磷脂酰丝氨酸脂质体中不同抗原肽的包封效率测定方法

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Encapsulation efficiency determination methods for the analysis of different antigenic peptides within phosphatidylserine-liposomes

　　

自身免疫性疾病（AIDs）的患病率正在上升，并持续存在于所有年龄段的个体中，如Pisetsky（Nat Rev Nephrol, 2023）所述。目前仅有姑息治疗可用，因为开发一种选择性消除免疫系统自身反应而不影响其正常功能的治疗方法并非易事。在这方面，基于负载触发自身免疫攻击的自身抗原肽的磷脂酰丝氨酸脂质体（PS-Liposomes）的创新策略已在不同的AIDs中显示出疗效，如Almenara-Fuentes等人（Nanomedicine 48, 2023）和Pujol-Autonell等人（PLoS One 10, 2015）所述。脂质体治疗制剂中包封效率（EE）的测定被认为是最重要的属性之一，因为包封药物浓度通常与治疗效果相关。为此，文献中已描述了几种用于测定脂质体内特定肽的方法。然而，所描述的方法通常不能应用于具有不同性质的其他肽。本研究以包封在PS-Liposome制剂中的不同长度和理化性质的肽为模型，评估了游离和总抗原定量的几种方法。研究了脂质体裂解及随后总抗原或包封抗原定量的不同方法。另一方面，对不同的离心过滤器和超速离心方法进行了全面比较，以用于游离抗原测定。通过反相高效液相色谱-紫外检测（RP-HPLC-UV）对自身抗原肽进行鉴定和定量。比较了PS-Liposome制剂的直接和间接EE测定结果，并选择了每种肽的最佳条件。

**研究背景与意义**
自身免疫性疾病（AIDs）发病率持续上升且影响各年龄段人群，目前仅依赖非特异性免疫抑制的姑息治疗，缺乏疾病特异性。基于外周免疫耐受诱导策略，研究人员发展了一种纳米技术方法：将自身抗原肽包封于磷脂酰丝氨酸脂质体（PS-Liposomes）中，模拟凋亡细胞结构以诱导针对特定抗原的免疫耐受，已在多发性硬化（MS）和1型糖尿病（T1D）等AIDs中显示疗效。脂质体制剂的包封效率（EE）是关键质量属性，直接影响治疗效果，且游离药物可能导致非靶向分布和毒性。现有文献报道的脂质体内特定肽的测定方法通常不适用于理化性质不同的其他肽。为此，本研究以四种不同长度和理化性质的自身抗原肽（33-mer、胰岛素、鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（mMOG）和乙酰胆碱受体（AChR））为模型，系统评估了PS-Liposome制剂中游离和总抗原的测定方法，旨在为不同肽选择最优的EE测定策略。该研究发表在《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。

**关键技术与方法**（不超过250字）
研究人员采用溶剂注入法制造PS-Liposome制剂（由Ahead Therapeutics在洁净室中完成），磷脂组分为磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰丝氨酸（PS）和胆固醇（CHOL），通过挤出和透析获得均质悬浮液。抗原肽（33-mer、胰岛素、mMOG、AChR，纯度>90%）由庞培法布拉大学肽合成设施提供。脂质体裂解比较了液态-液态萃取（基于Bligh-Dyer法）和50%异丙醇直接裂解法；游离抗原分离评估了Amicon Ultra（100 kDa）和Microcon YM30（30 kDa）离心过滤器（含牛血清白蛋白（BSA）或聚乙二醇（PEG）钝化）及超速离心法（14,000×g，4°C，40 min）。包封脂质体分离测试了Vivaspin（100、300 kDa）和Centrisart I（300 kDa）过滤器。所有肽的鉴定与定量采用反相高效液相色谱-紫外检测（RP-HPLC-UV），方法经线性、灵敏度、准确度、精密度和特异性验证。mMOG与脂质体的吸附作用通过6 kDa大小排阻色谱（SEC）柱评估。

**研究结果**
**总肽测定：脂质体裂解**
通过比较不同有机溶剂（甲醇、异丙醇、乙腈）和去污剂Triton X-100，发现仅50%异丙醇和Bligh-Dyer基液态-液态萃取能完全裂解PS-Liposomes（得到澄清溶液）。对加标空白PS-Liposomes（200 mg·L^-1）的回收率测试显示：33-mer和mMOG的最佳方法为液态-液态萃取（回收率>95%），胰岛素的最佳方法为50%异丙醇（回收率>98%）；AChR因在0.1 M HCl中溶解度低，改用DPBS缓冲液后回收率达98%。RP-HPLC-UV方法验证显示线性良好（R²>0.999），检测限（LOD）为0.5 mg·L^-1（mMOG为2.5 mg·L^-1），日内和日间回收率98–102%，RSD<3%，且无脂质干扰及残留。

**游离肽分离与测定：间接法**
离心过滤器比较中，Microcon YM30易被脂质体堵塞，Amicon Ultra在14,000×g离心10 min并两次水洗后，33-mer和胰岛素回收率>75%，但AChR和mMOG回收率<5%。BSA钝化Amicon过滤器提高了33-mer和胰岛素回收率（>90%），但AChR仍接近0%（因强吸附），mMOG回收率仍低（<5%）。通过6 kDa SEC柱分析发现，mMOG单独上柱被保留，而与PS-Liposomes混合后其随脂质体洗脱，表明mMOG因正电荷（pI 10.7）与带负电的脂质体外膜（Zeta电位–20至–25 mV）发生静电吸附。超速离心法（14,000×g，4°C，40 min，无冲洗）对所有肽的游离回收率均>95%，仅mMOG为47%。应用超速离心至实际包封PS-Liposomes批次后，EE值低于过滤器法，且与加标回收率一致，确认超速离心为最可靠方法。不同肽的EE差异显著：疏水性强的33-mer（疏水残基高、带电残基<25%）EE最低，亲水肽mMOG（带电残基>25%）EE最高，且正电荷增强其与脂质体的结合。

**包封脂质体分离：直接法**
以胰岛素负载PS-Liposomes（批次5）为模型，比较直接与间接EE。超速离心间接法给出参考EE 59%。直接法中，Amicon Ultra、Microcon、Vivaspin均因脂质体吸附或过滤堵塞导致EE严重偏低（<50%），仅Centrisart I（反离心力方向工作）得到EE 58%，与间接法一致。间接法使用Centrisart I时，游离胰岛素回收不完全导致EE虚高，而Amicon 100 kDa和Vivaspin 300 kDa可能引起肽泄漏。结论：直接法需依赖特定设备（Centrisart I），间接超速离心法更经济、省时且结果可靠。

**讨论与结论**
研究系统比较了不同肽在PS-Liposome中EE测定的多种方法，揭示脂质体裂解效率和游离肽回收强烈依赖于肽的理化性质（疏水性、电荷、pI）及脂质体组成。mMOG的静电吸附表明膜结合肽应视为包封部分，因其在生物体内随脂质体共递送。超速离心法凭借密度沉降机制，避免膜吸附和分子截留问题，对所有肽提供最稳健的游离抗原分离。间接策略（超速离心+最佳裂解法）与直接策略（Centrisart I分离）可获得一致结果，但间接法操作更简便。翻译研究结论部分如下：“本研究比较了多种分析方法，以准确确定PS-脂质体制剂中不同肽的包封效率（EE（%）），这是直接与治疗效果相关的关键质量属性。脂质体裂解方法显示，有效裂解和包封药物提取高度依赖于脂质体组成和肽的理化性质。在测试方法中，添加50%异丙醇和基于Bligh-Dyer的液态-液态萃取最为有效。对于游离肽定量，评估了多种离心过滤器和条件，包括过滤器类型、离心参数、冲洗步骤和膜钝化。然而，超速离心方法始终提供最高且最可靠的肽回收率，突显了其分离游离和包封组分的稳健性。在直接EE（%）测定方法中，脂质体分离效率强烈依赖于设备，大多数测试过滤器结果不一致，仅Centrisart I设备获得可靠结果。最后，证明在适当方法选择后，间接和直接策略可获得相似结果。总体而言，这些发现为根据制剂特性选择和优化方法提供了实用指导，支持开发用于EE（%）测定的稳健可靠的分析方法。”