利用原位莫斯堡尔光谱和振动光谱技术，对比研究了根瘤菌Azospirillum lipoferum Sp59b在冻干过程中的细胞变化

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Comparative in-situ M?ssbauer and vibrational spectroscopic monitoring of changes in cells of the rhizobacterium Azospirillum lipoferum Sp59b upon lyophilisation

铁代谢调控与冻干保存机制研究：以Azospirillum lipoferum Sp59b为例，通过57Fe M?ssbauer光谱分析发现，鲜样中由Fe3?还原生成的21% Fe2?在冻干后完全氧化为Fe3?，且低温（4.7K）下检测到类似细菌 Ferritin 的磁有序Fe3?结构，FTIR和Raman光谱证实冻干样品生物大分子组成未改变，为长期保存生物肥料提供理论依据。

　　

亚历山大·A·卡姆涅夫（Alexander A. Kamnev）|谢尔盖·S·斯塔尔奇科夫（Sergey S. Starchikov）|尤利娅·A·戴亚特洛娃（Yulia A. Dyatlova）|谢尔盖·A·克里明（Sergey A. Klimin）|弗拉基米尔·A·扎亚哈诺夫（Vladimir A. Zayakhanov）|基里尔·V·弗罗洛夫（Kirill V. Frolov）|伊戈尔·S·柳布京（Igor S. Lyubutin）|安娜·V·图加罗娃（Anna V. Tugarova）

俄罗斯科学院萨拉托夫联邦科学中心植物与微生物生物化学与生理学研究所生物化学实验室，萨拉托夫410049，俄罗斯联邦

摘要

本研究比较了农业上重要的根瘤菌Azospirillum lipoferum Sp59b（以⁵⁷Fe^III–NTA复合物作为铁源培养）中细胞内铁的氧化还原状态，在新鲜湿生物质（快速冷冻）和冻干样品中使用了⁵⁷Fe穆斯堡尔光谱技术（测量温度分别为90 K和4.7 K）。通过原位拉曼光谱和傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术监测了样品的整体生物大分子组成。在新鲜生物质中检测到两种⁵⁷Fe^II成分（占细胞内铁总量的21%），这些成分是由于铁的还原吸收而产生的；然而，在冻干过程中这两种成分完全重新氧化为⁵⁷Fe^III。因此，在90 K下的冻干生物质中仅含有两种⁵⁷Fe^III形式（其穆斯堡尔参数与新鲜生物质中的不同）。在4.7 K下，部分铁(III)表现出细菌铁蛋白样铁(III)的特征性磁分裂现象。新鲜生物质和冻干生物质的拉曼光谱以及冻干生物质的FTIR光谱显示了主要的细胞生物（大）分子成分的相似特征。这与已知事实相符，即冻干后的细菌仍具有活力（处于休眠状态），这对于干微生物制剂的长期储存非常重要，例如用于生物肥料。

引言

在微生物生物技术的多个领域，冻干（在真空条件下对冷冻生物材料进行干燥）过程长期以来被用于制备用于保存和长期储存的干微生物制剂[1]、[2]。实际应用中，冻干微生物的细胞在适当储存条件下可以在常温下保持活力（处于代谢不活跃的休眠状态）并能够进行培养，持续时间相对较长[1]、[3]。对于农业生物技术应用而言，这意味着可以长期保存和储存含有促进植物生长的根瘤菌（PGPR，某些具有已知植物刺激特性的土壤细菌物种）的干制剂作为活性成分[2]、[4]。 然而，长期干燥已被证实会诱导微生物细胞内的氧化应激，从而导致生物分子的氧化损伤。这一过程通过芬顿化学反应（Fenton chemistry）发生，其中铁(II)化学物种起着积极作用[5]、[6]、[7]。另一方面，许多细菌已知能够在吸收这种氧化还原活性3d过渡金属的过程中将铁(III)还原为铁(II)，而铁是几乎所有生物体从自然环境中获取的重要微量元素[8]、[9]、[10]。代谢活跃的细胞可以控制这些过程，即使在细胞内存在大量亚铁离子的情况下也能防止活性氧（ROS）的产生，从而避免对生物分子的氧化损伤[10]、[11]。然而，关于代谢惰性（休眠）的干燥细胞在长期储存过程中克服氧化应激的能力仍不清楚。 在属于PGPR的土壤细菌中，有几个普遍存在的Azospirillum属根瘤菌具有显著的农业生物技术潜力。其中一些已被用作生物肥料的活性成分[4]、[12]、[13]。由于其植物刺激潜力和农业重要性，Azospirillum属细菌在过去四十年中一直是研究最为广泛的细菌之一（参见最近的综述[13]、[14]、[15]、[16]）。尽管如此，它们的微生物学、生物化学和生理学的许多方面仍不清楚，包括从活细胞状态转变为休眠状态（例如在干生物质中）的代谢变化。 几乎所有微生物都需要铁这种关键微量营养素，铁在多种酶和铁储存蛋白中发挥着重要作用[17]。令人惊讶的是，直到最近，关于Azospirillum属细菌的细胞内铁含量、代谢和形态的现有文献仍然有限（参见[9]、[18]、[19]、[20]、[21]及其中的参考文献）。首次使用透射⁵⁷Fe穆斯堡尔光谱技术对Azospirillum菌株的铁吸收和转化进行原位研究[19]表明，细菌细胞在从培养基中吸收铁的过程中会积极地将部分铁(III)还原为铁(II)，在对数生长阶段结束时，铁(II)占细胞内铁总量的比例高达33%。如上所述，这种行为在许多细菌中都很常见[8]、[9]、[11]。进一步的研究[20]、[21]显示，当新鲜生物质通过离心后进行冻干时，干样品中的铁(III)含量大大减少（约3%）。因此，似乎在吸收过程中积累的细胞内铁(II)在冻干过程中大部分被重新氧化[21]。众所周知，大量铁(II)的存在对休眠细胞可能是危险的，因为它们会引发类似芬顿反应[5]、[7]、[11]。在代谢惰性的细胞中，代谢控制的活性氧（ROS）解毒过程或防止其形成的过程几乎是不可能的或受到抑制的。有研究表明[21]，细胞内铁(II)在冻干过程中容易重新氧化为铁(III），这一现象目前仅在两种Azospirillum菌株中观察到[20]、[21]，这可能是一种自然策略，可以保护干（休眠）状态下的细胞生物大分子成分免受类似芬顿反应的损伤。 为了验证这一假设，本研究使用透射⁵⁷Fe穆斯堡尔光谱技术监测了另一种Azospirillum属根瘤菌A. lipoferum Sp59b[22]、[23]从新鲜生物质到冻干物的过程中细胞内铁的氧化还原变化。研究包括从90 K降至约5 K的低温测量，以确认是否存在有序的含铁结构。这种现代的高信息量仪器技术允许在快速冷冻的活细胞或冻干生物质中原位研究细胞内铁的化学状态[9]。同时，还使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）[24]、[25]和拉曼光谱[26]监测了新鲜和冻干生物质样品的整体生物大分子组成。

微生物样品的制备和处理

A. lipoferum Sp59b菌株由俄罗斯萨拉托夫IBPPM RAS的根际微生物收藏提供（https://collection.ibppm.ru；菌株编号IBPPM 173）；访问日期：2025年9月29日）。预培养过程如前所述[27]进行。随后，在相同的磷酸盐-苹果酸盐培养基上好氧培养至对数生长阶段结束（约18–20小时），然后通过离心分离并用生理盐水（0.85%）洗涤两次。

结果与讨论

在90 K下测量了⁵⁷Fe^III–NTA复合物（储备溶液；见2.2节）的穆斯堡尔光谱，以监测铁的氧化还原状态（图1）。

从光谱可以看出，储备溶液中的大部分铁（占光谱面积的98%以上，为铁(III)成分）确实以高自旋态存在。

结论

真空干燥冷冻微生物生物质（冻干）的过程长期以来被用于微生物生物技术的多个领域，以制备用于长期储存的干细胞制剂，因为冻干物中的细胞可以保持活力（处于代谢不活跃状态）。然而，长期干燥已被证实会通过芬顿化学反应诱导微生物细胞内的氧化应激，其中铁(II)化学物种起着重要作用。

CRediT作者贡献声明

亚历山大·A·卡姆涅夫（Alexander A. Kamnev）：概念构思、方法学、验证、数据分析、资源提供、研究实施、数据管理、初稿撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取。 谢尔盖·S·斯塔尔奇科夫（Sergey S. Starchikov）：方法学、数据分析、软件应用、数据管理、可视化、初稿撰写。 尤利娅·A·戴亚特洛娃（Yulia A. Dyatlova）：方法学、软件应用、研究实施、可视化。 谢尔盖·A·克里明（Sergey A. Klimin）：方法学、软件应用、研究实施、可视化。 弗拉基米尔·A.（Vladimir A.）：

伦理批准和参与同意

不适用。

资助

本研究得到了俄罗斯科学基金会（Russian Science Foundation）的支持（资助编号#24–26-00209）。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、文章撰写或决定文章发表。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：亚历山大·A·卡姆涅夫表示获得了俄罗斯科学基金会的财务支持。其他作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本文的主要内容由A.A.K.在第四届国际光谱研讨会（CSI XLIV；2025年7月27–31日，德国乌尔姆）的主题演讲中介绍；非常感谢CSI XLIV组织委员会（包括国际顾问委员会和国际科学委员会）邀请A.A.K.参加本次会议。

对冻干细菌样品的FTIR光谱测量