环保型蚊虫控制方法：评估Dorema aucheri提取物对疟疾传播媒介Anopheles stephensi的杀幼虫和驱蚊效果

《Parasite Epidemiology and Control》：Eco-friendly mosquito control: Assessing the larvicidal and repellent effects of Dorema aucheri extract on Anopheles stephensi, the malaria vector

　　阿明·侯赛因普尔（Amin Hosseinpour）| 莫扎法尔·瓦赫迪（Mozaffar Vahedi）| 阿扎德·哈米迪（Azadeh Hamedi）| 尼卢法尔·索尔塔尼安（Niloofar Soltanian）| 法尔纳兹·卡泽米（Farnaz Kazemi）| 埃尔哈姆·雷扎伊（Elham Rezaee）| 阿布扎尔·索尔塔尼（Aboozar Soltani）
伊朗设拉子医科大学健康学院医学昆虫学与媒介控制系

**摘要**
蚊媒疾病，尤其是疟疾，仍然是一个重大的全球健康挑战，其中斯氏按蚊（Anopheles stephensi）是中东和南亚地区的主要传播媒介。合成杀虫剂抗性的增加及其对环境和健康的不良影响加剧了人们对有效植物替代品的探索。本研究旨在评估原产于伊朗的药用植物Dorema aucheri对斯氏按蚊的杀幼虫和驱虫效果。根据世界卫生组织（WHO）的杀幼虫生物测定指南，分别测试了D. aucheri绿色和白色部分的水醇提取物在不同浓度下的效果，而驱虫效果则使用Klun & Debboun（K&D）方法进行评估。通过Probit分析确定了LC??、LC??、ED??和ED??值。结果显示，这些提取物具有剂量依赖性的杀幼虫活性，在400 mg/L浓度下可达到98%的死亡率，其中绿色部分的LC??为98.54 mg/L，白色部分为104.72 mg/L。在驱虫方面，两种植物部分均表现出显著效果，绿色部分在0.5 mg/cm2浓度下可达到90%的驱虫率，白色部分在同一浓度下为85%。5%剂量下的完全保护时间为绿色部分64分钟，白色部分为52分钟。这些发现表明D. aucheri作为一种环保型杀虫剂和驱虫剂具有巨大潜力，使其成为综合蚊虫控制计划中的有希望的候选者。建议进一步研究其配方和现场验证，以最大化其实际应用价值。

**1. 引言**
媒介传播疾病是全球最严重的公共卫生问题之一，对热带和亚热带地区的影响尤为严重。根据最近的全球流行病学预测，由于气候变化、城市化、人类流动和杀虫剂抗性的增加，媒介传播的寄生虫疾病继续在地理上扩散，疟疾仍然是导致发病率和死亡率的主要原因（Wang等人，2025年）。在疟疾媒介中，斯氏按蚊因其分布范围超出传统区域（扩展到非洲之角部分地区）而受到越来越多的关注，这对疟疾控制计划构成了严重威胁（Abebe等人，2025年）。
疟疾在伊朗的几个南部省份仍然流行，多种按蚊物种参与了疾病传播。斯氏按蚊被认为是该地区的主要城市疟疾媒介之一，因为它具有生态适应性和在人工水体中繁殖的能力。这种媒介的持续存在使得消除工作变得复杂，突显了需要创新和可持续的控制策略。
几十年来，疟疾控制计划主要依赖化学杀虫剂，特别是拟除虫菊酯、有机磷类和有机氯类化合物。这些化合物广泛用于室内滞留喷洒（IRS）和杀虫剂处理蚊帐（ITNs）。然而，合成杀虫剂的广泛和长期使用导致蚊虫种群产生了广泛的抗性。最近的监测数据显示，几种按蚊物种的抗性突变显著增加，大大降低了传统控制工具的有效性（Sengul Demirak和Canpolat，2022年）。除了抗性的发展外，合成杀虫剂还引发了关于环境持久性、对非目标生物的毒性、生物积累以及潜在的人类健康影响的担忧。
在这种背景下，植物源杀虫剂作为综合媒介管理（IVM）框架中的有希望的替代品或补充工具重新受到重视。植物衍生化合物通常可生物降解，具有多种作用机制，并含有复杂的生物活性次生代谢物混合物，从而降低了抗性发展的可能性（Isman，2006年；Nerio等人，2010年）。过去十年中，越来越多的研究关注评估精油和植物提取物对蚊虫媒介的杀幼虫、杀成虫和驱虫特性。
最近的研究表明，属于唇形科（Lamiaceae）、桃金娘科（Myrtaceae）、菊科（Asteraceae）和伞形科（Apiaceae）的植物物种具有显著的蚊虫控制潜力。例如，来自Syzygium aromaticum、Cinnamomum cassia、Melaleuca cajuputi和Cymbopogon citratus的精油对斯氏按蚊表现出显著的杀幼虫活性，其LC??值处于操作相关范围内（Osanloo等人，2018年；Vivekanandhan等人，2024a；Vivekanandhan，2025a）。此外，几种植物提取物在实验室条件下显示出与合成标准相当的强剂量依赖性驱虫效果（Moemenbellah-Fard等人，2020年；Asadollahi等人，2019年）。
特别是伞形科植物，因其产生的生物活性次生代谢物（如香豆素、萜类和酚类化合物）而受到认可，其中许多具有杀虫或驱虫特性（Sonigra和Meena，2020年）。在该科中，Dorema属植物在伊朗传统医学中具有药用价值。D. aucheri在当地被称为“Bilahar”，原产于伊朗的山区，富含树脂和芳香化合物。尽管其具有民族植物学意义，但关于其对疟疾媒介的杀虫或驱虫活性的科学数据仍然很少。
迄今为止，还没有全面评估D. aucheri的水醇提取物对斯氏按蚊的杀幼虫和成虫驱虫活性的研究。鉴于杀虫剂抗性的上升和对环境可持续媒介控制工具的迫切需求，填补这一知识空白尤为重要。
因此，本研究旨在根据WHO指南，在实验室条件下评估D. aucheri绿色和白色部分的水醇提取物对斯氏按蚊第四龄幼虫的杀幼虫效果。此外，还使用标准化的Klun & Debboun（K&D）和臂笼法（Arm-in-Cage）方法评估了这些提取物的驱虫效果和完全保护时间（CPT）。通过生成毒理学和驱虫数据，本研究旨在确定D. aucheri是否可以作为综合疟疾媒介管理计划中基于植物的生物杀虫剂的候选者。

**2. 材料与方法**
**2.1. 植物采集与保存**
2020年春季，从伊朗Kohgiluyeh和Boyer-Ahmad省的Dena山（30°41′10.6″N, 51°41′19.9″E）山坡采集了D. aucheri的地上部分（当地称为Bilahar）。由设拉子医科大学药理学系的分类学家根据形态特征和区域植物志关键进行植物鉴定。鉴定后的标本被存放在设拉子医科大学药学院的标本馆中（标本编号：DA-2020-01）。植物鉴定遵循药用植物研究的标准分类验证程序（Organization, W.H., 2003）。绿色和白色地上部分手动分离后切碎，并在室温（25 ± 2°C）下阴干7-10天，以防止热不稳定成分的降解（图1）。干燥后的材料用电动研磨机磨成细粉，并储存在密封容器中直至提取（见图2、图3）。

**2.2. 水醇提取物的提取**
提取过程采用常用的植物化学研究浸渍法（Harborne, 1998）。每种植物部分（绿色和白色）的50克粉末分别浸泡在350毫升70%乙醇（分析级）中，室温下浸泡72小时，并间歇搅拌以促进溶剂渗透。溶剂与植物的比例（7:1，v/w）基于水醇制剂的标准提取实践选择。浸渍后，混合物通过Whatman No. 1滤纸过滤以去除植物残渣。滤液在40°C下使用旋转蒸发器减压浓缩，以防止生物活性成分的热降解。半固态提取物进一步在真空下干燥，并储存在-20°C下直至使用。提取和浓缩过程的示意图见补充图S1。

**2.3. 杀幼虫生物测定**
杀幼虫生物测定按照世界卫生组织的标准协议进行（Organization, W.H., 2005）。通过将准确称量的提取物溶解在去氯水中制备储备溶液，然后进行系列稀释，得到最终浓度为50、100、200和400 mg/L的测试溶液。

**2.4. 蚊虫饲养**
斯氏按蚊在医学昆虫学与媒介控制系的昆虫房中饲养，控制条件为：25°C ± 2°C、相对湿度70% ± 10%以及12:12的光照周期。成年蚊子以10%糖水溶液为营养来源，而幼虫则以Tetra鱼食喂养（Ghosh等人，2025年）。成年雌蚊通过人工吸血技术喂养，模拟吸血过程，确保蚊子获得繁殖所需的营养。这两种喂养策略均经过精心选择，以在控制条件下维持最佳生长和发育。用于驱虫测试的雌蚊为7至10天大且禁食24小时的蚊子（Chenniappan和Kadarkari，2012年）。

**2.5. 杀幼虫生物测定**
杀幼虫活性评估遵循世界卫生组织的标准实验室测试协议（Organization, W.H., 2005）。使用含有249毫升去氯自来水的250毫升玻璃烧杯进行生物测定。每个烧杯中加入250只健康的斯氏按蚊第四龄幼虫。加入1毫升制备的测试溶液，达到最终浓度50、100、200和400 mg/L。每个浓度测试四个独立重复组（每个浓度100只幼虫）。对照组接受不含植物提取物的1毫升溶剂。
暴露24小时后记录幼虫死亡率。如果用细玻璃棒轻轻触碰幼虫没有反应，则认为其死亡。如果对照组死亡率在5%至20%之间，数据使用Abbott公式进行校正（Abbott, 1925）（Abbott, 1925）。WHO杀幼虫生物测定的实验设置见补充图S2。对照组死亡率超过20%的测试被舍弃并重新进行。使用Finney（1971）（R.H.D, 1952）描述的Probit回归分析计算致死浓度值（LC??和LC??）及其95%置信区间。

**2.6. 统计分析**
死亡率和驱虫数据经过Probit分析，以确定LC??、LC??、ED??和ED??值及其相应的95%置信区间。Probit分析使用Probit-MSChart软件（Chi, 1997）（Chi, 1997）进行，基于Finney（1971）（R.H.D, 1952）描述的方法。使用卡方（χ2）值和异质性因子评估回归模型的拟合优度。当p < 0.05时，认为剂量-反应关系显著。所有实验均重复四次，结果以平均值±标准差表示（适当情况下）。

**2.7. 蚊虫驱虫生物测定**
驱虫活性使用Klun和Debboun（K&D）定量生物测定方法进行，这是一种标准的实验室模型，用于筛选局部驱虫剂（Klun和Debboun, 2000；Debboun等人，2014）。所有实验在控制实验室条件下进行（25 ± 2°C，70 ± 10% RH）。使用7-10天大且禁食12小时的斯氏按蚊雌蚊进行驱虫测定。所有参与者均签署书面知情同意书。研究方案获得设拉子医科大学伦理委员会批准（IR.SUMS.REC.1398.522），并符合赫尔辛基宣言。
将驱虫剂涂抹在手臂皮肤上，并监测处理区域72小时内的过敏反应（Klun和Debboun, 2000）。测试装置由一个4x5x18厘米的有机玻璃立方体制成，带有四个3×4厘米的矩形孔，用于放置蚊子（Klun和Debboun, 2000；Debboun等人，2014）。K&D暴露室和实验配置的示意图见补充图S3。
为了确定有效剂量，在前臂上标记四个3×4厘米的区域。每个区域涂抹50微升测试溶液并让其干燥。每个单元格放置五只蚊子的暴露室放置在处理过的皮肤上，记录五分钟的蚊子着陆和活动情况（Debboun等人，2014）。使用Probit分析计算ED??和ED??值。

**2.8. 完全保护时间（CPT）的测定**
完全保护时间（CPT）使用Colucci和Müller（2018）（Colucci和Müller, 2018）描述的Arm-in-Cage（AIC）方法确定。在前臂上均匀涂抹标准化剂量（1毫升/500平方厘米）。CPT被定义为从应用到首次确认蚊子着陆或尝试探查之间的时间间隔。补充材料：提取程序的详细视觉文档、WHO杀幼虫生物测定设置以及Klun & Debboun（K&D）驱蚊室的资料作为补充图S1–S3提供，以提高实验设计的清晰度，同时不中断主文本的流畅性。

3. 结果
3.1 杀幼虫测试
在受控的实验室条件下，D. aucheri的水醇提取物对A. stephensi表现出杀幼虫活性。死亡率随剂量增加而增加，产生的LC??和LC??值分别将绿色和白色组织分类为中等活性和有效毒性（表1）。杀幼虫效果、回归线和剂量-反应结果分别在表2和图5及图6中展示。对照组死亡率为零，因此Probit分析不需要使用Abbott校正。观察到了明显的浓度-反应关系。两种组分在400?mg/L时死亡率均超过95%，其中绿色组分的LC??较低，因此达到这一基准的浓度略低。

表1. 绿色和白色组分的毒性和有效性（LC50和LC90值）
| 组分 | 致死浓度（a.i.）/ppm | 卡方检验（自由度） | 均质性 | 斜率 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 绿色 | 98.53 | 92 | 98.75 | 77.98 (2) | 3.99 | 0.245 |
| 白色 | 104.73 | 30 | 12.71 | 12.20 (2) | 6.10 | 0.245 |

表2. D. aucheri在不同浓度下对A. stephensi的杀幼虫活性

3.2 对成虫的驱避效果
该提取物还对A. stephensi表现出成虫驱避活性，驱避效果随剂量增加而增强。ED??和ED??值显示在表3中。绿色组分的ED??较低，且完全保护时间较长，表明其效力可能更高，这可能是由于活性成分的丰度或挥发性更强。在人类皮肤上的剂量-反应试验显示了剂量依赖性的保护效果（表3）。在0.25?mg/cm2剂量下，两种组分均产生了约65%的驱避效果。在最高剂量（0.5?mg/cm2）下，绿色组分的驱避效果达到90%，白色组分为85%。

表3. 不同浓度下的驱避率
| 剂量（mg/cm2） | 驱避率（%） |
| --- | --- |
| 0.06 | 20 |
| 0.12 | 40 |
| 0.25 | 65 |
| 0.5 | 90 |

此外，根据Probit分析，根据表1计算了绿色和白色组分的LC50和LC90。

4. 讨论
本研究提供了强有力的证据，证明D. aucheri的水醇提取物对邻近地区的主要疟疾媒介A. stephensi具有杀幼虫和驱避活性。本研究中观察到的剂量依赖性死亡率和驱避效果突显了D. aucheri作为合成杀虫剂替代品的潜力，这与全球寻找环境安全和可持续的媒介控制工具的努力相一致。

4.1 杀幼虫活性与以往研究的比较
杀幼虫生物测定表明，D. aucheri的绿色和白色组分均能有效杀死A. stephensi幼虫，在400?mg/L剂量下死亡率达到98%。LC??值分别为98.54?mg/L（绿色）和104.72?mg/L（白色），表明这些提取物具有中等至有效的毒性。这一活性水平与之前的多项植物研究相当。例如，Barat Shooshtari和Ghalandari（2012）报告称Melissa officinalis、Lavandula angustifolia和Rosmarinus officinalis的提取物具有类似的效力，更高浓度下可导致Anopheles幼虫大量死亡（Barat Shooshtari和Ghalandari，2012）。同样，Khanavi等人（2013）发现伊朗本土植物如Peganum harmala和Aloe littoralis也对A. stephensi具有剂量依赖性的杀幼虫活性，尽管通常需要与本研究相当的或更高的浓度（Khanavi等人，2013）。另一项研究表明，Cymbopogon citratus精油对Zika和登革热的媒介Aedes albopictus具有强烈的杀虫活性，在400?mg/L剂量下可实现100%的幼虫死亡率，LC??为98.7?mg/L，证明了其作为杀幼虫剂的效力。此外，它还表现出显著的成虫杀灭活性，在48?小时后导致65%的死亡率。这些结果表明C. citratus精油是合成杀虫剂的有希望的天然替代品（Vivekanandhan，2025b）。

Osanloo等人（2018）研究了Syzygium aromaticum的精油及其主要成分eugenol，其LC??值与我们的发现相似（Osanloo等人，2018）。这进一步证实了D. aucheri属于具有强杀虫潜力的药用植物。值得注意的是，D. aucheri的白色组分的毒性略高于绿色组分，这一差异可能归因于次生代谢物的组成差异——这一点值得未来的植物化学研究。

Vivekanandhan（2025）证明Cinnamomum cassia（L.）树皮精油具有显著的杀蚊活性，在24小时内使幼虫死亡率达到53.33%，成虫死亡率达到84%。48小时后，死亡率分别增加到96%和97.33%。酶测定表明CC-EO会干扰昆虫的生化过程，表现为过氧化氢酶和谷胱甘肽S-转移酶水平的下降（Vivekanandhan，2025a）。

基于植物的杀虫剂正逐渐被认可为合成化学物质的替代品。一项研究评估了Acanthospermum hispidum叶粗提取物对三种主要蚊种的杀虫潜力。根据WHO指南，使用己烷、石油苯、氯仿、乙酸乙酯和丙酮从Acanthospermum hispidum叶片中提取的提取物对Anopheles stephensi、Aedes aegypti和Culex quinquefasciatus的幼虫、蛹和成虫进行了测试。石油苯提取物显示出最高的杀幼虫和杀蛹活性。A. stephensi幼虫的LC??和LC??值分别为20.965?ppm和31.467?ppm，Ae. aegypti幼虫为15.223?ppm和27.753?ppm，Cx. quinquefasciatus幼虫为29.095?ppm和42.737?ppm。杀蛹活性LC??和LC??值分别为41.234?ppm和51.123?ppm、32.168?ppm和55.321?ppm、39.213?ppm和49.123?ppm。烟雾毒性测试显示A. stephensi（69%）、Ae. aegypti（52%）和Cx. quinquefasciatus（56%）的成虫死亡率显著。这些结果表明A. hispidum叶提取物对这些蚊种具有有希望的杀虫活性，表明其作为天然蚊虫控制剂的潜力（Vivekanandhan等人，2018）。

另一项研究调查了Melaleuca cajuputi精油对Anopheles stephensi的杀幼虫效果及其生化效应和非目标毒性。研究人员从Melaleuca cajuputi叶片中提取精油，并使用GC–MS分析了其化学组成。该精油对蚊虫幼虫表现出强烈的剂量依赖性毒性，在200?ppm剂量下幼虫死亡率为100%，LC??值在第二龄期为34.66?ppm，第四龄期为84.23?ppm。生化分析显示，该精油显著降低了解毒酶的活性，包括乙酰胆碱酯酶和羧酯酶（Vivekanandhan等人，2024a）。

Vivekanandhan等人（2024）评估了从Acacia nilotica种子子叶中提取的精油的杀虫潜力。这些精油对昆虫害虫表现出显著毒性，Culex quinquefasciatus在24小时和48小时时的死亡率分别为60%和98%。对于Plutella xylostella，同一时间点的死亡率为60%和96.66%。精油的LC??为159.263?ppm/mL，LC??为320.930?ppm/mL，48小时后分别降至52.070?ppm/mL和195.123?ppm/mL（Vivekanandhan等人，2024b）。

最近的研究进一步支持了植物来源化合物在幼虫控制中的重要性。例如，Tennyson等人（2019）的研究发现Ageratum houstonianum的甲醇提取物对A. stephensi具有强烈的杀幼虫活性，其LC??值与D. aucheri相当（Tennyson等人，2015）。同样，2020年对Ferula assa-foetida精油的研究也报告了显著的杀幼虫效果，强调了伞形科植物在媒介控制计划中的持续相关性（Sonigra和Meena，2020）。因此，本研究补充了越来越多的证据，表明伞形科植物具有显著的蚊虫控制潜力。

4.2 驱避效果与现有驱避剂的比较
D. aucheri的驱避效果同样令人印象深刻，绿色组分在0.5?mg/cm2剂量下实现了90%的驱避率。这一表现与先前研究中记录的几种植物基驱避剂相当。Moemenbellah-Fard等人（2020）报告称Cinnamomum zeylanicum和Eucalyptus globulus的精油对A. stephensi具有强效驱避效果，保护水平与本研究中观察到的高剂量水平相似（Moemenbellah-Fard等人，2020）。Asadollahi等人（2019）的系统性综述也强调了大多数植物基驱避剂的强烈剂量-反应关系——这一观察结果在当前发现中得到了明确体现（Asadollahi等人，2019）。

我们的研究还为关于植物提取物完全保护时间的相对有限的文献提供了新数据。绿色组分的CPT值为64?分钟，白色组分为52?分钟，这与早期关于丁香油和柠檬桉油的研究结果一致，这些研究通常报告的保护持续时间取决于浓度（Nerio等人，2010；El Gohary，2021）。Adam等人（2019）的最新研究发现Ocimum basilicum精油2%对Anopheles物种的CPT约为125?分钟，将D. aucheri的效力置于类似范围内，尽管效力较低（Adam等人，2019）。此外，Sengul Demirak和Canpolat（2022）的研究表明，植物基驱避剂可将叮咬率降低80–95%，具体取决于配方和浓度——再次验证了本研究中观察到的高驱避效果。因此，我们的结果支持了自然驱避剂仍然是广泛使用的合成驱避剂（如DEET）的有竞争力替代品的观点，特别是在考虑安全性、生物降解性和环境影响时。

4.3 与杀虫剂抗性的关系及综合媒介管理
Anopheles物种中日益增长的杀虫剂抗性已成为疟疾媒介控制计划的主要障碍。由于广泛的抗性突变，合成拟除虫菊酯、有机磷和氨基甲酸酯的效果越来越差。包括D. aucheri衍生的植物提取物在内的植物提取物提供了一种有前景的补充策略，因为它们含有复杂的生物活性化合物混合物，使得抗性发展的可能性降低。最近的研究强调了将植物生物杀虫剂纳入综合媒介管理（IVM）框架的重要性，以减轻抗性压力（Sengul Demirak和Canpolat，2022；Nerio等人，2010；Moemenbellah-Fard等人，2020）。

D. aucheri表现出的中等至有效毒性和强驱避性表明，它可以作为此类IVM策略的一部分使用，既可以单独作为杀幼虫剂，也可以与微生物制剂（如Bacillus thuringiensis israelensis（Bti）结合使用。配方科学——使用包封、乳化或控释技术——可能进一步增强D. aucheri提取物的残留活性，最近涉及纳米乳化植物油的研究证明了这一点（Ferreira等人，2019）。

5. 结论
总体而言，本研究的结果表明D. aucheri对A. stephensi具有显著的杀幼虫和驱避活性。与经典文献和最近的植物杀虫剂研究进展相比，D. aucheri的效力范围与已建立的植物基蚊虫控制剂一致。其强烈的剂量-反应趋势以及环保特性表明，它具有作为天然媒介控制工具的巨大潜力。进一步研究其植物化学成分、配方优化和现场验证对于实现其在公共卫生计划中的全面应用至关重要。

作者贡献声明：
Amin Hosseinpour：方法学、调查、数据管理、概念化、初稿撰写。
Mozaffar Vahedi：方法学、调查、数据分析、审稿与编辑、初稿撰写。
Azadeh Hamedi：验证、方法学、调查、数据分析。
Niloofar Soltanian：方法学、调查。
Farnaz Kazemi：软件、方法学、调查。
Elham Rezaee：方法学、调查、数据分析、概念化。
Aboozar Soltani：验证、监督、项目管理、方法学、调查、资金获取、数据分析、概念化、审稿与编辑、初稿撰写。

参与同意：不适用。
发表同意：不适用。
伦理批准和参与同意：所有研究程序均符合赫尔辛基宣言，并获得了伊朗国家生物医学研究伦理委员会的批准（批准编号：IR.SUMS.REC.1398.522）。

资金声明：本研究得到了设拉子医科大学研究和技术事务副校长（资助编号：16126）的支持，伊朗设拉子。