《Talanta》：Ultrasensitive chemiluminescent detection of plasma Aβ1-40 based on soluble macromolecular signal amplification carrier
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超敏化学发光免疫分析（CLIA）技术通过新型单克隆抗体（2F10和12H6）与可溶性大分子信号放大载体（Ficoll400-SA）的协同作用，实现血浆中Aβ1-40的高灵敏度检测（检测限0.28 pg/mL，动态范围0.54–1000 pg/mL），并验证其与商业方法高度相关（Spearman's ρ=0.99），为AD早期诊断提供新工具。
郭超林|刘萌|安展飞|李帅鹏|崔梦琳|聂建奇|孙阳|白中虎
中国江南大学生物技术学院工业生物技术教育部重点实验室，无锡，214122
摘要
本研究开发了一种超灵敏的化学发光免疫测定（CLIA）方法，用于检测血浆中的阿尔茨海默病（AD）生物标志物β-淀粉样蛋白（Aβ）1-40，该方法利用了新型单克隆抗体和创新的可溶性大分子信号放大载体——Ficoll400-链霉亲和素（Ficoll400-SA）结合物。研究成功制备了两种高亲和力的单克隆抗体（KD ≈ 10^?10 M），分别命名为2F10和12H6，它们具有抗原表位特异性，能够靶向Aβ1-40的不同N端和C端区域。这些抗体表现出极强的特异性，与密切相关的异构体（如Aβ1-42）的交叉反应率极低（<0.5%）。Ficoll400-SA载体通过将多个链霉亲和素分子连接到Ficoll400骨架上并进一步交联而形成，通过促进快速、均匀的反应和高密度的酶加载能力实现了显著的信号放大。优化实验条件后，与传统的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）系统相比，信号强度提高了13倍，检测限达到0.28 pg mL^?1，动态范围为0.54–1000 pg mL^?1。该检测方法具有优异的精确度（CV < 8%），在加速和现场条件下稳定性良好，交叉反应率可忽略不计。使用人类血浆样本进行的临床验证显示，该方法与商业Aβ1-40检测方法具有显著的相关性（Spearman's ρ = 0.99），且无系统偏差，证实了其准确性和转化潜力。总体而言，这种集成方法为Aβ1-40的定量提供了一个稳健、经济高效且超灵敏的平台，推动了基于血液的AD诊断技术的发展，并展示了可溶性大分子载体在免疫测定信号放大中的多功能性。
引言
阿尔茨海默病（AD）是最常见的痴呆症类型，由于其日益增加的社会和经济影响而成为全球性的健康问题[1]。AD的病理过程被认为在临床症状出现前数年甚至数十年就开始了[2]，因此迫切需要可靠的生物标志物来促进早期诊断和干预。AD的一个关键病理特征是细胞外斑块的积累，这些斑块由β-淀粉样蛋白（Aβ）肽组成，这些肽是通过淀粉样前体蛋白（APP）的连续蛋白水解切割产生的[3]。因此，许多临床试验的主要目标是清除或减少大脑中的Aβ肽[4],[5],[6]。在这些肽中，Aβ1-40异构体在大脑和生物液体中的含量最高，约占分泌的Aβ总量的80–90%[7]。脑脊液（CSF）和血浆中Aβ1-40浓度的变化以及Aβ42/Aβ40比值的改变已被一致认为是AD的有希望的诊断和预后生物标志物[8,9]。因此，准确和灵敏地定量Aβ1-40对于临床实验室诊断[10,11]、评估治疗效果[12]以及AD发病机制的基础研究[13]至关重要。
Aβ1-40免疫检测中的一个主要挑战在于高质量抗体的开发[14]。理想的抗体必须满足两个严格且常常相互冲突的标准：它必须表现出极高的亲和力以检测生物液体（如血浆）中低水平的生理浓度，同时还要具有精确的特异性以区分与其密切相关的异构体，特别是Aβ1-42[15]。Aβ1-40和Aβ1-42之间的高序列同源性使得生成交叉反应率低的抗体变得复杂。即使是轻微的交叉反应也会显著影响Aβ42/Aβ40比值的准确性，而这一比值是AD诊断中的关键生物标志物，可能导致患者分类错误[14]。
目前有多种基于免疫测定的方法用于检测CSF样本中的Aβ肽[16,17]。然而，在外周血中准确定量Aβ1-40仍然是一个重大技术挑战，因为其浓度极低（仅为皮克克每毫升）。传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）通常缺乏在这种复杂生物基质中进行稳健定量所需的灵敏度和动态范围，可能导致评估不准确[18]。尽管像单分子阵列（Simoa）[19]和免疫沉淀-质谱（IP-MS）[20]这样的先进技术提供了更高的灵敏度，但它们的广泛应用往往受到高操作成本、技术复杂性和需要专用仪器的限制[21]。尽管最近利用各种生物传感平台在Aβ1-40检测方面取得了进展[22],[23],[24]，但这些方法在样本通量和自动化方面经常遇到限制，从而阻碍了它们在大规模临床筛查中的实际应用。因此，开发一种高灵敏度、经济高效、自动化程度高且用户友好的Aβ1-40检测免疫测定平台是非常必要的。
化学发光免疫测定（CLIA）由于其高灵敏度、宽线性动态范围和简单的仪器要求而在生物分析应用中越来越受到重视[25,26]。CLIA的灵敏度在很大程度上取决于信号生成和放大系统的效率。传统策略（如酶标记抗体）通常提供的信号强度有限[27,28]。提高灵敏度的有效方法是在每次结合事件中大幅增加信号报告分子的数量[29]。尽管链霉亲和素（SA）-生物素系统是一种广泛使用的放大方法，但通过使用新型信号载体可以进一步发挥其潜力[30,31]。大多数现有的载体基于固相材料，如金属有机框架（MOFs）[32]、脂质体[33,34]和纳米颗粒[35,36]，这些材料可能存在反应动力学慢和反应条件不均匀的问题[37]。相比之下，可溶性大分子载体具有几个明显的优势：它促进了溶液中的快速、均匀反应动力学，允许极高的酶标记密度，并减少了空间阻碍，从而有可能显著提高检测灵敏度[38]。在我们之前的研究中，开发了一种可溶性大分子信号放大载体Ficoll400-Streptavidin（Ficoll400-SA），显著提高了心肌肌钙蛋白I（cTnI）的检测灵敏度[39]。
本研究报道了一种用于检测血浆中Aβ1-40的新型超灵敏CLIA方法。如图1所示，该检测方法结合了高亲和力单克隆抗体的制备和采用可溶性大分子载体（Ficoll400-SA）的创新信号放大策略。这种载体是通过将多个SA分子连接到生物相容的Ficoll400骨架上构建的，该骨架具有良好的水溶性和亲和力，从而能够有效地与生物素-抗体（Bio-Ab）和生物素-辣根过氧化物酶（Bio-HRP）结合，从而对每个捕获的Aβ1-40分子实现显著的信号放大。通过使用一对精心选择的单克隆抗体的夹心格式，该检测方法的灵敏度通过Ficoll400-SA结合物得到了显著提高。研究包括对Aβ1-40特异性抗体的全面表征、基于Ficoll400-SA载体的夹心CLIA协议的开发和优化，以及对检测方法分析性能的广泛验证，包括灵敏度、特异性、精确度、稳定性和与现有商业方法在临床样本中定量Aβ1-40的相关性。这种集成方法为血浆Aβ1-40的定量提供了一个稳健可靠的工具，具有显著推动AD诊断生物标志物研究的潜力。
试剂和材料
Aβ肽由GenScript Biotech Corporation（中国南京）合成，包括Aβ1-8、Aβ33-40、Aβ1-38、Aβ1-42等。N-琥珀酰亚胺-S-乙酰巯基乙酸酯（SATA）、Sulfo-琥珀酰亚胺-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯（Sulfo-SMCC）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和Sulfo-NHS-LC-LC-生物素购自Thermo Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。牛血清白蛋白（BSA）、Ficoll400、Freund's...
Ficoll400-SA的特性
链霉亲和素-多糖信号放大载体（Ficoll400-SA）通过顺序交联策略成功合成。通过尺寸排阻色谱法进行 conjugation 和纯化后，洗脱并收集到一个独特的高分子量峰，确认了目标结合物的形成。 conjugation 的成功和所得到的形态通过LV-TEM直接观察到。如图1A和B所示，天然的Ficoll400表现为离散的...
结论
总之，本研究成功开发了一种新型的超灵敏CLIA方法，用于精确检测血浆中的阿尔茨海默病生物标志物Aβ1-40。该检测方法结合了一对高亲和力的、具有抗原表位特异性的单克隆抗体和一种创新的可溶性大分子信号放大载体（Ficoll400-SA）。这种协同设计带来了卓越的分析性能，检测限达到0.28 pg mL^?1，动态范围广泛...
CRediT作者贡献声明
郭超林：撰写——原始草稿，形式分析，概念化。
刘萌：撰写——原始草稿，概念化。
安展飞：形式分析。
李帅鹏：数据管理。
崔梦琳：形式分析。
聂建奇：监督。
孙阳：撰写——审阅与编辑。
白中虎：撰写——审阅与编辑，资金获取。
伦理批准
本研究遵循《赫尔辛基宣言》的原则进行，并获得了江南大学附属医院（中国江苏无锡）伦理委员会的批准。实验涉及人类受试者时已获得知情同意，整个研究过程中严格保护了这些个体的隐私权。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号22478157）的资助。
