Cytoplast CXCR4：一种去核自消除机制及线粒体递送技术，用于针对性治疗软骨缺陷

《Biomaterials》：CytoplastCXCR4: An Enucleated Self-Eliminating and Mitochondria Delivering Strategy for Targeted Cartilage Defect Therapy

本研究开发了一种靶向递送系统cytoplastCXCR4，通过基因过表达CXCR4增强迁移能力，保留线粒体功能，改善关节软骨受损细胞的线粒体质量控制（MQC），促进软骨再生，并在体外和体内实验中验证了其优于传统外泌体的治疗效果。

　　

Fang-Xue Zhang|Yun Dou|Yu-Bin Li|Meng-Han Chien|Jing-Ke Du|Bo Zhang|Ming-Ze Du|Li-Ya Ai|Tuo Wu|Hao-Ling Guo|Dong Jiang

北京大学第三医院运动医学系，北京大学运动医学研究所，中国北京

摘要

关节软骨再生面临重大挑战，因为其自我修复能力有限，且受到局部炎症和代谢紊乱的阻碍。线粒体质量控制（MQC）对于维持软骨细胞分化和代谢至关重要；然而，针对MQC的策略仍缺乏研究。在这里，我们开发了一种无细胞递送载体cytoplast^CXCR4，通过超速离心从去核的CXCR4转染的间充质干细胞（MSCs）中分离出线粒体，以促进线粒体运输并恢复MQC。CXCR4基因过表达后，通过与软骨损伤部位升高的趋化因子SDF-1α的相互作用，增强了向炎症软骨的迁移能力。CXCR4基因转染、去核的cytoplast^CXCR4通过CXCR4-SDF-1α轴表现出更强的归巢能力。体外实验结果表明，cytoplast^CXCR4改善了骨关节炎软骨细胞的线粒体质量、结构和氧气消耗以及ATP合成，从而恢复了代谢平衡。与外泌体相比，cytoplasts保留了细胞活性，包括功能性细胞器和旁分泌信号传导。值得注意的是，我们观察到通过cytoplast衍生的囊泡实现了线粒体转移，这有助于恢复受损软骨细胞中线粒体的形态和功能。体内实验结果显示，在大鼠膝关节软骨缺损模型中，cytoplasts^CXCR4的滞留时间更长，并能更精确地靶向受损软骨，显著促进软骨再生。本研究提出了一种针对MQC并保护线粒体的方法，为关节软骨再生提供了改进的策略。

引言

关节软骨的完整性在减少关节运动时的摩擦和吸收冲击方面起着关键作用。[1] 软骨损伤从表面磨损到全层组织缺损不等，是一种全球性的疾病，导致数百万患者出现长期膝关节症状，如活动相关疼痛和肿胀，并发展为骨关节炎（OA），给医疗系统带来沉重负担。[2],[3] 由于软骨缺乏血管，一旦受损，其自我修复能力有限。[4] 目前的外科干预措施（如微骨折）只能暂时缓解症状，但无法再生透明软骨，且长期失败率和再手术率较高。[5],[6] 多种因素影响软骨修复，其中软骨细胞代谢越来越受到关注，这需要有效的策略。[7]

最新研究表明，线粒体功能障碍和线粒体质量控制（MQC）的丧失会导致细胞内稳态紊乱，引起能量产生和代谢失调，最终导致细胞活力丧失和疾病进展加速。[8],[9],[10] 正常细胞中的线粒体通过蛋白质质量控制、线粒体自噬、线粒体形态调节、线粒体融合和分裂以及线粒体运输等途径维持MQC，从而保持正常的线粒体功能。[11],[12],[13],[14] 研究强调，受损软骨细胞中MQC的受损是关节退化的关键因素，导致过度的氧化应激、软骨基质代谢紊乱和软骨细胞死亡。[15],[16] 尽管越来越多地关注软骨健康的线粒体稳态，但有效的调控策略仍然缺乏。开发能够保持线粒体完整性和恢复MQC的方法可能为恢复软骨细胞活性和促进软骨再生提供可行的策略。

最近，一种新型无细胞递送载体cytoplasts（其他研究者也称之为cargocytes）被报道在多种疾病中显示出显著的治疗潜力。[17],[18],[19] 以往的研究表明，cytoplasts在急性胰腺炎模型和糖尿病伤口模型中具有理想的组织修复效果，这些模型与软骨缺损具有相似的特征，包括炎症和组织破坏。cytoplasts是通过低速超速离心MSCs产生的，过程中去除了MSCs的细胞核，同时保留了完整的细胞膜。cytoplasts保留了线粒体等细胞器，这些细胞器对能量生产和蛋白质合成至关重要。[17] 这种保留有助于维持MQC，并可能恢复线粒体稳态和细胞活力。研究表明，cytoplasts衍生物在抗炎和组织修复过程中表现出与MSCs相当的治疗效果。[18],[19] 此外，无细胞核和完整的细胞膜使cytoplasts具有自我清除和表面修饰的能力，确保了生物安全性。[20],[21],[22] 一步超速离心制备过程具有高产率和低成本的优势。鉴于这些优点，cytoplasts成为软骨缺损治疗的有希望的候选者。

在这里，我们假设过表达趋化因子受体的去核细胞会主动迁移到软骨缺损部位，并通过直接转移线粒体和增强旁分泌信号传导来促进再生。为了验证这一假设，我们通过基因工程改造骨髓来源的MSCs使其过表达CXCR4，然后通过超速离心生成去核的cytoplasts^CXCR4（图1）。CXCR4是一种趋化因子受体，可与间质细胞衍生因子1α（SDF-1α）结合，后者在炎症和受损软骨组织中高度表达，并介导细胞向损伤部位的迁移。与我们的假设一致，CXCR4过表达的cytoplasts^CXCR4在体外表现出更强的迁移能力，在体内能够精确靶向损伤部位。此外，体外结果表明，MSC衍生的cytoplasts能够通过线粒体转移恢复MQC，并维持受损软骨细胞的线粒体形态和功能稳态。注射cytoplasts^CXCR4在大鼠软骨缺损模型中显著促进了软骨再生，这一结果通过肉眼观察、磁共振成像（MRI）和组织学染色得到证实。我们认为，cytoplasts^CXCR4在改善软骨细胞MQC和精确靶向方面具有巨大潜力，同时具备生物安全性、生物工程和生物制造的优点，因此具有临床转化的前景。

部分内容摘要

关节软骨的完整性在减少关节运动时的摩擦和吸收冲击方面起着关键作用。[1] 软骨损伤从表面磨损到全层组织缺损不等，是一种全球性的疾病，导致数百万患者出现长期膝关节症状，如活动相关疼痛和肿胀，并发展为骨关节炎（OA），给医疗系统带来沉重负担。[2],[3] 由于软骨缺乏血管，一旦受损，其自我修复能力有限。[4] 目前的外科干预措施（如微骨折）只能暂时缓解症状，但无法再生透明软骨，且长期失败率和再手术率较高。[5],[6] 多种因素影响软骨修复，其中软骨细胞代谢越来越受到关注，这需要有效的策略。[7]

最新研究表明，线粒体功能障碍和线粒体质量控制（MQC）的丧失会导致细胞内稳态紊乱，引起能量产生和代谢失调，最终导致细胞活力丧失和疾病进展加速。[8],[9],[10] 正常细胞中的线粒体通过蛋白质质量控制、线粒体自噬、线粒体形态调节、线粒体融合和分裂以及线粒体运输等途径维持MQC，从而保持正常的线粒体功能。[11],[12],[13],[14] 研究强调，受损软骨细胞中MQC的受损是关节退化的关键因素，导致过度氧化应激、软骨基质代谢紊乱和软骨细胞死亡。[15],[16] 虽然软骨健康中的线粒体稳态越来越受到关注，但有效的和可转化的调控策略仍然缺乏。开发能够保持线粒体完整性和恢复MQC的方法可能为恢复软骨细胞活性和促进软骨再生提供可行的策略。

最近，一种新型无细胞递送载体cytoplasts（其他研究者也称之为cargocytes）被报道在多种疾病中显示出显著的治疗潜力。[17],[18],[19] 以往的研究表明，cytoplasts在急性胰腺炎模型和糖尿病伤口模型中具有理想的组织修复效果，这些模型与软骨缺损具有相似的特征，包括炎症和组织破坏。cytoplasts是通过低速超速离心MSCs产生的，过程中去除了MSCs的细胞核，同时保留了完整的细胞膜。cytoplasts保留了线粒体等细胞器，这些细胞器对能量生产和蛋白质合成至关重要。[17] 这种保留有助于维持MQC，并可能恢复线粒体稳态和细胞活力。研究表明，cytoplasts衍生物在抗炎和组织修复过程中表现出与MSCs相当的治疗效果。[18],[19] 此外，无细胞核和完整的细胞膜使cytoplasts具有自我清除和表面修饰的能力，确保了生物安全性。[20],[21],[22] 一步超速离心制备过程具有高产率和低成本的优势。鉴于这些优点，cytoplasts成为软骨缺损治疗的有希望的候选者。

在这里，我们假设过表达趋化因子受体的去核细胞会主动迁移到软骨缺损部位，并通过直接转移线粒体和增强旁分泌信号传导来促进再生。为了验证这一假设，我们通过基因工程改造骨髓来源的MSCs使其过表达CXCR4，然后通过超速离心生成去核的cytoplasts^CXCR4（图1）。CXCR4是一种趋化因子受体，可与间质细胞衍生因子1α（SDF-1α）结合，后者在炎症和受损软骨组织中高度表达，并介导细胞向损伤部位的迁移。与我们的假设一致，CXCR4过表达的cytoplasts^CXCR4在体外表现出更强的迁移能力，在体内能够精确靶向损伤部位。此外，体外结果表明，MSC衍生的cytoplasts能够通过线粒体转移恢复MQC，并维持受损软骨细胞的线粒体形态和功能稳态。注射cytoplasts^CXCR4通过肉眼观察、磁共振成像（MRI）和组织学染色显著促进了大鼠软骨缺损模型的软骨再生。我们认为，cytoplasts^CXCR4在改善软骨细胞MQC和精确靶向方面具有巨大潜力，同时具备生物安全性、生物工程和生物制造的优点，因此具有临床转化的前景。

部分内容摘要

MSCs培养和CXCR4过表达

从大鼠骨髓中分离出MSCs，并在Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM；Gibco）中培养，添加10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素，培养条件为37°C和5% CO2。后续研究中使用了第二代和第三代MSCs。

为了转染CXCR4，使用了含有CXCR4-eGFP融合基因的慢病毒载体。简而言之，设置了适当的感染复数（MOI）值，包括60、80和100，以验证合适的MOI。

cytoplast^CXCR4的制备和表征

cytoplast^CXCR4的制备过程如图1a所示。首先通过流式细胞术分析对MSCs进行表征，显示其高表达阳性表面标志物（CD90和CD29）且不表达阴性表面标志物（CD11b），从而确认其身份（图1b）。然后通过绿色荧光报告基因表达验证MSCs过表达CXCR4（图1c）。成功转导基因后，通过

讨论

在本研究中，我们通过转染CXCR4基因和超速离心制备了一种表面修饰的去核MSC衍生物，称为cytoplast^CXCR4。结果表明，cytoplast^CXCR4的迁移能力比MSCs更强，同时保持了体外分泌外泌体的能力。此外，cytoplasts中保留了线粒体，并可以通过EVs转移。体外结果进一步证明了cytoplasts的积极作用

结论

本研究提出了一种通过恢复MQC来改善软骨细胞代谢从而促进软骨再生的有效策略。成功制备了一种去核MSC衍生物cytoplast^CXCR4，其特征是MQC得到改善、能够靶向损伤部位、生物安全性高且制备过程简单。研究表明，cytoplast^CXCR4在体外具有显著的迁移能力，并能主动分泌外泌体。此外，cytoplasts还能恢复受损的线粒体形态

CRediT作者贡献声明

Yubin Li：方法学、研究、数据分析。Menghan Chien：可视化、数据分析。Jingke Du：可视化、数据分析。Liya Ai：方法学、概念化。Tuo Wu：方法学、研究。Bo Zhang：方法学、数据分析。Mingze Du：研究、概念化。Fangxue Zhang：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析。Yun Dou：研究、数据分析、概念化。Haoling Guo：

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

F.Z.、Y.D.和Y.L.对本工作的贡献相同。

资助：本工作得到了国家自然科学基金（编号823B2057、82072428、82472428）、北京市自然科学基金（编号7212132）以及南昌大学第二附属医院的国家自然科学基金孵化计划（编号2025YNFY12003）的支持。