通过熔化温度的内在荧光测量方法评估乳铁蛋白的热稳定性和铁饱和度水平

《Journal of Dairy Science》：Assessment of the thermal stability and iron saturation level of lactoferrin via intrinsic fluorescence measurements of melting temperature

　　孙娜娜|徐秦峰|霍振全|谢建宏|魏玉杰|方阳|程建波
陕西科技大学食品科学与工程学院，国家山羊乳制品加工技术研发中心，中国陕西省西安市710021

**摘要**
乳铁蛋白（LF）是一种重要的生物活性铁结合糖蛋白，常被用作乳制品中的营养强化剂。其热稳定性和铁饱和度是评估其生物活性变化及设计提取和干燥工艺的关键参数。传统的差示扫描量热法（DSC）和圆二色性（CD）等技术虽然能提供准确的数据，但耗时且通量较低。基于染料的差示扫描荧光法（外在DSF）虽然通量较高，但通常需要大量优化，且染料的非特异性结合可能影响LF及其配体的结合能力。本文提出了一种无标记的内在DSF方法，该方法利用LF在温度梯度下的内在荧光变化来测定其熔点（Tm）。该方法能够快速（<3分钟）评估不同蛋白质浓度范围（0.1–100 mg/mL）内LF的热稳定性，并建立了变性峰面积比S2/(S1+S2)与铁饱和度之间的强线性相关性（R2 > 0.9），其中350 nm处的荧光强度被确定为最佳参数。此外，该方法还成功应用于评估LF与多种阴离子聚合物（如阴离子多糖和DNA）的结合能力，通过监测配体结合引起的Tm变化来筛选亲和配体。该方法消除了外部染料和有机溶剂对LF结构和稳定性的干扰，具有高通量、良好的重复性和广泛的适用性。总之，这种内在DSF方法为LF的特性分析和配体相互作用筛选提供了一种快速、可靠且替代性的手段，对乳制品的质量控制和LF纯化技术具有重要意义。

**解读摘要**
乳铁蛋白（LF）作为营养强化剂被添加到牛奶和乳制品中。LF的热稳定性和铁饱和度是评估其生物活性变化及设计提取和干燥工艺的关键参数。我们开发了一种无荧光染料的内在差示扫描荧光法（内在DSF），该方法能够准确评估LF的热稳定性和铁饱和度，具有数据质量高、速度快（<3分钟）和检测范围广的优点。该方法还可以评估LF与DNA的结合能力，并可用于筛选提取LF的DNA亲和配体。

**引言**
乳铁蛋白（LF）是一种具有多种生物活性的铁结合糖蛋白，每个LF分子可高亲和力结合2个三价铁离子（Fe3+）（解离常数约为10?20 M）（Bokkhim等人，2014年）。LF存在三种形式：无铁LF（apo-LF）、铁饱和LF（holo-LF）和部分铁饱和LF（天然LF，含15–20%铁）（Voswinkel等人，2016年）。LF具有多种健康促进作用，包括抗氧化、抗癌、抗菌和免疫调节作用。因此，LF被添加到婴儿配方奶粉、饮料和酸奶中（Sui等人，2010年；Dyrda-Terniuk和Pomastowski，2023年）。LF的热稳定性与其在加工条件下的结构完整性和生物活性密切相关（Wang等人，2019年），这些加工条件包括喷雾干燥和高温灭菌。此外，温度、pH值和离子强度等因素也会影响LF的热稳定性（Sreedhara等人，2010a年；Xia等人，2023年）、抗蛋白水解能力（Bokkhim等人，2013年）、提取效率（Brisson等人，2007a年；Voswinkel等人，2016年）以及生物活性（Feng等人，1995年；Brisson等人，2007b年；Coccolini等人，2023年；Dyrda-Terniuk和Pomastowski，2023年）。holo-LF的结构比apo-LF更紧凑，铁饱和度会提高其热稳定性（Brisson等人，2007b年）。因此，评估LF的热稳定性和铁饱和度对于评估其生物活性和优化加工参数至关重要（Brisson等人，2007a年；Voswinkel等人，2016年；Wang等人，2017年；Zhang等人，2021年；Morel等人，2022年）。

基于LF熔点（Tm）检测其表观热稳定性在简单性和普适性方面表现出色。根据荧光检测的需求，该方法可分为非发光型和发光型。非发光型方法包括差示扫描量热法（DSC）和圆二色性（CD），这些方法是确定蛋白质Tm值和构象变化的经典技术（Kopra等人，2022年；Ferreira等人，2018年；Zhang等人，2025年），也可用于分析LF的铁饱和度（Bokkhim等人，2014年）。然而，DSC和CD通常耗时较长，通量较低，且需要专用设备（Gooran和Kopra，2024年）。

由于发光型方法的简单性和成本效益，它使得蛋白质热稳定性的检测成为可能，引起了广泛关注（Gooran和Kopra，2024年）。基于外部染料的差示扫描荧光法（外在DSF）已被开发并应用于蛋白质稳定性的高通量评估（McClure等人，2018年；Kirley和Norman，2022年）以及蛋白质-配体相互作用的研究（Frank等人，2007年；Kirley等人，2020年；Kirley和Norman，2022年）。外在DSF通过测量对外部荧光染料的荧光来检测蛋白质的展开。在之前的研究中，我们使用SYPRO Orange或Glomelt作为外部染料来评估LF的热稳定性和铁饱和度（表1）。尽管外在DSF在速度和通量方面具有优势，但其固有的局限性不可忽视，因为外部染料可能影响LF的热稳定性和配体结合（Feoli等人，2024年；Gooran和Kopra，2024年），并且需要较复杂的优化（例如染料浓度），这限制了其广泛应用（Wu等人，2024年）。此外，获得可靠的高质量数据仍然是一个挑战（Llowarch等人，2023年；Wu等人，2023年；Wu等人，2024年），这也是外在DSF分析中的一个常见瓶颈（Wu等人，2020年）。

**表1. 外在DSF、传统比色皿内在荧光法和内在DSF技术在评估LF热稳定性和铁饱和度方面的比较**
| 方法 | 特点 | 优点 | 缺点 | 通量 | 时间/分钟 | 稳定性影响 | 蛋白质浓度 | Tm值 | 蛋白质体积 | 参考文献 |
|------------|-----------------------------------------|-----------------------------------------|----------------------------------|-------------|------------|-----------|-----------|-----------|------------|-------------|
| 外在DSF | 基于外部荧光染料 | 数据质量高；速度快 | 需要大量优化 | 高 | <15 | 可能有影响 | 是 | ~10 μL | Sun等人，2024年 |
| 传统比色皿内在荧光 | 基于比色皿 | 简单；速度快 | 需要专门设备 | 低 | ~60 | 有可能有影响 | 是 | >200 μL | 本研究 |
| 毛细管/平板内在荧光 | 基于毛细管/平板 | 无需外部染料 | 无需优化 | 高 | <3 | 无 | 是 | ~10 μL | 本研究 |

**为了避免染料与蛋白质之间的结合对LF热稳定性的影响，我们提出了一种基于蛋白质内在荧光（主要来自色氨酸残基）的无标记方法。蛋白质在约280 nm激发下在约350 nm处发出的内在荧光对局部环境的极性非常敏感，可用于监测蛋白质变性过程中的构象变化（Gooran和Kopra，2024年）。传统的比色皿内在荧光方法使用荧光分光光度计进行测量，已用于在不同温度和不同铁饱和度下表征LF的构象变化（Sreedhara等人，2010b年；Stanciuc等人，2013年；Baer等人，1979年；Wang等人，2013年）。然而，这种传统方法通量较低，需要较大样本量，加热不连续，耗时较长，限制了其在需要快速筛选和高通量分析中的应用。**

近年来，结合内在荧光检测和高通量自动化平台的技术得到了发展，例如基于毛细管或平板的DSF（内在DSF）（Gooran和Kopra，2024年）。内在DSF仪器（如Prometheus NT.6、Uncle和SUPR-DSF-Protein Stable）可以在2个波长（330 nm和350 nm）下实时监测蛋白质中Trp和Tyr残基的内在荧光变化（Muca等人，2017年）。这种方法无需外部染料即可准确测定Tm值。内在DSF已应用于评估牛奶蛋白的稳定性（Muca等人，2017年）和蛋白质-配体相互作用（Loch等人，2018年；Romano等人，2021年；Alesio和Bothun，2024年），为克服外在DSF相关的外部染料干扰问题提供了理想的技术平台。**

**本研究旨在开发一种高通量、快速、准确且无标记的内在DSF方法，用于评估LF的热稳定性和铁饱和度。LF由689个氨基酸组成，包含13个Trp残基和21个Tyr残基（图S1）（Dyrda-Terniuk和Pomastowski，2023年）。其丰富的内在荧光残基理论上为内在DSF检测提供了足够的灵敏度。我们使用Prometheus NT.6仪器研究了该方法在确定LF Tm值、不同浓度范围内的适用性以及pH等因素的影响。此外，我们建立了内在DSF信号参数与LF铁饱和度之间的定量关系，并将其应用于实际样品的分析。作为方法可扩展性的初步探索，我们尝试使用该方法评估LF与不同阴离子聚合物（如DNA和阴离子多糖）的结合能力。本研究为LF及其相关产品的质量控制和工艺开发提供了分析工具。**

**材料与方法**
**材料与设备**
天然牛乳铁蛋白（bLF）购自FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.（日本大阪）。天然山羊乳铁蛋白购自YOBIOS Co. Ltd.（中国西安）。碳酸氢钠、人乳铁蛋白（hLF）、六水合硝酸铁（Fe(NO3)3·9H2O）、乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）、硝基三乙酸（NTA）、磷酸盐缓冲液（PBS）、二甲基亚砜（DMSO）、Chromeo染料P503、柠檬酸以及分子截留值为30 kDa的超滤管均购自Sigma-Aldrich, Inc.（美国密苏里州圣路易斯）。加载缓冲液（6×）购自TaKaRa Bio-tech Co. Ltd.（中国大连）。琼脂糖（分子生物学级）和SYPRO orange染料（SO，5000×）购自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。所有DNA序列（表S1）和TAE缓冲液（50×；2 mol/L Tris-Acetate；50 mmol/L EDTA；pH 8.0–8.6）购自Sangon Bio-Tech Co. Ltd.（中国上海）。肝素钠购自Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.（中国上海）。海藻酸钠购自Aladdin Reagent Co. Ltd.（中国上海）。PBS缓冲液（1×）使用超纯水（18.2 MΩ·cm，Millipore，美国马萨诸塞州）配制。所有蛋白质标准溶液均配制在1× PBS中。用于LF检测的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）。所有使用的化学品均为分析级。

**不同铁饱和度LF的制备**
根据先前报道（Sun等人，2024年），从天然LF制备了不同铁饱和度的LF样品。为了获得apo-LF，将天然bLF（5 mg/mL）溶解在含有EDTA-Na（50 mM）的柠檬酸缓冲液（pH 3.0）中，并在约25°C下搅拌2小时。通过将LF和FeNTA（9.9 mM Fe(NO3)3及8.5 mM NTA）溶解在超纯水中，制备了不同的LF与FeNTA比例（1:0、1:0.5、1:1、1:1.5和1:2）样品。使用固体碳酸氢钠将pH调整至7.0，然后在约25°C下搅拌2小时，并通过连续离心超滤（13000 rpm，10分钟，4°C，Eppendorf Centrifuge 5424 R）去除多余的铁。

**ICP-MS分析**
根据文献（Sun等人，2024年），使用ICP-MS（Agilent，美国加州）检测了真实LF样品和新鲜制备LF的总铁质量。样品（10 mL）用5 mL HNO3（25%）稀释后，采用微波消化系统在以下温度程序下进行矿化：120°C加热10分钟；以6°C/分钟的速度升温至180°C；在180°C下保持10分钟；以2°C/分钟的速度升温至200°C；在200°C下保持60分钟。随后，将样品用HNO3（2%）稀释至最终体积20 mL。ICP-MS分析条件如下：射频功率1550 W；辅助气体流量0.8 L/min；雾化气体流量0.8 L/min；泵速30 r/min。根据制造商说明（Majka等人，2013年），使用ELISA试剂盒测量LF含量。样品的铁饱和度根据1:2的摩尔比转换为实际值（Bokkhim等人，2014年）。

**传统比色皿内在荧光**
传统比色皿内在荧光测量使用FS5荧光光谱仪（Edinburgh Instruments Co., 英国利文斯顿）进行。荧光发射光谱的记录范围为290至400纳米。通过在不同温度下加热5分钟，制备了200微升的apo bLF、天然bLF或铁饱和LF样品（0.2毫克/毫升）。每个样品进行了三次测量。

**DSF分析**
所有基于毛细管的内在DSF实验均在Prometheus NT.6仪器（NanoTemper Technologies，德国）上进行，遵循制造商的说明；加热速率从35°C到95°C为30°C/分钟。只有研究熔化速率（1°C/分钟、7°C/分钟和30°C/分钟）影响的实验在Prometheus Panta（NanoTemper Technologies，德国）上进行。大约10.0微升的LF（0.5毫克/毫升）以不同铁饱和度通过毛细管作用加载到DSF毛细管中。为了评估LF与各种DNA序列（表S1）和不同阴离子聚合物（肝素钠和海藻酸钠）的结合，将10.0微升的LF（0.5毫克/毫升）与不同序列的DNA或阴离子聚合物混合后加载到毛细管中。荧光测量的激发波长为280纳米。原始数据以数据集的形式导出，其中包含330纳米（F330）和350纳米（F350）的荧光值、F350与F330的比值（F350/F330）以及这些值的一阶导数。内在DSF峰面积是根据F350的一阶导数（(d(F350)/dT）或F350/F330（d(F350/F330)/dT）估算的，对于S1，基线是从55.0°C到77.0°C绘制的；对于S2，基线是从80.0°C到95.0°C绘制的。S1是指在55.0°C到77.0°C温度范围内的d(F350)/dT或d(F350/F330)/dT的积分面积；S2是指在80.0°C到95.0°C温度范围内的d(F350)/dT或d(F350/F330)/dT的积分面积。

**外在DSF测量**
外在DSF测量使用实时PCR仪器（IT-IS Life Science Ltd.，英国）进行，参考了之前的报告（Sun等人，2024年）。最终的10.0微升样品含有1毫克/毫升的bLF和20倍SO染料，在1×PBS中。

**电泳迁移率测定（EMSA）**
对于DNA和bLF的结合，用FAM（6-羧基荧光素）标记的DNA（0.25微摩尔）与bLF（20纳克/微升）在1×PBS中孵育。制备好的样品（20微升）与3微升的加载缓冲液（6倍）混合后，加载到1%琼脂糖凝胶上。为了验证bLF与各种阴离子多糖（海藻酸钠和肝素钠）的结合，将10毫克/毫升的bLF与0.05毫克/毫升的Chromeo染料P503在50°C下孵育10分钟。然后将制备好的Chromeo染料P503标记的bLF（0.5毫克/毫升）与不同的阴离子多糖（0.2毫克/毫升）在1×PBS中孵育。制备好的样品（10微升）与2微升的6倍加载缓冲液混合后，加载到0.5%琼脂糖凝胶上。随后在1×TAE缓冲液中以100伏特电场运行25分钟。凝胶电泳使用Bio-Rad设备（Hercules，美国加利福尼亚州）进行。凝胶图像分析使用TGel Image System（Tiangen Biotech，北京，中国）完成。通过手动在条带周围绘制框来量化每个条带的荧光强度。

**软件和统计**
数据主要使用Origin 9.1程序（Origin Lab Co.，北安普顿，马萨诸塞州，美国）进行处理和绘图，而统计分析（单因素方差分析，P < 0.05）则使用GraphPad Prism 8.0进行。所有实验均重复三次，结果表示为平均值±标准差。

**结果与讨论**
**使用传统比色皿内在荧光法测定LF的热稳定性和铁饱和度**
由于该方法的简单性和通用性，Tm值被广泛用于评估蛋白质的热稳定性。首先，我们使用了一种广泛采用的传统比色皿内在荧光方法，基于LF的内在荧光来测量其Tm值（图1）。内在荧光反映了蛋白质 unfolding过程中色氨酸暴露于水溶剂的程度（Wang等人，2013年）。我们测量了bLF在不同加热温度下的内在荧光强度变化。铁的结合稳定了LF的结构，提高了其热稳定性，并改变了色氨酸暴露于水溶剂的情况（Ferreira等人，2018年）。图S2显示了apo-bLF、天然bLF（铁饱和度：14.5%）和holo-bLF在不同加热温度下的传统比色皿内在荧光光谱。加热温度影响了apo-bLF、天然bLF和holo-bLF的内在荧光强度。随着加热温度的升高，apo-bLF、天然bLF和holo-bLF的发射最大值（λmax）从326纳米、327纳米和330纳米分别红移至335纳米（图1和图S2）。λmax随温度升高而红移表明，原本埋藏在天然蛋白质疏水核心中的色氨酸残基逐渐暴露于极性水环境中。对于变性的bLF，色氨酸残基几乎完全暴露于水溶液中（Stanciuc等人，2013年）。

**内在DSF**
在内在DSF中，使用d(F350/F330)/dT来表征蛋白质的热稳定性。根据这种数据处理方法，我们使用传统比色皿内在荧光方法确定了bLF的Tm值（图1A和B）。apo-bLF的Tm值（67.1 ± 1.2°C）和天然bLF的Tm值（70.1 ± 0.3°C）低于holo-bLF的Tm值（84.4 ± 0.1°C）（图1B和表2），这证实了铁的结合稳定了bLF并提高了其热稳定性（Ferreira等人，2018年）。

**外在DSF**
**通过实时PCR仪器进行外在DSF测量**
根据之前的报告（Sun等人，2024年），最终的10.0微升样品含有1毫克/毫升的bLF和20倍SO染料，在1×PBS中。

**电泳迁移率测定（EMSA）**
对于DNA和bLF的结合，将FAM（6-羧基荧光素）标记的DNA（0.25微摩尔）与bLF（20纳克/微升）在1×PBS中孵育。制备好的样品（20微升）与3微升的加载缓冲液（6倍）混合后，加载到1%琼脂糖凝胶上。为了验证bLF与各种阴离子多糖（海藻酸钠和肝素钠）的结合，将10毫克/毫升的bLF与0.05毫克/毫升的Chromeo染料P503在50°C下孵育10分钟。然后将制备好的Chromeo染料P503标记的bLF（0.5毫克/毫升）与不同的阴离子多糖（0.2毫克/毫升）在1×PBS中孵育。制备好的样品（10微升）与2微升的6倍加载缓冲液混合后，加载到0.5%琼脂糖凝胶上。随后在1×TAE缓冲液中以100伏特电场运行25分钟。凝胶电泳使用Bio-Rad设备（Hercules，美国加利福尼亚州）进行。凝胶图像分析使用TGel Image System（Tiangen Biotech，北京，中国）完成。通过Image J软件手动绘制条带周围的框来量化每个条带的荧光强度。

**软件和统计**
数据主要使用Origin 9.1程序（Origin Lab Co.，北安普顿，马萨诸塞州，美国）进行处理和绘图，而确定显著差异的统计分析（单因素方差分析，P < 0.05）则专门使用GraphPad Prism 8.0进行。所有实验均重复三次，结果表示为平均值±标准差。

**结论**
**使用传统比色皿内在荧光法测定LF的热稳定性和铁饱和度**
由于该方法的简单性和通用性，Tm值被广泛用于评估蛋白质的热稳定性。首先，我们使用了一种广泛采用的传统比色皿内在荧光方法，基于LF的内在荧光来测量其Tm值（图1）。内在荧光反映了蛋白质 unfolding过程中色氨酸暴露于水溶剂的程度（Wang等人，2013年）。我们测量了bLF在不同加热温度下的内在荧光强度变化。铁的结合稳定了LF的结构，提高了其热稳定性，并改变了色氨酸暴露于水溶剂的情况（Ferreira等人，2018年）。图S2显示了apo-bLF、天然bLF（铁饱和度：14.5%）和holo-bLF在不同加热温度下的传统比色皿内在荧光光谱。加热温度影响了apo-bLF、天然bLF和holo-bLF的内在荧光强度。随着加热温度的升高，apo-bLF、天然bLF和holo-bLF的发射最大值（λmax）从326纳米、327纳米和330纳米分别红移至335纳米（图1和图S2）。λmax随温度升高而红移表明，原本埋藏在天然蛋白质疏水核心中的色氨酸残基逐渐暴露于极性水环境中。对于变性的bLF，色氨酸残基几乎完全暴露于水溶液中（Stanciuc等人，2013年）。

**内在DSF**
在内在DSF中，使用d(F350/F330)/dT来表征蛋白质的热稳定性。根据这种数据处理方法，我们使用传统比色皿内在荧光方法确定了bLF的Tm值（图1A和B）。apo-bLF的Tm值（67.1 ± 1.2°C）和天然bLF的Tm值（70.1 ± 0.3°C）低于holo-bLF的Tm值（84.4 ± 0.1°C）（图1B和表2），这证实了铁的结合稳定了bLF并提高了其热稳定性（Ferreira等人，2018年）。

**通过内在DSF测定LF的熔化温度**
由于传统比色皿内在荧光仅提供不连续的温度监测，因此获得准确的Tm值需要时间。因此，我们采用内在DSF通过测量其Tm值来评估LF的热稳定性和铁饱和度。图2A显示了用于测量LF热稳定性和铁饱和度的内在DSF方法的示意图。蛋白质样品被转移到毛细管中，通过内在DSF进行评估。通过监测色氨酸在两个波长下的荧光发射变化来记录荧光强度。Tm值是根据d(F350)/dT或d(F350/F330)/dT确定的，用于评估LF的热稳定性。铁的结合提高了LF的热稳定性；因此，holo-LF的Tm值高于apo-LF。此外，随着铁饱和度的增加，大约90°C处的变性峰的峰面积（S2）增加，而70°C处的变性峰的峰面积（S1）减少。重要的是，这种相关性基于LF铁饱和度水平与峰面积比（S2/(S2+S1)）之间的线性关系；这种关系是在我们最近的研究中使用外部染料（SYPRO Orange或Glomelt染料）通过DSF建立的（Sun等人，2024年）。因此，建立一种内在DSF方法来评估LF样品中的铁饱和度和热稳定性是很有吸引力的。

**结论**
**使用内在DSF测定LF的熔化温度**
由于传统比色皿内在荧光仅提供不连续的温度监测，获得准确的Tm值需要时间。因此，我们采用内在DSF通过测量其Tm值来评估LF的热稳定性和铁饱和度。图2A显示了用于测量LF热稳定性和铁饱和度的内在DSF方法的示意图。（A）基于bLF浓度为1毫克/毫升的apo-bLF、天然bLF和holo-bLF的内在DSF热图。（B）基于三次分析的bLF的内在DSF热图。（C）bLF的外在DSF测量的重复性（三次样品，1毫克/毫升）。（D）内在DSF热图显示bLF浓度对bLF热稳定性检测的影响：F350/F330（上）和F350/F330的一阶导数（下）。图S3A和图2B（上）显示了apo-bLF、天然bLF和holo-bLF的F350和F350/F330值。这些值关于温度的一阶导数使我们能够确定Tm值，以评估bLF的热稳定性。观察到apo-bLF和holo-bLF在大约69.5 ± 0.7°C–70.2 ± 0.7°C和89.4 ± 0.4°C–90.3 ± 0.6°C处有明显的单一热转变（图S3 A和图2B，下）。holo-bLF的Tm值高于apo-bLF，这可以归因于铁的结合提高了稳定性（Ferreira等人，2018年）。天然bLF是一种部分铁饱和的LF，具有相对松散的结构，这导致两种方法测得的Tm值存在差异（表2）。尽管两种方法都能反映LF的热变性过程，但d(F350/F330)/dT更好地代表了其整体构象变化，并与随后使用的内在DSF方法一致。因此，从d(F350/F330)/dT得出的Tm值更适合评估LF的热稳定性。

**通过内在DSF测定LF的熔化温度**
由于传统比色皿内在荧光仅提供不连续的温度监测，获得准确的Tm值需要时间。因此，我们采用内在DSF通过测量其Tm值来评估LF的热稳定性和铁饱和度。图2A显示了用于测量LF热稳定性和铁饱和度的内在DSF方法的示意图。蛋白质样品被转移到毛细管中，通过内在DSF进行评估。通过监测色氨酸在两个波长下的荧光发射变化来记录荧光强度。Tm值是根据d(F350)/dT或d(F350/F330)/dT确定的，用于评估LF的热稳定性。铁的结合提高了LF的热稳定性；因此，holo-LF的Tm值高于apo-LF。此外，随着铁饱和度的增加，大约90°C处的变性峰的峰面积（S2）增加，而70°C处的变性峰的峰面积（S1）减少。重要的是，这种相关性基于LF铁饱和度水平与峰面积比（S2/(S2+S1)）之间的线性关系；这种关系是在我们最近的研究中使用外部染料（SYPRO Orange或Glomelt染料）通过DSF建立的（Sun等人，2024年）。因此，建立一种内在DSF方法来评估LF样品中的铁饱和度和热稳定性是很有吸引力的。通过避免引入可能干扰蛋白质稳定性的有机溶剂，这种方法能够在更接近生理条件的情况下反映蛋白质的稳定性。我们还评估了pH值对bLF热稳定性的影响。随着pH值从4.0增加到7.4，Tm值逐渐升高（图3和图S4C），这与圆二色性研究的结果一致（表S3）（Sreedhara等人，2010b；Franco等人，2018；Frank，2007）。这可能是因为bLF结合铁的能力与pH值有关。在pH值为2.0到7.0的范围内，随着pH值的增加，铁的结合能力会降低（Sreedhara等人，2010b）。铁与bLF的结合会影响bLF的热稳定性。在较低的pH值下，当铁含量减少时，其热稳定性也会降低。这些结果表明，bLF与铁离子之间的静电相互作用对bLF的稳定性和铁的释放至关重要（Sreedhara等人，2010b）。此外，内在DSF成功检测了不同物种（包括人LF（hLF）和山羊LF（gLF））的LF热稳定性（图3、图S4D和表S4）。与bLF和gLF相比，hLF被发现具有最高的耐热性，这与基于DSC（Conesa等人，2008）和外在DSF（Sun等人，2024）的研究结果一致。这些发现证明了内在DSF作为通过Tm测量评估LF稳定性的替代方法的可靠性。为了评估bLF中的铁饱和度，使用内在DSF分析了一系列具有不同铁含量的样品（图4）。通过电感耦合等离子体质谱-酶联免疫吸附测定（ICP-MS）结合ELISA确定了apo-LF和LF/FeNTA的比例分别为1:0、1:0.5、1:1、1:1.5和1:2时，LF的铁饱和度分别为0.30%、14.5%、32.5%、63.8%和99.6%（表S5和图S5）。每克LF中1.4毫克的铁被视为100%饱和度（Bokkhim等人，2014）。观察到铁饱和度与S2/(S1+S2)之间存在强线性相关性（R2 > 0.9）（图4C和F）。值得注意的是，从d(F350)/dT得出的S2/(S1+S2)提供了更好的线性关系，表明F350是量化LF铁饱和度的更合适参数。色氨酸在水溶液中暴露时的最大发射荧光强度出现在约355纳米处（Sreedhara等人，2010b）。F350的初始荧光可以间接指示天然构象中色氨酸暴露于水溶液的程度。如图4A所示，随着LF中铁饱和度的增加，F350的初始值降低。这表明LF中色氨酸暴露于水溶液的程度与铁饱和度密切相关。然而，F350/F330的值受到330和350纳米处荧光变化的影响，额外的计算步骤可能会降低与铁结合状态的直接相关性。因此，与F350/F330相比，F350更适合定量检测LF的铁饱和度。

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图4. LF中铁饱和度的内在DSF测量。(A) F350和(B) 在不同铁饱和度下的F350导数。(D) F350/F330和(E) 在不同铁饱和度下的F350/F330导数。线性图显示了LF中铁饱和度与S2/(S1+S2)比率的关系（C, F）。

最后，为了验证从内在DSF得出的Tm值在评估bLF铁饱和度方面的适用性，分析了3个具有不同铁饱和度的bLF样品（图S6）。bLF样品（0.5 mg/mL）直接用于内在DSF分析，结果与ICP-MS结合ELISA的结果一致（表3）。满意的结果证实了内在DSF方法能够准确检测bLF样品的铁饱和度。虽然从传统的比色皿内在荧光法得出的Tm值也可以用于评估LF的铁饱和度，因为apo-LF和holo-LF的Tm值不同（图1），但内在DSF提供了更高的通量并生成了更全面的数据。

表3. 通过内在DSF和ICP-MS结合ELISA测定的三个样品中的铁饱和度
样品 内在DSF ICP-MS结合ELISA
F350 13.25% ± 0.5 8.30% ± 0.48%
F350/F330 14.73% ± 0.43 10.42% ± 0.29%
a 8.07% ± 0.63 10.95% ± 0.16%
c 102.24% ± 0.37 113.14% ± 5.79%
99.76% ± 0.27%

**LF-阴离子聚合物结合的内在DSF评估**
除了评估LF的热稳定性和铁饱和度外，所提出的内在DSF方法还具有潜在的应用前景。由于其快速和高通量特性，它特别适合于蛋白质-配体相互作用的快速筛选和表征。LF具有结合各种类型DNA的能力（包括能够特异性或非特异性结合LF的DNA）（Kanyshkova等人，Guschina等人，2013；Kanyshkova等人，1999）。使用Alpha Fold 3（https://golgi.sandbox.google.com/about）（Abramson等人，2024）进行分子对接，以预测DNA和bLF之间的相互作用。如图S7所示，bLF具有可以特异性结合先前筛选出的DNA（1）以及非特异性结合LF的DNA（2）的结合位点。传统的比色皿内在荧光方法使用330纳米（Guschina等人，2013）或335纳米（Kanyshkova等人）的发射荧光测量来评估LF和DNA之间的相互作用。LF和DNA之间的相互作用导致LF的Trp残基内在荧光发射减少（Guschina等人，2013）。实验通常固定LF的浓度并连续添加DNA以记录荧光光谱变化，这需要校准稀释效应（Guschina等人，2013），增加了操作的复杂性。我们探索了使用内在DSF方法评估LF与DNA结合的能力。LF与DNA的结合可能会改变LF的结构，从而影响其热稳定性。我们根据LF的Tm值增加情况估计了LF与各种DNA的结合能力（表S1）。研究表明，LF对特异性结合DNA（1）的结合能力高于非特异性结合DNA（2）（图5A-B和图S8A）。在EMSA分析中，在非特异性DNA（1）存在的情况下没有观察到结合的DNA条带，而对于特异性DNA（1），则出现了相应的条带（图S9）。因此，所提出的内在DSF方法能够表征LF与DNA序列的结合。

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图5. LF对阴离子聚合物结合能力的内在DSF评估。(A) 不同DNA类型存在下bLF的内在DSF评估得到的标准化F350/F330。相应的核苷酸序列在补充信息的表S1中提供。(B) bLF与不同长度DNA结合时的Tm值变化。bLF：1 mg/mL；DNA，1 μM。(C-D) 铁饱和度对bLF与DNA（1）结合的影响。标准化F350/F330（C）和不同铁饱和度bLF与DNA（1）结合的Tm值（D）。bLF：0.5 mg/mL；DNA，1 μM。虚线和实线分别代表bLF和bLF与DNA（1）的结合。bLF与肝素钠和海藻酸钠结合的标准化F350/F330（E）和Tm值（F）。bLF：0.5 mg/mL；肝素钠和海藻酸钠：0.2 mg/mL。插图显示了bLF与肝素钠和海藻酸钠的结合凝胶图像。1–3分别代表bLF + 海藻酸钠、bLF、bLF + 肝素钠。

此外，我们研究了不同DNA长度对bLF结合的影响（图5A和图S8A）。尽管不同的DNA长度（DNA（3）、DNA（4）和DNA（7）可以与bLF结合并略微增加其Tm值，但它们的结合能力显著低于特异性结合DNA（1）（图5B），这与EMSA结果一致（图S9）。因此，内在DSF方法提供了一种评估LF与不同DNA结合能力的替代和快速方法，并可用于筛选提取LF的DNA亲和配体。对于铁饱和度低于63.8%的bLF，DNA（1）的结合主要导致bLF在70°C时的Tm值增加（图5C-D和图S8B）。不同的铁饱和度对DNA（1）的结合能力没有显著影响，这与EMSA显示的LF与不同铁饱和度结合的结果一致（Sun等人，2024）。当bLF的铁饱和度高于63.8%时，DNA（1）的结合导致LF在大约90°C时的Tm值略有增加。这可能是因为铁饱和度较高的LF构象已经相对稳定（bLF的Tm从约70°C变为约90°C），即使与DNA（1）结合，Tm也难以显著增加。这并不意味着holo-bLF完全不与DNA（1）结合；而是内在DSF方法在这个范围内的敏感性降低了。

由于bLF的高等电点（8.9～9.0）（Bokkhim等人，2013），我们还测试了bLF与含有-SO42-和-COO?基团的不同阴离子聚合物的结合。结果显示在图5 E-F和图S8 C中。肝素（含有-SO42-）已被用作bLF提取的亲和配体。肝素钠的存在导致bLF的Tm值增加，表明bLF与肝素结合（Guschina等人，2013）。此外，在含有-COO?的海藻酸钠存在下，天然bLF的Tm值也增加，这与之前的DSC研究结果一致（Bokkhim等人，2015）。LF可以通过静电相互作用与海藻酸钠的羧基结合，从而增加其Tm值。EMSA结果还显示了bLF与阴离子聚合物海藻酸钠和海藻酸钠的结合（图5 E，插图）。因此，bLF可以通过静电相互作用与DNA以外的其他阴离子聚合物结合，进一步表明该方法在表征bLF与不同配体的结合方面具有广泛的应用。

尽管传统的比色皿内在荧光法在室温下也可以用于确定LF与配体之间的结合（例如，荧光强度随DNA的增加而降低）。在含有多种蛋白质的复杂基质中，Tm值作为特定蛋白质-配体相互作用的指纹，这无法通过简单的荧光强度测量来实现，因为其他蛋白质的干扰。单次内在DSF扫描可以同时分析具有不同Tm值的蛋白质，并通过利用Tm值的差异来区分LF与DNA的结合。因此，在特定结合表征方面，内在DSF具有独特的优势。此外，DNA在260纳米处的吸收延伸到Trp的激发波长（约280纳米）。添加一定浓度的DNA会导致系统在280纳米处的吸光度超过0.05，从而触发由于激发光的竞争性吸收而产生的主要内部过滤效应（Kasparek和Smyk，2018；Xu等人，2018）。这种荧光衰减不是由LF-DNA结合引起的，因此需要复杂的校正程序来准确确定结合相互作用。

**结论**
总之，我们建立了一种内在DSF方法，通过从内在荧光得出的Tm值来评估热稳定性和铁饱和度。该方法不需要使用外部染料，从而避免了染料-蛋白质结合对LF热稳定性的影响。这项工作表明，内在DSF利用内在荧光，能够快速（<3分钟）通过Tm测量确定LF的热稳定性和铁饱和度。与需要仔细选择染料和实验条件的外在DSF不同，内在DSF适用于各种蛋白质，无需进行大量修改。尽管通过 d(F350)/dT 或 d(F350/F330)/dT 计算得到的 S2/(S1+S2) 比值可以用来量化铁饱和度，但 d(F350/F330)/dT 的表现更为优异，这可能是因为暴露在水溶剂中的色氨酸与 LF 的铁结合状态具有更直接的相关性。所提出的方法可用于评估实际 bLF 样品中的铁饱和度水平。内在 DSF 还可以用来通过监测 LF 的 Tm 值变化来定性测量 LF 与各种阴离子多糖和 DNA 的结合能力。因此，除了提供一种准确、快速、稳健且高通量的方法来评估 LF 的生物活性外，内在 DSF 作为一种筛选亲和配体以及探索 LF 与各种配体之间相互作用的工具也具有很大的潜力。