生成超快速蛋白质转剪技术：用于化学蛋白质标记的无半胱氨酸且半合成的分裂内含子

《ChemBioChem》：Generating Ultra-Fast Protein trans-Splicing of a Cysteine-Less and Semisynthetic Split Intein for Chemical Protein Labeling

　　摘要

近年来，不含半胱氨酸的分裂内含子已成为蛋白质标记和修饰工具箱中的宝贵补充，因为它们能够在氧化条件下进行蛋白质转剪接（PTS）反应。此外，它们的使用与外含子序列中半胱氨酸的不同氧化还原状态以及目标蛋白质兼容。然而，一种能够快速剪接且具有短前体片段的不含半胱氨酸的分裂内含子仍然缺失，这种内含子便于进行固相肽合成。化学合成的分裂内含子前体允许进行半合成PTS，这对于将完全合成的序列段引入目标蛋白质非常有用。在这里，我们生成了一种优化版本的高效分裂CL（不含半胱氨酸）内含子，其剪接速率在秒级范围内，与表现最好的分裂内含子相当。通过优化人工剪接位点及其两侧的外含子残基，我们将反应速率提高了9到16倍。在化学合成N端前体（仅含26个氨基酸的内含子片段）后，我们展示了通过超快动力学将短荧光标记肽标签转移到蛋白质N端的半合成过程。因此，这种优化的分裂CL内含子将进一步扩展化学蛋白质标记方法。

蛋白质转剪接（PTS）是一种强大的蛋白质半合成方法，可用于生成通过生物合成难以或无法引入的具有位点特异性修饰的蛋白质。本文作者报告了第一种超快且不含半胱氨酸的分裂内含子，其N端片段足够短，可以进行不受氧化还原条件影响的半合成PTS。

1 引言

蛋白质的选择性化学修饰具有多种用途，从生化特性研究和细胞生物学研究到设计在生物技术或生物医学中有用的工程蛋白质（如基于蛋白质的治疗剂或诊断工具）。有许多蛋白质化学工具可用于选择性地修饰和/或替换蛋白质中的氨基酸侧链，或特异性地靶向融合蛋白质或肽标签。其他方法旨在翻译后修饰蛋白质的多肽骨架，以引入或去除（标记的）骨架片段。这些方法包括化学连接方法（如天然化学连接）和利用subtiligase、sortase、butelase或其他转肽酶的酶促连接方法。分裂内含子是一种独特的酶促连接形式，它们作为单次周转催化剂催化两种蛋白质或短肽标签的蛋白质转剪接（图1）。分裂内含子结合了多肽骨架的明确且几乎无痕的修饰与对反应伙伴的特异性和高亲和力识别，使得在低浓度下进行蛋白质连接成为可能，并且对于某些内含子来说，还具有快速的第二级动力学（图1）。分裂内含子介导的PTS是一种强大的蛋白质半合成方法，可用于生成具有难以或无法通过生物合成引入的位点特异性修饰的蛋白质。

2 结果与讨论

2.1 CL内含子中改变的剪接位点删除提高了其PTS速率

先前报道的CL内含子是通过在Aes123 PolB1内含子的N端附近进行人工剪接而获得的。最初的剪接位点D26/E34产生了26个氨基酸的IntN[D26]片段和从第34个残基开始的较长[E34]IntC片段（加上额外的起始甲硫氨酸；图2a）。当时选择删除V27?D33残基是基于结构预测和对齐结果，这些预测表明Aes123 PolB1内含子中大约25到40个残基的区域相对于Ssp DnaB迷你内含子的最小马蹄形折叠是一个多余的插入片段。在这里，我们旨在根据随后发布的Aes123 PolB1内含子的晶体结构（PDB ID: 9HTH）[23]来优化剪接位点，以改进CL内含子的性能。图2展示了人工分裂CL内含子中改变的剪接位点删除情况：(a) 示意图展示了根据最小内含子折叠中的保守二级结构元素（灰色：可选插入）进行的研究剪接位点删除，以及典型的（S0）和非典型的（S1, S2, S3, S10, S11）剪接位置（根据Sun等人的编号系统[37]）。注意，Aes123 PolB1内含子在S2位置有一个插入片段，包括β4和β5链。典型的分裂内含子包含一个约100?120个氨基酸的N端片段（IntN）和一个约35?50个氨基酸的C端片段（IntC）。这种相对于连续内含子的最小马蹄形折叠的剪接位置与所谓的大内含子中发现的归巢内切酶结构域（HEN）的插入点一致。天然存在的分裂内含子在N端附近具有非典型的剪接位点，其IntN片段较短，为15?35个氨基酸。蛋白质剪接是一种自催化的翻译后反应，其中内含子作为中间蛋白质片段从蛋白质前体中自我切除，同时通过天然肽键将其两侧的外含子序列连接起来[16]。分裂内含子前体以两个独立的多肽形式表达，分别具有N端（IntN）和C端（IntC）片段。它们结合并折叠成活性内含子结构以催化蛋白质转剪接（PTS）[16]。PTS可以在秒级、分钟级或小时级发生。特别是，能够在秒级内完成剪接的超快分裂内含子已成为蛋白质工程和合成生物学中的强大工具[23]。蛋白质（转）剪接通过多肽骨架的一系列协调酰基重排进行，中间体为共价硫酯或酯[16]。内含子的第一个残基（位置1）是主要I类内含子中的催化半胱氨酸或丝氨酸残基[24]，它通过形成第一个（硫）酯中间体来启动剪接。作为内含子的一部分，这个残基在最终剪接的蛋白质中被去除[16]。相比之下，C端外含子的第一个残基（位置+1）是催化必需的半胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基，参与第二个（硫）酯中间体和分支中间体（BI）的形成，并且是反应中唯一必须保留在连接位点的残基。大多数内含子的剪接反应依赖于半胱氨酸，因为它们至少使用一个Cys1残基[25, 26]。这种对半胱氨酸的依赖性要求PTS在还原条件下进行，因为部分氧化的催化半胱氨酸（例如以二硫键形式）会导致剪接产率降低[26]。最近，我们报道了第一种在室温下活性的不含半胱氨酸的分裂内含子，显著扩展了PTS反应的应用范围[23]。不含半胱氨酸的分裂内含子是一类罕见的内含子，它们在1和+1位置仅含有丝氨酸或苏氨酸残基。理想情况下，它们的序列中也不包含额外的半胱氨酸，或者只含有非必需的半胱氨酸。重要的是，由于不含半胱氨酸的内含子不需要还原剂即可达到完全活性，因此它们适用于对还原条件敏感的蛋白质，例如那些含有二硫键的蛋白质[26, 29]。此外，与依赖半胱氨酸的内含子不同，它们完全兼容氧化条件，例如细胞外环境中的条件。此外，不含半胱氨酸的分裂内含子可以与硫醇生物偶联化学方法结合，从而独立修饰每个外含子片段，为蛋白质在一个[26, 29]、两个[23]甚至三个[28]位置（通过使用两个正交不含半胱氨酸的分裂内含子的串联PTS从三个片段组装蛋白质）的位置提供独特的选择性化学标记途径。尽管取得了这些进展，但与依赖半胱氨酸的分裂内含子相比，我们对不含半胱氨酸的分裂内含子的了解及其生化特性的认识仍然非常有限。目前已知只有四种适合剪接纯化蛋白质的不含半胱氨酸的分裂内含子：CLm[23]、LCGC14[28]、PolB16 OarG[27]和CL内含子[26]。为了充分发挥这一家族的潜力，需要鉴定出更多高活性的不含半胱氨酸的分裂内含子。只有CLm内含子（不含半胱氨酸且单体）属于能在几秒钟内完成剪接的超快分裂内含子类别[23]。这种内含子源自Aes123 PolB1内含子，并经过合理突变以防止IntN前体聚集，从而实现高PTS效率[23]。LCGC14内含子虽然几乎可以定量剪接（≥90%），但其半衰期为8.6分钟[28]。重要的是，仍然缺乏具有短内含子片段和超快剪接动力学的不含半胱氨酸的分裂内含子，这将是蛋白质连接和点击生物学[3]工具的特别有用的工具。天然存在的不典型分裂内含子的IntN片段较短，为15–35个氨基酸[27]，而典型分裂内含子的IntN片段通常约为100?130个氨基酸（IntN）和35?50个氨基酸（IntC）[19, -]。足够短的IntN片段有几个优点，因为它们最小化了对外源蛋白质的潜在干扰，并且可以通过固相肽合成（SPPS）方便地获得。合成前体使得可以直接在外含子部分引入非天然的化学修饰，然后通过半合成PTS反应将其转移到目标蛋白质中。PolB16内含子是唯一已知的天然存在的、不含半胱氨酸且非典型分裂的内含子，其IntN片段仅为15个氨基酸，并在半合成PTS中显示出实用性[27]。然而，其实际价值受到较差的剪接效率的限制，包括高达25%的C-切割副反应和较慢的PTS反应速率（t1/2 > 25分钟，pH 7[27]）。同样，CL内含子是人工分裂的Aes123 PolB1内含子的变体，其IntN片段仅为26个氨基酸[26]。尽管它的剪接效率很高（≥90%），但其剪接速率较慢，t1/2约为20分钟[26]。这种对剪接性能的影响通常在人工分裂的内含子中观察到[17, -]。因此，仍在寻找一种用于蛋白质半合成的超快不含半胱氨酸的分裂内含子，该内含子具有一个短片段。此外，内含子两侧的残基变化会对剪接性能产生不同程度的影响，这已在几种依赖半胱氨酸的内含子中得到研究[34, -]。然而，新的不含半胱氨酸的分裂内含子对非天然序列环境的耐受性尚未进行研究。在这项工作中，我们旨在获得一种具有较短IntN片段且PTS活性提高的不含半胱氨酸的分裂内含子，并研究其对外含子残基的耐受性。由于缺乏其他天然存在的候选物进行测试，我们重新研究了之前报道的CL内含子及其26个氨基酸的IntN片段。进一步修剪IntC片段以及对其外含子残基偏好的系统研究出人意料地使PTS速率提高了16倍。这些发现为蛋白质的翻译后工程扩展了分裂内含子工具箱，并提供了关于高剪接活性重要因素的宝贵见解。先前使用的D26/E34切割位点有效地去除了β链的β4部分，表明它对蛋白质的折叠和剪接过程并非必需。自然存在的非典型切割位点通常会产生较短的IntN片段，这些位点要么位于β链的β2之后（也称为S1位置[37]），如半胱氨酸依赖性的VidaL intein[33, 45]和不含半胱氨酸的PolB16 intein[27]中所观察到的；要么位于第一个α螺旋（α1）之后（也称为S2位置），如半胱氨酸依赖性的AceL TerL[31]和GOS TerL[32] intein中所发现的（见图2a,b）。Aes123 PolB1 intein中的S2切割位点位于T24残基之后（见图2b）。为了研究这一位置，我们将参考模型构建MBP-IntN[D26]-H6（1P；麦芽糖结合蛋白作为外延蛋白）[26]中的IntN片段缩短为MBP-IntN[T24]-H6（3P）。我们还测试了其他截短版本，得到了MBP-IntN[D22]-H6（4P）、MBP-IntN[F20]-H6（5P）和MBP-IntN[S11]-H6（6P），后者对应于S1位置。这些蛋白质与C端参考前体构建SBP-[E34]IntC-Trx-H6（2P）[26]进行了PTS反应，后者使用硫氧还蛋白（Trx）作为模型外延蛋白，链霉亲和素结合肽（SBP）作为表达标签（见图2c）。所有前体蛋白都在大肠杆菌中通过重组表达，并使用Ni-NTA亲和层析法进行纯化。通过将每个N端前体与C端前体以等摩尔比在37°C下孵育（无还原剂存在下）来评估剪接效率（见图S2）。如图2d（左侧面板）所示，与D26/E34切割位点相比，T24/E34切割位点的剪接效率显著降低，而进一步缩短的IntN前体的活性几乎完全丧失。我们还将前体6P（MBP-IntN[S11]-H6）与其S1位置对应的前体MBP-IntN[G12]-H6（10P）进行了测试。有趣的是，剪接过程能够顺利进行，并且在24小时内几乎完成，这表明其具有潜在的实际应用价值。然而，由于剪接速率显著降低，我们在本研究中没有进一步探讨这一变体（见图2a,d,f和S4）。接下来，我们进一步研究了C端切割intein前体的缺失情况。为此，我们准备了SBP-[V27]IntC-Trx-H6（7P）、SBP-[W38]IntC-Trx-H6（8P）和SBP-[G43]IntC-Trx-H6（9P）构建，并将它们分别与N端前体1P结合进行测试。为了计算伪一级速率常数，其中一个前体以三倍摩尔过量使用（见图S3）。1P与7P之间的剪接效率低于原始的D26/E34切割位点，剪接速率从0.60 ± 0.04 × 10?3 s?1降低到0.49 ± 0.03 × 10?3 s?1（见图2d，中间面板；见图S3f）。然而，将缺失扩展到D26/W38切割位点时，使用构建8P，剪接速率显著提高了近三倍，达到1.48 ± 0.07 × 10?3 s?1，半衰期为7.8分钟（见图2d?f和S3）。当使用其中一个前体以摩尔过量时，无论是1P还是8P，在两种情况下，反应中的亚化学计量蛋白质几乎完全消耗（见图2e）。最后，1P和9P的组合导致剪接活性完全丧失，表明对β链β5的缺失会严重影响intein的结构（见图2b）。β链β5可能对稳定β链β8很重要，后者通过提供保守的催化基团X组氨酸（His68）参与催化中心的形成，这是半胱氨酸独立intein所特有的关键残基[27]。

2.2 CL intein在?1位置的局部外延蛋白耐受性

我们研究了CL intein对外延蛋白侧链残基变化的耐受性。通过对亲本Aes123 PolB1 intein[23]的晶体结构分析，发现大多数外延蛋白残基的潜在相互作用仅限于intein的边缘区域，对剪接的影响很小（分别在N端和C端外延蛋白中有四个和六个残基被包含在通过点突变失活的intein晶体结构中，这些突变影响了Ser1和Asn159残基的蛋白质剪接功能）。然而，Asp?1残基通过其侧链羧基与催化基团B/N3组氨酸（His90）的π-氮形成氢键，从而采用了不寻常的构象[23]。这种相互作用可能通过Asp?1构象对肽键施加扭转应力，有助于促进初始的N?O酰基转移，以及其他更保守的机制。因此，晶体结构表明，通常被认为是最不具催化性的?1位置侧链的性质可能对Aes123 PolB1和CL inteins的剪接活性特别重要。我们在N端前体MBP-IntN[D26]-H6（1P）的?1位置准备了14种侧链替代品，代表了所有可能的侧链物理化学性质和空间需求。我们通过使用C端前体SBP-[W38]IntC-Trx-H6（8P）（以三倍摩尔过量）进行PTS反应来评估它们的影响（见图3a）。值得注意的是，大多数?1位置的替代品在6小时后产生了50%?90%的可接受产物产量，但在大多数情况下剪接速率显著降低（见图3b,c）。图3

2.3 CL intein在+1位置同时含有Ser和Thr时仍能高效剪接

接下来，我们研究了+1位置的外延蛋白残基，该残基也直接参与催化过程。我们之前已经证明，S+1C突变完全消除了剪接活性，尽管半胱氨酸侧链的亲核性更强[26]。在这里，我们准备了SBP-[W38]IntC-(S+1T)Trx-H6（8P(S+1T)），并惊讶地观察到与N端前体1P结合时仍能进行定量剪接，尽管剪接速率降低了三倍，为0.49 ± 0.05 × 10?3 s?1（t1/2 = 23.4 min）（见图4）。CL intein能够在+1位置含有Thr的情况下高效剪接，这代表了潜在连接序列的扩展。图4

2.4 其他位置的局部外延蛋白耐受性可以进一步提高CL切割intein的剪接效率

接下来，我们研究了CL intein对下一层残基（即N端和C端外延蛋白位置?2、?3、+2和+3）替代的耐受性。在每个前体中引入了这些位置的两个选定突变，分别是在MBP-IntN[D26]-H6（1P）和SBP-[W38]IntC-Trx-H6（8P）中保留的五个天然外延蛋白残基内（见图5a）。与结构预测一致，我们在37°C下进行6小时的PTS反应后没有观察到产物产量的显著影响，这突显了CL intein的高外延蛋白耐受性（见图5b）。在某些情况下，PTS速率略微降低了1.2?1.3倍。然而，在其他情况下，我们观察到PTS速率显著增加，1P(T?2A)突变体的剪接速率提高了五倍（见图5c）。通过将最快的N端前体1P(T?2A)与最快的C端前体8P(V+2R)结合，我们实现了9.7 ± 0.8 × 10?3 s?1的剪接速率（t1/2 = 72 s；见图5d,e），与天然外延蛋白背景相比剪接速率提高了6.5倍，与原始CL intein（D26/E34切割位点）相比提高了16倍。通过ESI-MS分析确认了所需剪接产物（SP）的形成（见图S7）。有趣的是，我们观察到外延蛋白突变对PTS反应过程中分支中间体（BI）的积累有显著影响（见图5d和S8）。

2.5 优化的CL intein允许快速且定量地半合成蛋白质

为了将优化的CL intein变体应用于具有完全合成片段的蛋白质的化学修饰，我们通过SPPS方法制备了合成IntN前体。前体肽Fl-IntN[D26]（11P；Fl = 5,6-羧基荧光素）包含了五个天然N端外延蛋白残基和一个合成荧光团，而11P(T?2A)具有加速的T?2A替代基团（见图6a）。合成肽的身份和纯度通过LC-MS分析得到确认（见图S9）。首先，将11P（40 μM）与C端前体SBP-[W38]IntC-Trx-H6（8P）（10 μM）孵育后，我们观察到荧光素定量转移到Trx外延蛋白上，这通过SDS-PAGE分析和荧光成像以及Coomassie染色得到验证（见图S10）。PTS反应迅速进行，剪接速率为4.2 ± 0.3 × 10?3 s?1（t1/2 = 2.7 min），甚至比相应的完全重组生产的切割intein快三倍（见上文）。使用合成肽作为N端前体时更快的PTS反应与之前对亲本CL intein的观察结果一致[26]，这可能是由于缺乏His6标签和较小的N端外延蛋白。然后，我们将11P(T?2A)与含有V+2R加速突变的SBP-[W38]IntC-Trx-H6（8P(V+2R)结合，观察到定量剪接，并且剪接速率进一步增加（14.5 ± 1.3 × 10?3 s?1；t1/2 = 48 s；见图6b,c）。预期的SP通过ESI-MS分析得到确认（见图S11）。值得注意的是，这表明半合成PTS反应的速率比原始CL intein快了九倍，突显了优化CL intein的超快反应动力学。图6：在图查看器或PowerPoint中打开

通过使用优化的CL intein进行半合成PTS对蛋白质的化学修饰。(a) 合成肽Fl-IntN[D26]的结构，其中包含T?2A替换（11P(T?2A)；Fl = 5,6-羧基荧光素），以及半合成PTS反应的示意图。注意，在合成序列中M15被替换为诺尔亮氨酸（Z = NorL）（另见图S9）。(b) 在37°C和pH 7的条件下，使用40 μM 11P(T?2A)和10 μM 8P(V?+?2R)进行PTS反应后的SDS-PAGE分析，随后进行荧光成像（下图）和考马斯亮蓝染色（上图）。该实验重复进行了两次。(c) 通过密度分析对剪接产物的形成进行时间分辨定量，数据拟合为一阶指数方程，并与使用前体11P和8P的PTS反应数据进行比较（见图S10）。计算出的分子量为：11P(T?2A)：3.7 kDa；8P(V?+?2R)：33.3 kDa；SP：15.0 kDa。BI = 分支中间体。SP = 剪接产物。Trx = 硫氧还蛋白。Ext = extein。对于(c)，n = 2次技术重复。数据以平均 ± 标准差表示，并根据相应蛋白质物种的分子量进行归一化。

2.6 典型分裂的CLm Intein表现出与CL Intein相似的extein依赖性

最后，我们测试了我们对CL intein的extein序列耐受性的理解是否可以扩展到CLm intein，其IntN和IntC片段分别为120和39个氨基酸[23, 28]。由于它们都来源于亲本Aes123 PolB1 intein的相同序列，我们假设CLm intein和人工分裂的CL intein会表现出相似的extein依赖性。我们重点关注CLm intein对?1替换的耐受性。我们选择了五个在CL intein中影响较小的替换（D?1H、D?1R、D?1E、D?1A、D?1S），三个影响中等的替换（D?1N、D?1W、D?1T），以及三个影响较大的替换（D?1L、D?1G、D?1I）。我们将这些替换引入N端前体MBP-CLmN-H6（12P）中，并将纯化的蛋白质变体与C端前体AesC-sfGFP（13P）以三倍摩尔过量混合（图7a）。

图7：在图查看器或PowerPoint中打开

典型分裂的CLm/Aes intein的extein依赖性。(a) PTS反应的示意图。(b–e) Asp?1替换对产物产率（b）、剪接速率（d）和N-切割水平（e）的影响，这些都在37°C和pH 7条件下通过密度分析SDS-PAGE确定，数据拟合为一阶指数方程（见图S12中的凝胶）。颜色代码代表侧链的物理化学性质：酸性（红色）、碱性（蓝色）、极性（绿色）、芳香性（橙色）和疏水性（灰色）。对于(b–e)，n = 2次技术重复。数据以平均 ± 标准差表示。与CL intein的观察结果一致，CLm前体12P(D?1H)、12P(D?1R)和12P(D?1A)的剪接速率仅受到轻微影响，t1/2分别为60秒、57秒和19秒，而CLm前体12P在天然D?1情况下的t1/2为16秒[23]。与CL intein的结果略有不同，D?1S突变对CLm intein的剪接速率影响更大，但前体12P(D?1S)仍然几乎完全剪接。前体12P(D?1L)、12P(D?1G)和12P(D?1I)几乎没有SP形成，因此受到突变的影响较大，这也与CL intein的观察结果一致。值得注意的是，这些是唯一在24小时后仍未达到定量剪接的CLm的?1替换[图7c和S12]。CL intein和CLm intein之间对?1侧链替换的依赖性相关性通过非参数Spearman相关系数ρ = 0.87（p = 0.00042）得到了显著证明。此外，CLm intein还表现出?1侧链对N-切割副产物形成水平的轻微增加，这与CL intein的观察结果一致（图7e），进一步强调了CLm intein和CL intein之间的相似性。CLm intein的超快动力学和高活性还体现在即使前体12P(D?1T)在?1位置含有一个难以处理的β-分支氨基酸，其剪接半衰期仍为13分钟，这对于通过PTS修饰纯化蛋白质是可接受的。我们还测试了带有我们发现的优化extein上下文的T?2A和V?+?2R替换的CLm intein。我们观察到高效的超快PTS反应，剪接速率提高了约三倍（t1/2 = 6.4秒；图S13），与CLm intein在其每个extein侧带有天然5个残基时的速率（t1/2 = 16.3秒）相比。然而，当使用SBP作为替代C-extein时，没有观察到这种速率提升（t1/2 = 15.4秒；图S13）。因此，extein工程并没有显著提高CLm intein的速率。有趣的是，与CL intein中的extein突变效应类似，我们观察到分支中间体（BI）的显著积累，表明BI的形成动力学加速，而琥珀酰亚胺的形成仍然是剪接机制中的限速步骤（图S13和参考文献[23]）。

3 结论

我们在这里报告了优化的CL intein，这是第一个具有超快反应动力学（t1/2 = 48秒至72秒）和几乎定量产率的半合成且不含半胱氨酸的分裂intein。值得注意的是，由于该分裂intein不含半胱氨酸，半合成标记反应在几分钟内几乎完成，并且可以在没有还原剂的情况下进行。通过使用化学合成的IntN前体，将合成荧光团和仅5个氨基酸的标签转移到目标蛋白质上，我们展示了优化后的CL intein在蛋白质半合成中的潜力。其他超快分裂intein包括典型分裂的Npu DnaE intein（t1/2 = 63秒，37°C）[20, 34]、CLm intein（t1/2 = 16秒，37°C）[23]、Gp41-1、Nrd-J和Gp41-8 inteins（t1/2分别为5秒、7秒和15秒，37°C）[21]以及非典型分裂的VidaL intein（t1/2 ≈ 1分钟，37°C）[33, 45]。然而，除了CLm intein之外，所有这些intein都依赖于半胱氨酸，只有VidaL intein具有较短的IntN片段。因此，超快的CL intein应该是一个独特且有价值的蛋白质标记工具箱添加。鉴于缺乏一种天然分裂的、快速的、高效的、不含半胱氨酸且片段长度适合SPPS（≤约25个氨基酸）方便化学合成的intein，我们重新研究了之前报道的CL intein。这种人工分裂的intein是通过将天然Aes123 PolB1 intein的分裂位点移近N端获得的[26]。我们发现，进一步截短CL IntC前体可以提高剪接速率。然后我们发现，extein残基在?2和+2位置的改变进一步增强了剪接速率。这两种效应都是累加的，并且在完全重组的分裂intein前体以及IntN前体为合成肽的半合成设置中都观察到了。当两者结合使用时，我们可以证明优化后的CL intein的剪接速度比之前报道的CL intein快九倍（半合成反应设置中t1/2 = 48秒对比t1/2 = 10分钟），甚至在含有C端His6标签的重组产生的IntN前体中快16倍（t1/2 = 72秒对比t1/2 = 20分钟）。这些速率的提高表明，人工分裂的CL intein接近于更快CLm intein的速率（t1/2 = 16秒）。CLm intein保留了天然的分裂位点，即HEN位点（也称为S0位点，图2b），这是共同亲本Aes123 PolB1 intein在进化过程中优化的位点。显然，CL intein变体的人工分裂位点是导致整体PTS速率较慢的原因，因为它们的人工短IntN和长IntC前体无法通过天然IntN和IntC片段中的电荷簇驱动的捕获-折叠组装机制进行结合[23, 46, 47]。这一假设还得到了CLN和CLC前体亲和力较低的支持（KD = 1.7 μM对比12 nM[23, 26]）。那么，为什么这里报道的优化extein上下文能够将CL intein的PTS速率提高六倍，远超过其他系统研究中的extein优化[40, 43]呢？理解分子水平变化的一个关键指标是我们在CL和CLm intein中观察到的分支中间体（BI）的显著更快积累，这与extein突变T?2A和V?+?2R有关（图5d、S7和S12），而从BI到SP的转化速率保持不变（涉及intein的G/C1天冬酰胺侧链的环化作为决定速率的步骤[23, 48]。这些发现表明，在初始结合之后，extein优化的CL intein更快地经历了蛋白质剪接机制的最初步骤，从而将CLN前体从初始结合平衡中移除。结果是CLN和CLC前体的解离减少，曾经结合的CLN和CLC前体更有可能向SP进展，有效地转化为更高的剪接速率。然而，CLm intein中BI形成的类似速率增加并没有转化为整体更高的PTS速率，可能是因为初始前体结合平衡已经非常有利于结合复合物，因此在蛋白质剪接的最初步骤中CLmN前体的快速移除并没有带来额外的好处。未来的更详细生物物理表征将通过确定组装过程的速率来验证这一解释。总的来说，这些结果代表了PTS速率的显著优化，特别是关于extein优化的效果。在剪接途径中观察到的BI积累变化以及个别步骤的协调性和速率的重要性[-]，以及优化它们的微调以实现更高整体速率的潜力[51]。intein介导的连接的一个限制是依赖于紧邻的extein残基。我们观察到在?2/?3和+2/+3位置的替换具有很高的耐受性，表明在这里以及更远位置的替换通常也是可以接受的。因此，连接接头处的残基序列疤痕长度可能限制在4-6个氨基酸，这个长度与广泛使用的转肽酶连接工具生成的疤痕相当[7]。然而，在这4-6个氨基酸范围内，许多偏离最佳序列的情况仍然会导致令人满意的剪接性能，包括将催化Ser?+?1替换为Thr?+?1。作为不合适的?1位置氨基酸侧链，我们识别出了Gly、Ile、Leu和Pro。这里报告的CL intein的最高剪接速率是以至少限制在4个残基AD?SR的连接疤痕为代价的。然而，在许多蛋白质标记应用中，当一个短的连接器是可接受的或甚至是期望的[29]时，这样的序列限制并不成问题。同样，我们对CLm intein的extein依赖性的理解也将有助于规划使用这种超活性不含半胱氨酸的分裂intein变体的反应[23]。报道的分裂CL intein具有由26个氨基酸组成的短IntN片段，可以通过SPPS方便地进行化学合成；这是蛋白质半合成的前提条件。进一步的截短导致活性丧失。值得注意的是，其他具有短IntN片段的良好剪接分裂intein也已知并已用于半合成PTS，例如依赖半胱氨酸的天然分裂Acel TerL（25个氨基酸）[31]、TerL CAT（30个氨基酸）[52]、VidaL（16个氨基酸）[33, 45]和人工分裂的M86 inteins（11个氨基酸）[38]。然而，我们的重点是建立一个完全不含半胱氨酸的半合成分裂intein工具，因此它对氧化条件具有抵抗力，并且与其extein序列兼容。唯一一个不含半胱氨酸的分裂intein是天然分裂的PolB16 OarG intein（15个氨基酸），但由于其反应速率慢、剪接效率低以及C端切割副反应倾向高，其实用性有限[27]。将无半胱氨酸的分裂intein的IntN片段长度进一步缩短至约15个氨基酸，将有助于进一步简化N端前体肽的化学合成。然而，目前尚不清楚哪些intein能够容忍如此靠近N端的切割位置，以及在这种情况下PTS（蛋白质剪接系统）的效率和速度如何。未来的研究可以致力于鉴定或改造无半胱氨酸的分裂intein，以实现具有更短N端或C端片段的蛋白质半合成。通过突变理性工程和intein序列的定向进化，其他分裂intein的剪接速率和extein耐受性也得到了成功提高[31, 38, 41]，这为本研究提供了另一种未探索的途径。在此期间，本文报道的优化CL分裂intein应能为不依赖半胱氨酸的蛋白质化学标记和半合成提供一个强大的工具。

作者贡献：
Christoph Humberg：概念化（同等贡献），数据整理（主导），形式分析（主导），研究（主导），撰写原始草稿（同等贡献），撰写审稿和编辑（同等贡献）。
Tobias M. E. Terhorst：形式分析（协助），研究（协助）。
Tim Pasch：形式分析（协助），研究（协助）。
Henning D. Mootz：概念化（同等贡献），形式分析（协助），资金获取（主导），项目管理（主导），监督（主导），撰写原始草稿（同等贡献），撰写审稿和编辑（同等贡献）。

支持信息：
额外的支持信息可在支持信息部分在线找到。
支持图S1：Intein蛋白质剪接机制。分裂inteins的一般蛋白质剪接机制（X = S, O；R = H, CH3）。需要注意的是，无半胱氨酸的intein利用Ser1和Ser+1（Thr+1）残基在两个剪接位点形成线性和分支酯中间体。最初，N?S/O酰基转移将N-extein转移到intein的第一个位置的Cys或Ser残基上，形成线性（硫）酯中间体。在随后的转（硫）酯化步骤中，C-extein第一个位置（相对于intein编号为+1）的Cys、Ser或Thr侧链攻击线性中间体，形成分支（硫）酯中间体。然后通过intein的最后一个残基——保守的C端天冬酰胺的环化，切断intein和C-extein之间的键，释放出作为C端琥珀酰亚胺的intein。最后，+1位置的α-氨基引发自发的S/O?N酰基转移，形成exteins之间的天然肽键。

作者贡献：
Christoph Humberg：概念化（同等贡献），数据整理（主导），形式分析（主导），研究（主导），撰写原始草稿（同等贡献），撰写审稿和编辑（同等贡献）。
Tobias M. E. Terhorst：形式分析（协助），研究（协助）。
Tim Pasch：形式分析（协助），研究（协助）。
Henning D. Mootz：概念化（同等贡献），形式分析（协助），资金获取（主导），项目管理（主导），监督（主导），撰写原始草稿（同等贡献），撰写审稿和编辑（同等贡献）。

支持信息：
额外的支持信息可在支持信息部分在线找到。
支持图S1：Intein蛋白质剪接机制。分裂inteins的一般蛋白质剪接机制（X = S, O；R = H, CH3）。需要注意的是，无半胱氨酸的intein利用Ser1和Ser+1（Thr+1）残基在两个剪接位点形成线性和分支酯中间体。最初，N?S/O酰基转移将N-extein转移到intein的第一个位置的Cys或Ser残基上，形成线性（硫）酯中间体。在随后的转（硫）酯化步骤中，C-extein第一个位置（相对于intein编号为+1）的Cys、Ser或Thr侧链攻击线性中间体，形成分支（硫）酯中间体。然后通过intein的最后一个残基——保守的C端天冬酰胺的环化，切断intein和C-extein之间的键，释放出作为C端琥珀酰亚胺的intein。最后，释放的α-氨基引发自发的S/O?N酰基转移，形成exteins之间的天然肽键。
支持图S2：IntN缩短对人工分裂CL intein剪接效率的影响。(a) PTS反应示意图。(b-f) 使用N端前体（b) MBP IntN[D26]-H6 (1P), (c) MBP-IntN[T24]-H6 (3P), (d) MBP-IntN[D22]-H6 (4P), (e) MBP-IntN[F20]-H6 (5P), (f) MBP IntN[S11]-H6 (6P) 与C端前体SBP-[E34]IntC-Trx-H6 (2P) 在等摩尔浓度下，于37°C条件下进行的SDS-PAGE分析。结果显示为Coomassie染色的凝胶。这些实验重复进行了两次。(g) 基于密度计分析的PTS反应时间进程。BI = 分支中间体；MBP = 麦芽糖结合蛋白；SBP = 链霉亲和素结合肽；SP = 剪接产物；Trx = 还原型氧化还原蛋白。对于(g)，n = 2?3次技术重复。数据以平均值±标准差表示，并根据相应蛋白质的分子量进行归一化。
支持图S3：新的切割位点缺失对人工分裂CL intein剪接效率的影响。(a) PTS反应示意图。(b–e) 使用N端前体MBP-IntN[D26]-H6 (1P) 与C端前体(b) SBP-[V27]IntC-Trx-H6 (7P), (c) SBP-[E34]IntC-Trx-H6 (2P), (d) SBP-[W38]IntC-Trx-H6 (8P), (e) SBP-[G43]IntC-Trx-H6 (9P)（其中一种前体以三倍摩尔过量）在37°C条件下进行的SDS-PAGE分析。结果显示为Coomassie染色的凝胶。这些实验重复进行了两次或三次。(g) 通过密度计分析对剪接产物形成的时间分辨定量，并将数据拟合到单相指数方程。BI = 分支中间体；MBP = 麦芽糖结合蛋白；SBP = 链霉亲和素结合肽；SP = 剪接产物；Trx = 还原型氧化还原蛋白。对于(f)，n = 2?3次技术重复。数据以平均值±标准差表示，并根据相应蛋白质的分子量进行归一化。
支持图S4：S11/G12切割位点的效率。(a) PTS反应示意图。(b,c) 使用N端前体MBP-IntN[S11]-H6 (6P) 与C端前体SBP-[G12]IntC-Trx-H6 (10P)（其中一种前体以三倍或四倍摩尔过量）在37°C条件下进行的SDS-PAGE分析。结果显示为Coomassie染色的凝胶。(c) 实验重复进行了三次。(d) 通过密度计分析在24小时后对剪接产物形成的定量。MBP = 麦芽糖结合蛋白；SBP = 链霉亲和素结合肽；SP = 剪接产物；Trx = 还原型氧化还原蛋白。
支持图S5：对前体MBP-IntN[D26]-H6 (1P)引入的D?1X替代基的分析（图2的附加数据）。使用引入N端前体1P的D?1X替代基和C端前体SBP-[W38]IntC-Trx-H6 (8P)（以三倍摩尔过量）在37°C条件下进行的Coomassie染色SDS-PAGE分析。这些实验重复进行了两次。BI = 分支中间体；SP = 剪接产物。
支持图S6：对N端前体MBP-IntN[D26]-H6 (1P)的?2、?3、+2和+3位置侧链替代基的分析（图4的附加数据）。使用引入N端前体MBP-IntN[D26]-H6 (1P)或C端前体SBP-[W38]IntC-Trx-H6 (8P)的替代基进行的Coomassie染色SDS-PAGE分析。C端前体以三倍摩尔过量使用。这些实验重复进行了两次。BI = 分支中间体；SP = 剪接产物。
支持图S7：使用1P(T?2A)和8P(V+2R)进行的PTS反应的LC-MS分析。图5d,e中PTS反应的附加数据。(a) 在C3柱（ZORBAX StableBond 300 C3, 4: 6 x 12:5 mm, 5 μm, Agilent）上使用1P(T?2A) (5 μM)和8P(V+2R) (15 μM)在37°C条件下进行的总PTS反应的RP-HPLC分析。显示了PTS前（黑色）和PTS诱导后1小时（绿色）的UV色谱图。(b) HPLC分离后（7.0–10.0分钟）的ESI-MS分析的去卷积质量。(SP = 剪接产物)。
支持图S8：CL intein中T?2A/V+2R双extein突变的分析。(a) PTS反应示意图。(b) 使用N端前体1P和C端前体8P（以三倍摩尔过量）在37°C条件下进行的PTS反应的SDS-PAGE分析。该实验重复进行了两次。显示了一个示例性的Coomassie染色凝胶。(c) 通过密度计分析对剪接产物（SP）和分支中间体（BI）形成的时间分辨定量，并将数据拟合到简化的三态动力学模型。(d) 通过密度计分析对剪接产物（SP）和分支中间体（BI）形成的时间分辨定量，并将数据拟合到简化的三态动力学模型（见方法部分）。BI = 分支中间体；MBP = 麦芽糖结合蛋白；SBP = 链霉亲和素结合肽；SP = 剪接产物；Trx = 还原型氧化还原蛋白。对于(c,d)，n = 2次技术重复。数据以平均值±标准差表示，并根据相应蛋白质的分子量进行归一化。
支持图S9：合成肽11P和11P(T?2A)的LC-MS分析。(a) 纯化合成肽11P的ESI-MS分析，其分子量分别为M(obs.) 3735.25 Da和M(calc.) 3736.69 Da。(b) 纯化合成肽11P(T?2A)的ESI-MS分析，其分子量分别为M(obs.) 3706.18 Da和M(calc.) 3706.67 Da。(c/d) 在280 nm处监测的纯化合成肽11P (c)和11P(T?2A) (d)的RP-HPLC分析。
支持图S10：使用优化的CL intein进行半合成PTS的蛋白质化学修饰（图6的附加数据。(a) 荧光标记合成肽Fl-IntN[D26] (11P)的序列及半合成PTS反应示意图，其中M15被替换为诺尔-亮氨酸（Z = NorL）。(b/c) 使用40 μM 11P和10 μM 8P在37°C条件下进行的PTS反应后的SDS-PAGE分析及Coomassie染色(b)和荧光成像(c)。(d) 该实验重复进行了两次。BI = 分支中间体；SP = 剪接产物；Trx = 还原型氧化还原蛋白；Ext = extein。
支持图S11：使用合成肽11P和11P(T?2A)进行的PTS反应的剪接产物的LC-MS分析。图6和图S8中PTS反应的附加数据。(a) 在37 °C条件下使用11P (40 μM)和8P (10 μM)生成的剪接产物（SP）的MS谱。(b) 在37 °C条件下使用11P(T?2A) (40 μM)和8P(R+2V) (10 μM)生成的剪接产物（SP）的MS谱。(c/d) 图(a)和(b)中ESI-MS分析的去卷积质量。
支持图S12：对前体MBP-CLmN-H6 (12P)引入的D?1X替代基的分析（图6的附加数据)。显示了使用N端前体12P和C端前体AesC-sfGFP (13P)（以三倍摩尔过量）在37°C条件下进行的PTS反应的示例性Coomassie染色SDS-PAGE凝胶。该实验重复进行了两次。
支持图S13：CLm intein中T?2A/V+2R双extein突变的分析。(a) PTS反应示意图。(b) 使用N端前体12P(T?2A)和C端前体13P(V+2R)（以三倍摩尔过量）在37°C条件下进行的PTS反应的SDS-PAGE分析。显示了一个示例性的Coomassie染色凝胶。(c) 通过密度计分析对剪接产物（SP）和分支中间体（BI）形成的时间分辨定量，并将数据拟合到简化的三态动力学模型（见方法部分）。(d) PTS反应示意图。(e) 使用N端前体12P(T?2A)和C端前体14P(V+2R)（以三倍摩尔过量）在37°C条件下进行的PTS反应的SDS-PAGE分析。显示了一个示例性的Coomassie染色凝胶。(f) 通过密度计分析对剪接产物（SP）和分支中间体（BI）形成的时间分辨定量，并将数据拟合到简化的三态动力学模型。MBP = 麦芽糖结合蛋白；SBP = 链霉亲和素结合肽。对于(c, f)，n = 2次技术重复。数据以平均值±标准差表示，并根据相应蛋白质的分子量进行归一化。
支持图S14：正文中所示图形的未处理SDS-PAGE图像。黑色框表示用于图(a) Figure 2e, (b) Figure 4b, (c) Figure 5d, (d) Figure 6b（上部分），(e) Figure 6b（下部分）的图段。使用PageRuler未染色蛋白梯子（Thermo Scientific #26614）或PageRuler预染色蛋白梯子（Thermo Scientific #26616）作为标记。
支持图S15：补充信息中所示图形的未处理SDS-PAGE图像。黑色框表示用于图(a) Figure S2b, (b) Figure S2c, (c) Figure S2d, (d) Figure S2e, (e) Figure S2f, (f) Figure S3b, (g) Figure S3c, (h) Figure S3d, (i) Figure S3e, (j) Figure S7b, (k) Figure S9b, (l) Figure S9c, (m) Figure S12b的图段。使用PageRuler未染色蛋白梯子（Thermo Scientific #26614）或PageRuler预染色蛋白梯子（Thermo Scientific #26616）作为标记。
支持表S1：纯化重组蛋白构建体及其表达质粒的列表。
支持表2：重组生产蛋白的序列列表。

致谢：
作者感谢Simon Hoffmann在数据获取方面的支持。开放获取资金由Projekt DEAL提供和组织。

资助：
本研究得到了德国研究基金会（DFG）（Grant MO1073/9-1）的支持。

利益冲突：
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明：
支持本研究发现的数据可向相应作者索取，如有合理请求即可提供。