《Talanta》：A highly sensitive and stable lateral flow immunoassay for carcinoembryonic antigen using weakly-ionized AuNPs and a cationic polymer control line
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侧流免疫层析法（LFIA）因操作简便、成本低而广泛应用于临床检测，但传统金纳米颗粒（AuNPs）的抗体结合效率低、稳定性差限制了灵敏度提升。本研究通过设计弱离子化AuNPs（WIAu）作为检测探针，结合聚二甲基二烯丙胺（PDDA）构建的非生物控制线（PCL），开发了WIAu/PCL-LFIA平台。WIAu通过静电吸附显著提高抗体偶联效率与颗粒稳定性，检测限达1.49 ng/mL（低于临床阈值5 ng/mL），同时PDDA控制线避免了蛋白变性问题，批次差异小且成本低。该平台兼具高灵敏度、优异稳定性和商业化潜力，为结直肠癌预后居家监测提供了可靠工具。
陈 Liu|雷 沙|文文 图|洪兆茂|彭城 古|恩泽 生|魏 李|志辉 戴
中国江苏省南京市南京工业大学化学与分子工程学院智能医疗传感材料与设备江苏省重点实验室，211816
摘要
侧向流动免疫分析（LFIA）因其简单性、快速的结果和低成本而被广泛用于即时检测。然而，传统的金纳米粒子（AuNPs）由于抗体结合效率低和胶体稳定性差，常常限制了检测灵敏度，使得在复杂的血清基质中准确分析低丰度生物标志物变得具有挑战性。为了解决这些限制，我们开发了一种基于弱离子化金纳米粒子（WIAu）（AA-AuNPs）作为检测探针和聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDDA）作为对照线的新型LFIA策略，简称为WIAu/PCL-LFIA。使用肿瘤生物标志物癌胚抗原（CEA）作为模型目标分析物，AA-AuNPs通过静电吸附实现了高效的抗体结合，显著提高了标记效率和胶体稳定性。同时，通过在硝化纤维素膜上固定PDDA构建了一个非生物对照线（C线），该对照线通过多点协同捕获作用有效捕获游离探针，从而克服了传统基于蛋白质的C线所关联的变性风险和批次间差异。开发的WIAu/PCL-LFIA平台在血清样本中对CEA的检测限达到了1.49 ng/mL，远低于临床阈值5 ng/mL，显示出高灵敏度、优异的储存稳定性和低成本。这种新设计的WIAu/PCL-LFIA平台为家庭监测结直肠癌预后提供了一个可靠且具有商业可行性的工具，在快速检测疾病相关生物标志物方面显示出巨大潜力。
引言
侧向流动免疫分析（LFIA）已成为即时检测的基石技术，在临床诊断、食品安全和环境监测等领域得到了广泛应用。其广泛的采用得益于其用户友好性、快速的结果和低成本等核心优势[1,2]。典型的LFIA试纸由四个功能单元组成：用于加样的样品垫、预装有检测试剂（例如信号探针）的结合垫、带有捕获线（T线和C线）的硝化纤维素膜以及用于吸液的吸收垫[3]。据我们所知，LFIA中的信号探针直接决定了检测的灵敏度和信号输出，而C线则提供了验证试纸完整性和操作程序正确性的关键内部控制[4]。因此，对更高性能的不懈追求表明，LFIA技术的进步从根本上与其两个核心组件——信号探针和C线的创新紧密相关。
然而，大多数商用LFIA的检测灵敏度和信号输出受到传统AuNPs作为标记物的限制，这些问题包括抗体结合效率低和胶体稳定性差[5]。为了解决这些问题，已经开发了多种促进信号放大的材料，包括金纳米复合材料[6]、金属有机框架（MOFs）[7],[8],[9]、集成荧光[10,11]、表面增强拉曼散射[12,13]和光热信号[14]的多功能纳米材料、上转换纳米粒子[15,16]。尽管如此，由于合成复杂、成本高昂或依赖专用读出设备，这些先进材料的商业化应用仍然具有挑战性。相比之下，AuNPs因其制备简单、成本低和视觉可解释性而仍然是商用LFIA的首选标记物[17]。因此，已经开发了基于Au的核心壳纳米粒子[18]、双金缀合物[19]和可调间距的AuNP簇[5]等Au结构材料，显著提高了光学响应和检测灵敏度。然而，它们增加的制备复杂性和成本与传统AuNPs的低成本和简单制备的核心优势相矛盾。因此，解决性能与实用性之间的权衡仍然是一个关键的研究目标。
除了信号探针外，LFIA的可靠性还取决于其C线的性能[20]。然而，依赖于在硝化纤维素膜上固定抗体的传统C线存在易失活、结合不稳定、成本高和批次间差异显著等问题[21,22]。为了解决这些问题，已经开发了磷树状大分子和水凝胶[23]等非生物物质，以及适配体[24,25]和溶菌酶[26,27]等生物分子作为抗体的替代品。这些方法通常依赖于在膜上的物理吸附，但这可能受到高成本、粘附性差或结合不稳定的限制[27]。鉴于现有策略的局限性，理想的C线替代品应具备低成本、高稳定性和易于牢固固定的特点。近年来，使用带正电荷的物质（例如聚合物[23]或染料[28]）的静电相互作用策略受到了关注。由于这种静电机制不依赖于生物识别，因此从根本上避免了因蛋白质变性导致的C线失效风险，从而显著提高了试纸的储存稳定性和检测可靠性，并降低了成本。在各种阳离子候选材料中，聚合物PDDA因其高电荷密度、低成本和强静电吸附能力而成为特别有前景的材料[29]。然而，PDDA在硝化纤维素膜上的吸附行为尚未得到系统研究，与其他阳离子材料的全面比较研究也尚缺乏。因此，本研究旨在系统评估PDDA作为C线的实际性能，以推进其作为稳定、经济和可靠替代品的应用。
基于结合灵敏度增强（使用带有检测抗体（Ab1）的功能化AA-AuNPs，简称为AA-AuNPs@Ab1信号探针）和C线优化（使用基于PDDA的对照线）的双重设计策略，首次开发了一个集成平台，称为基于弱离子化金纳米粒子/PDDA的对照线-侧向流动免疫分析（WIAu/PCL-LFIA）。这种创新的WIAu/PCL-LFIA方法将弱离子化金纳米粒子作为信号探针与基于PDDA的C线相结合，在单个LFIA平台上协同增强了分子识别效率和检测可靠性。我们以胃肠道恶性肿瘤的关键生物标志物CEA为目标进行了建模，对其超灵敏检测对于早期诊断和预后监测至关重要。如图1所示，AA-AuNPs被用作信号探针，通过静电吸附实现了高效的抗体结合，形成AA-AuNPs@Ab1探针。创新性地，使用阳离子聚合物PDDA构建了C线，通过强静电相互作用捕获多余的探针。这种设计不仅消除了在高盐环境中基于蛋白质的C线失效的风险，还大幅降低了生产成本。由此产生的WIAu/PCL-LFIA平台在血清样本中对CEA的定量检测限达到了1.49 ng/mL。这一值远低于临床CEA阈值（5 ng/mL），也显著低于传统基于AuNPs的LFIA（10 ng/mL的检测限）。结合高灵敏度、出色的稳定性和低成本，该平台成为家庭监测结直肠癌预后的一个有前景的工具。
节选内容
AA-AuNPs的合成
AA-AuNPs的制备遵循已报道的程序，并进行了轻微调整[3]。将1%（w/w）的HAuCl4溶液（1 mL）用49 mL去离子水在100 mL圆底烧瓶中稀释。混合物在持续搅拌下加热至80°C，然后加入100 μL 0.1 M HCl。随后温度升高至90°C，并迅速向剧烈搅拌的溶液中注入1.5 mL 1%（w/w）的抗坏血酸钠（AA）溶液。反应完成后
AA-AuNPs的设计与表征
传统AuNPs因其制备简单和视觉检测能力强而成为侧向流动分析的主要成分。然而，它们的胶体稳定性和结合效率有限，限制了其在高灵敏度应用中的使用[24]。为了克服这些限制并提高性能，我们旨在合成具有弱离子化表面的AuNPs。这样的设计可以提供更强的静电排斥力，从而提高胶体稳定性，同时保持有利的电荷环境
结论
在这项研究中，基于AA-AuNPs和阳离子聚合物PDDA C线，成功构建了一个新型的WIAu/PCL-LFIA平台，实现了对CEA的高灵敏度和低成本检测。通过优化AA-AuNPs@Ab1探针的抗体结合效率，并利用PDDA C线的优异耐盐性，显著提高了平台的检测性能和实际应用性。定量分析表明，该系统保持了良好的视觉效果
CRediT作者贡献声明
陈 Liu：撰写——原始草稿，数据整理，概念构思。雷 沙：验证，调查，形式分析。文文 图：可视化，调查。洪兆茂：验证，形式分析。彭城 古：资源提供，形式分析。恩泽 生：验证，资源提供，方法学研究。魏 李：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思。志辉 戴：监督，项目管理，资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：22404081、22234005、22494632）、江苏省自然科学基金（编号：BK20240534）和中国博士后科学基金（编号：2025M770985）的支持。
