基于4D-DIA蛋白质组学技术的糖尿病足溃疡湿热证患者生物标志物分析

《Journal of Diabetes Research》：Analysis of Biomarkers in Diabetic Foot Ulcer Patients With Dampness–Heat Syndrome Based on 4D-DIA Proteomics Technology

　　

背景：糖尿病足溃疡（Diabetic Foot Ulcer, DFU）是糖尿病严重并发症，湿热证（Dampness–Heat Syndrome, DHS）是DFU常见中医证型，与疗效及预后密切相关，但其分子生物标志物尚不明确。方法：采用4D数据非依赖采集（4D-Data-Independent Acquisition, 4D-DIA）血清蛋白质组学检测16例DFU–DHS患者与6例健康对照（Healthy Control, HC）血清，以|fold change (FC)|＞1.2且p＜0.05筛选差异表达蛋白（Differentially Expressed Proteins, DEPs），进行基因本体（Gene Ontology, GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集及蛋白互作（Protein–Protein Interaction, PPI）网络分析，并以酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）在28例独立DFU–DHS队列中验证关键生物标志物。结果：研究人员共鉴定201个DEPs，主要富集于脂质代谢（高密度脂蛋白[High-Density Lipoprotein, HDL]重塑及胆固醇代谢）与补体–凝血级联反应通路；PPI网络揭示以载脂蛋白A1（Apolipoprotein A1, APOA1）、卵磷脂–胆固醇酰基转移酶（Lecithin–Cholesterol Acyltransferase, LCAT）、磷脂转移蛋白（Phospholipid Transfer Protein, PLTP）及胆固醇酯转移蛋白（Cholesteryl Ester Transfer Protein, CETP）为核心的功能模块；ELISA验证四者在独立DFU–DHS队列中显著失调（均p＜0.05 vs. HC），联合诊断受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）达0.9672。结论：本研究首次将4D-DIA蛋白质组学应用于DFU–DHS，鉴定APOA1、LCAT、PLTP及CETP为DFU–DHS相关胆固醇代谢失调的血清生物标志物，具潜在诊断价值，为中医辨证分型与精准医学结合提供依据。

论文解读：基于4D-DIA蛋白质组学技术的糖尿病足溃疡湿热证患者生物标志物分析

该研究发表于《Journal of Diabetes Research》。糖尿病足溃疡（Diabetic Foot Ulcer, DFU）是糖尿病严重慢性并发症，致残致死率高，经济负担重。湿热证（Dampness–Heat Syndrome, DHS）是DFU常见中医证型，临床表现为患肢红、肿、热、痛、渗液，与慢性炎症、代谢紊乱及预后密切相关，但DFU–DHS的分子机制尤其是血清蛋白质组特征尚未阐明，缺乏客观化辨证分子指标。为此，研究人员采用4D数据非依赖采集（4D-Data-Independent Acquisition, 4D-DIA）定量蛋白质组学技术，探讨DFU–DHS患者血清蛋白表达谱变化，筛选并验证特异性生物标志物，以期为中医证型客观化及精准诊疗提供依据。研究人员发现DFU–DHS患者存在以高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein, HDL）重塑及胆固醇代谢异常为核心的系统性脂质代谢紊乱，鉴定并验证了APOA1、LCAT、PLTP和CETP组成的生物标志物组合对DFU–DHS具高诊断效能，为中西医结合DFU分层管理提供分子依据。

为开展本研究，研究人员主要使用了以下关键技术方法：采用病例–对照设计，发现队列纳入16例DFU–DHS患者与6例健康对照（HC），验证队列纳入28例独立DFU–DHS患者与匹配HC；采集空腹外周血分离血清，经白蛋白/IgG去除后胰酶解肽段，使用Bruker timsTOF与nanoElute UHPLC系统进行4D-DIA质谱（Mass Spectrometry, MS）数据采集，以数据依赖采集（Data-Dependent Acquisition, DDA）建库，Spectronaut Pulsar比对UniProt人数据库进行蛋白鉴定与无标记定量（Label-Free Quantification, LFQ）；以|log₂FC|≥0.263及校正后p＜0.05筛选差异表达蛋白（Differentially Expressed Proteins, DEPs）；利用R语言clusterProfiler行GO（Gene Ontology）与KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析；STRING数据库构建蛋白互作（Protein–Protein Interaction, PPI）网络，Cytoscape MCODE插件识别核心模块；独立队列以酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）定量靶蛋白，SPSS行统计学及受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线分析。

3.1. Overview of Proteomic Profiling

研究人员对22份血清（16例DFU–DHS、6例HC）进行4D-DIA蛋白质组检测，主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）显示两组蛋白谱明显分离，第一主成分解释22.7%总方差，提示DFU–DHS具独特血清蛋白质组特征。

3.2. Differentially Expressed Proteins (DEPs) Between Diabetic Foot Patients With DHS and HCs

以|log₂FC|≥0.263且p＜0.05为标准，研究人员共鉴定201个DEPs（53个上调、148个下调），包括急性期反应物血清淀粉样蛋白A1/A2（Serum Amyloid A1/A2, SAA1/SAA2）、C反应蛋白（C-Reactive Protein, CRP）、纤维蛋白原样蛋白1（Fibrinogen Like 1, FGL1）、S100钙结合蛋白A8（S100 Calcium Binding Protein A8, S100A8）显著上调，多泡体亚基12B（Multivesicular Body Subunit 12B, MVB12B）等下调，提示DFU–DHS伴明显全身炎症与脂质紊乱。

3.3. Functional Enrichment Analyses of DEPs

GO分析显示DEPs显著富集于HDL颗粒重塑（HDL Particle Remodeling）、胆固醇逆转运（Reverse Cholesterol Transport, RCT）及急性期反应等生物学过程；KEGG分析富集于补体与凝血级联（Complement and Coagulation Cascades）、胆固醇代谢（Cholesterol Metabolism）、细胞外基质–受体相互作用等通路；热图显示APOA1、LCAT、CETP、PLTP等HDL重塑相关蛋白在DFU–DHS组中显著失调。

3.4. Research on the Metabolic Pathways of DEPs

研究人员指出DFU–DHS核心病机"脾虚湿蕴化热"对应胰岛素抵抗及HDL代谢障碍；框图示意正常状态下APOA1、LCAT、CETP、PLTP参与HDL成熟与RCT并具抗炎作用，而DFU–DHS中上述蛋白下调致HDL功能不良、SAA掺入置换APOA1，丧失抗炎及胆固醇外流能力，促进伤口微环境慢性炎症与血脂异常。

3.5. PPI Network Analysis of DEPs

STRING–Cytoscape构建含193节点、1777边的PPI网络，MCODE识别核心模块（39节点、511边、评分26.895），中心节点为APOA1、LCAT、PLTP、CETP，表明此四种HDL相关蛋白在DFU–DHS蛋白互作网络中形成紧密共表达/互作核心。

3.6. ELISAs Validate the Increase of APOA1, LCAT, PLTP, and CETP in DFU Patients With DHS Serum and Their Ability to Predict Disease Severity

独立队列（28例DFU–DHS、20例HC）ELISA验证：APOA1、LCAT、CETP在DFU–DHS中显著低于HC（p＜0.05），PLTP亦呈显著差异；单体ROC?AUC分别为APOA1 0.7964、LCAT 0.7321、CETP 0.8143、PLTP 0.8875；四项联合诊断AUC达0.9679，灵敏度92.86%、特异度100%，Youden指数0.9286，提示联合标志物对DFU–DHS具优异判别效能。

3.7. Correlations Between the Serum Levels of Target Proteins and Clinical Indexes in Diabetic Foot Patients With DHS

Pearson相关分析显示：APOA1与血沉（Erythrocyte Sedimentation Rate, ESR）、甘油三酯（Triglyceride, TG）、总胆固醇（Total Cholesterol, TC）负相关（r＝?0.65, p＝0.001）；LCAT与ESR、TC负相关，与HDL?C正相关（r＝0.57, p＜0.001）；CETP与HDL?C正相关（r＝0.56, p＜0.001）；PLTP与糖化血红蛋白（Glycated Hemoglobin A1c, HbA1c）、TG正相关，提示靶蛋白水平可反映DFU–DHS炎症状态及代谢失调程度。

讨论部分指出，既往DFU–DHS研究多关注局部氧化应激与炎症，难以反映全身代谢特征；本研究从血清4D-DIA蛋白质组层面证实DFU–DHS存在以HDL重塑与胆固醇代谢异常为核心的脂质代谢紊乱，与中医"湿热—脂毒—炎症"循环病机相契合。APOA1介导抗炎与RCT、LCAT催化游离胆固醇酯化影响HDL成熟度与抗氧化性、PLTP反映胰岛素敏感性与代谢控制、CETP标示脂蛋白间胆固醇/甘油三酯交换异常，四者联合弥补传统炎症指标无法区分中医证型的不足，为DFU–DHS早期识别与个体化干预提供潜在分子靶标。研究局限包括样本量偏小、未设非DHS型DFU对照、未完全控制混杂偏倚及缺乏细胞实验验证。

结论（翻译）：糖尿病足溃疡合并湿热证是以便秘红肿热痛渗液性溃疡、感染风险高及全身代谢失调为特征的常见病型。本研究首次应用4D?DIA蛋白质组学分析DFU–DHS患者血清蛋白质组，鉴定患者与健康对照间201个差异表达蛋白，生物信息学分析提示脂质代谢特别是高密度脂蛋白重塑、胆固醇逆转运及补体–凝血级联反应显著紊乱。研究人员聚焦并验证载脂蛋白A1（APOA1）、卵磷脂–胆固醇酰基转移酶（LCAT）、磷脂转移蛋白（PLTP）及胆固醇酯转移蛋白（CETP）这一胆固醇代谢核心四蛋白组合，其联合诊断效能优良，显示其对DFU患者湿热证客观分层的良好潜力。