）。其次，通过细胞活力测定（集落形成实验）系统评估了突变细胞对多种 DNA 损伤剂（如电离辐射、拓扑异构酶抑制剂等）和 DDR 激酶抑制剂（ATM、ATR、DNA-PK、PARP 抑制剂）的敏感性。最后，综合运用了细胞遗传学分析（如 G2期染色体提前凝集试验、姐妹染色单体交换分析、染色体畸变分析）、免疫荧光（检测 γH2AX 和 Rad51 焦点形成）以及流式细胞术（分析细胞周期分布）等多种技术，从表型、染色体和分子水平全面表征了 NBS1 缺陷细胞的 DNA 损伤应答特征。
3.1 分离克隆的特征
研究人员成功获得了两个 NBS1 突变克隆。NBS1-6 携带一个单碱基（腺嘌呤）插入，导致移码突变并产生提前终止密码子，被归类为无效突变。NBS1-24 则存在一个跨越内含子5和外显子6的 80 bp 缺失，导致异常剪接，但仍可检测到分子量更大的异常 NBS1 蛋白表达，因此被归类为亚效等位基因突变。这两个突变细胞系均表现出生长和增殖迟缓，集落形成效率显著降低，并且姐妹染色单体交换 (SCE) 频率显著增加，重现了 NBS 的关键细胞表型。
3.2 对多种DNA损伤剂的细胞毒性
通过集落形成实验评估细胞存活率，发现 NBS1 突变细胞对除博来霉素和羟基脲外的所有测试 DNA 损伤剂均表现出超敏反应，特别是对拓扑异构酶 I 抑制剂喜树碱和拓扑异构酶 II 抑制剂依托泊苷极为敏感，其半数抑制浓度 (IC50) 值降低超过三倍。突变细胞对电离辐射也表现出预期的敏感性，D10（使细胞存活率降至10%的剂量）值显著低于野生型细胞。
3.3 对DNA损伤应答抑制剂的细胞毒性
研究进一步评估了 NBS1 突变细胞对靶向不同 DDR 激酶抑制剂的敏感性。与野生型细胞相比，两种 NBS1 突变细胞对所有测试的抑制剂（ATM 抑制剂 KU55933、DNA-PK 抑制剂 NU7441、PARP 抑制剂奥拉帕尼和 ATR 抑制剂 VE-821）均表现出超敏反应。其中，对奥拉帕尼和 VE-821 的敏感性增强尤为显著，IC50值降低超过两倍，提示在 NBS1 功能缺失的情况下，细胞对这些通路的活性更为依赖。
3.4 NBS1突变细胞中辐射诱导的DNA损伤应答
通过 G2期染色体提前凝集 (PCC) 实验分析染色质断裂修复，发现照射后2小时，野生型 V79 和 NBS1-24 细胞的 G2期 PCC 断裂数显著减少，而 NBS1 无效突变的 NBS1-6 细胞则没有显著减少，表明其 DSB 修复能力受损。G2实验分析显示，NBS1-6 细胞在照射后未能有效激活 G2/M 期检查点阻滞，而 NBS1-24 细胞则表现出与野生型类似的阻滞。然而，两种 NBS1 突变细胞在照射后产生的染色体畸变（染色单体断裂）均远多于野生型细胞，凸显了其基因组不稳定性。
3.5 DDR抑制剂与电离辐射、喜树碱和依托泊苷的联合应用
为评估 NBS1 与 DDR 激酶之间的功能冗余性，研究人员将 DDR 激酶抑制剂与 DNA 损伤剂联合使用。结果显示，在测试浓度下，野生型 V79 细胞对任何 DDR 抑制剂均未表现出明显的放射增敏作用，而 NBS1 缺陷细胞在 ATR 抑制剂存在下，对电离辐射表现出显著且大幅度的增敏。在喜树碱处理下，野生型和 NBS1 缺陷细胞均因 ATR 抑制而增敏，这与 ATR 在 S 期应对复制压力的核心作用一致。然而，在依托泊苷处理下，DNA-PK 抑制增强了所有细胞系的细胞毒性，而 ATR 抑制则选择性地使 NBS1 缺陷细胞增敏。这表明，ATR 在缺乏功能性 NBS1 的情况下，对 G2期发生的特定类型 DNA 损伤（如依托泊苷诱导的 DSB）的修复起到了关键的代偿作用。
3.6 NBS1突变细胞中共处理喜树碱或依托泊苷与ATR抑制剂时的DNA损伤应答
为验证上述细胞毒性结果，研究人员分析了染色体畸变、DNA 损伤标志物 γH2AX 和同源重组修复蛋白 Rad51 的焦点形成以及细胞周期分布。结果显示，ATR 抑制剂单独处理可适度增加 NBS1 突变细胞中的染色单体断裂，而与喜树碱或依托泊苷联用则导致突变细胞中的染色体损伤显著增加。免疫荧光分析发现，在 ATR 抑制剂存在下，NBS1 突变细胞中依托泊苷诱导的 Rad51 焦点形成被强烈抑制，而 γH2AX 焦点形成未受选择性影响。这表明，在 NBS1 缺陷的背景下，ATR 对于支持 G2期 DSB 的同源重组修复至关重要。3 foci per cell), Representative images of reduced rad51 foci in NBS1–6 cells treated with VE821 and etoposide, (C) Flow cytometry analysis after overnight drug treatment. Error bars indicate the standard error of the mean from three independent experiments. *indicates statistical significance (p<0.05, ANOVA).">
结论与讨论
本研究首次成功在优势明显的中国仓鼠细胞系统中，利用 CRISPR/Cas9 技术构建了 NBS1 缺陷的细胞模型（包括无效突变和亚效等位基因突变），并对其进行了系统的表征。这些模型重现了 NBS 的关键表型，如生长缺陷、对多种 DNA 损伤剂（尤其是电离辐射、喜树碱、依托泊苷）的超敏反应以及染色体不稳定性。研究最重要的发现是揭示了 ATR 在 NBS1 缺陷背景下的特异性代偿作用。虽然 ATR 广泛参与 DDR，但 NBS1 缺陷细胞特别依赖 ATR 来修复发生在 G2期的 DSB（如依托泊苷诱导的损伤），而对于 S 期损伤（喜树碱诱导），ATR 的作用则不完全依赖于 NBS1 状态。这种选择性依赖通过 ATR 抑制剂能选择性地增敏 NBS1 缺陷细胞对电离辐射和依托泊苷的毒性，并且抑制了依托泊苷诱导的 Rad51 焦点形成得到证实。
该研究的结论具有多重重要意义。首先，所建立的 NBS1 缺陷中国仓鼠细胞系为辐射生物学、毒理学以及 NBS1 功能机制研究提供了宝贵的、易于进行细胞遗传学分析的新模型。其次，研究揭示了在 MRN 复合物功能受损时，ATR 信号通路可以作为关键的备份修复途径，这加深了我们对 DDR 网络冗余性和可塑性的理解。最后，也是最具转化医学潜力的启示在于，ATR 与 NBS1 之间存在的“合成致死”相互作用。这意味着，在携带 NBS1 突变或功能缺失的肿瘤细胞中，使用 ATR 抑制剂可能成为一种有效的靶向治疗策略。这项研究不仅拓展了对 NBS1 功能和 NBS 疾病机制的认识，也为开发针对染色体不稳定疾病和 NBN 缺陷相关恶性肿瘤的新型疗法指明了潜在方向。
