基于表面限制的CRISPR-Cas12a生物传感器，结合金属增强荧光技术，可实现SARS-CoV-2核衣壳蛋白的快速超灵敏检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Surface-Confined CRISPR-Cas12a Biosensor with Metal-Enhanced Fluorescence for Rapid and Ultrasensitive Detection of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein

CRISPR-Cas12a与纳米材料结合构建了一体化“on-off”生物传感器，实现SARS-CoV-2核衣壳蛋白高灵敏检测。通过金-二氧化硅核壳纳米颗粒（Au@SiO? NPs）的空间限域和金属增强荧光（MEF），系统在30分钟内达到67.2 fg/mL检测限，灵敏度较传统溶液体系提升2.5倍，并保持96-112%的回收率。关键词：CRISPR-Cas12a|金属增强荧光|纳米材料|病毒蛋白检测|单步骤检测|

　　

韩晓阳|陈宏|常一增|查静静|林青英·凯瑟琳|杨沫|黄秀红·德克斯特·王|尹博涵

中国海洋大学医学院与药学院，青岛，266003，中国

摘要

将CRISPR-Cas12a与纳米材料结合，开发出了强大的生物传感器，用于病毒蛋白检测，满足了即时诊断的迫切需求。然而，现有平台要么受到多步骤分离程序的阻碍，要么信号放大不足，限制了其灵敏度和实用性。在这里，我们报道了一种一体化的“开-关”生物传感器，该传感器通过将报告基底和CRISPR-Cas12a系统共定位在金-二氧化硅核壳纳米颗粒（Au@SiO₂ NPs）上，实现了快速且超灵敏的蛋白检测。以SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白为模型分析物，Au@SiO₂ NPs与（i）被N蛋白特异性适配体阻断的单链DNA激活剂，（ii）与auramine O（AO）复合的发光发夹DNA（DAP）以及（iii）短聚乙二醇（PEG）间隔剂进行了共功能化，以减轻空间位阻。由于与DAP的相互作用以及优化的荧光团-金属间距（约20纳米），该纳米平台显示出超亮的“开启状态”荧光（比游离AO增强860倍以上）。当目标蛋白结合时，适配体被置换，激活Cas12a进行转切割，破坏DAP的邻近结构及其与AO的相互作用，从而产生明显的“关闭状态”信号。在线性检测范围内，该系统的信号降低了约85%，信噪比（SNR）为83.89，比溶液相系统高出约2.5倍。该平台在30分钟内可实现67.2 fg/mL的检测限，具有优异的灵敏度、选择性和稳定性，并且在支气管肺泡灌洗液中表现良好。通过结合MEF驱动的信号放大和表面限定的CRISPR-Cas12a转切割，该平台建立了一种高效N蛋白检测的分散策略。

引言

由严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）、猴痘（Mpox）和甲型流感等病毒引起的全球传染病负担，突显了快速、灵敏和便捷诊断的迫切需求（Lamers等人，2022年；Ulaeto等人，2023年；Medina等人，2011年）。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）仍然是特异性的金标准，但其对复杂仪器和受过培训人员的依赖限制了其在即时诊断中的应用（Yang等人，2004年）。抗原检测针对病毒的特征蛋白，提供了一种快速且操作可行的替代方法。然而，传统格式存在固有局限性：酶联免疫吸附测定虽然灵敏，但劳动强度高且成本高昂（Orooji等人，2021年），而侧向流动测定虽然快速且无需设备，但灵敏度不足（Bishop等人，2019年）。因此，迫切需要开发简单、快速且超灵敏的抗原检测生物传感器，以促进早期诊断。

将成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关核酸酶（如Cas12a）与分析方法结合，已成为生物传感器开发的一种有前景的策略。在CRISPR RNA（crRNA）引导下识别目标DNA后，Cas12a被激活并开始单链DNA（ssDNA）的伴随和非特异性转切割（Yin等人，2022年；Chen等人，2024年）。为了将这种针对核酸的系统适应于蛋白检测，引入了多种连接器，如适配体（Zhao等人，2021年；Zhang等人，2025年）、适配体-ssDNA偶联物（Li等人，2021年）、DNA酶（Ding等人，2023年）和抗体（Zhu等人，2023年），将蛋白结合事件转化为ssDNA激活剂的暴露，从而实现Cas12a介导的转切割。基于荧光的读数方法由于具有定量精度而被广泛采用（Chen等人，2023年）。例如，Qiao等人开发了一种基于CRISPR-Cas12a的荧光生物传感器，该传感器依赖于目标毒素与适配体的竞争性结合，这会破坏crRNA-适配体双链的形成并抑制Cas12a对荧光团-淬灭剂ssDNA底物的转切割，从而实现毒素的定量（Qiao等人，2023年）。尽管这些策略能够实现蛋白检测，但它们的分析灵敏度通常受到传统溶液相系统中单一CRISPR/Cas12a介导的放大层的限制，没有额外的荧光增强或空间组织来放大信号输出（Song等人，2024年）。因此，需要额外的策略来增强荧光信号对比度并提高反应效率。

最近的研究致力于通过纳米技术辅助的信号放大来优化基于CRISPR-Cas12a的传感性能。纳米材料具有高的表面积与体积比，为DNA链提供了出色的负载能力，放大了目标蛋白与激活剂ssDNA链的比例。Munusamy等人开发了一种“开-关”荧光CRISPR-Cas12a生物传感器，该传感器利用目标蛋白介导的抗体修饰磁珠和纳米颗粒（NP）-双链DNA偶联物的组装，随后通过热释放ssDNA来激活Cas12a并产生荧光信号（Munusamy等人，2025年）。尽管该检测方法灵敏度高，但需要多个孵育和分离步骤，完成时间超过6小时，增加了工作流程的复杂性，可能限制了其在即时诊断中的应用。另一方面，如金（Au）纳米颗粒等金属纳米颗粒因其明显的表面等离子体共振（LSPR）效应而被用于构建光学报告器。通过控制荧光团与金属纳米颗粒表面之间的距离，可以通过金属增强荧光（MEF）来淬灭或增强荧光（Mayer等人，2011年；Hutter等人，2004年）。Choi等人设计了一种一步式CRISPR-Cas12a核酸生物传感器，使用尺寸不匹配的AuNPs通过工程DNA连接器连接，实现了基于距离的荧光调制，包括淬灭和MEF（Choi等人，2021年）。这种双级放大显著提高了荧光变化的幅度，相比传统的荧光团-淬灭剂探针。此外，将Cas12a及其ssDNA报告基底限制在纳米颗粒表面进一步促进了转切割（Zhang等人，2024年）。尽管取得了这些进展，但LSPR介导的荧光调制和CRISPR-Cas12a系统的空间限制的协同组合尚未被用于提高蛋白检测性能（表S1），这为下一代生物传感器的开发提供了有希望的机会。

在这里，我们报道了一种快速且超灵敏的“开-关”生物传感器，该传感器将CRISPR-Cas12a和基于MEF的报告基底定位在金-二氧化硅核壳纳米颗粒（Au@SiO₂ NP）上，用于蛋白检测（图1）。通过在Au@SiO₂ NP表面共定位激活剂链、荧光报告基底和Cas12a机制，该平台实现了双重放大：（1）通过荧光团-DNA相互作用结合优化的MEF增强荧光；（2）空间限定的Cas12a转切割。与依赖多步骤分离工作流程或缺乏荧光信号放大的生物传感策略相比，我们的生物传感平台在单次孵育和一体化的格式下运行，能够在30分钟内直接触发荧光衰减，具有高信号对比度。

作为模型检测系统，我们使用高亲和力适配体针对SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白（Han等人，2022年）。ssDNA激活剂共价固定在Au@SiO₂ NP表面，最初与N蛋白适配体杂交。荧光报告基底包括与auramine O（AO）复合的发光发夹DNA（DAP-10-42，称为DAP），形成DAO复合体（Kato等人，2016年）。将DAO复合体连接到Au@SiO₂ NP（DAO–Au@SiO₂ NP），并优化荧光团-金属间距，可诱导MEF，产生比游离AO高得多的荧光。虽然DNA的固定引入了空间位阻，可能阻碍Cas12a接触激活剂，但加入分子量为350的聚乙二醇（PEG）间隔剂提高了信噪比（SNR），比无PEG配置高约5倍。在没有N蛋白的情况下，DAO–Au@SiO₂ NP保持最大荧光，而适配体-激活剂双链阻止了Cas12a的激活。N蛋白由于亲和力更强而解离适配体，释放激活剂。Cas12a/crRNA复合体随后与暴露的表面连接激活剂结合，局部切割邻近的DAP环结构，并将AO释放到溶液中，导致荧光强度与N蛋白浓度成正比减少。

如表S2所总结的，先前报道的基于CRISPR/Cas的蛋白生物传感器的检测限主要在pg/mL–ng/mL范围内，包括电化学、比色和荧光格式。相比之下，我们的系统在30分钟内实现了67.2 fg/mL的检测限（LOD），保持了宽广的线性范围（500 fg/mL–10 ng/mL），并在生物样本中表现出高回收率（96–112%）。通过将MEF驱动的荧光放大与CRISPR-Cas12a系统的纳米级空间限制相结合，这种策略建立了一个多功能框架，用于快速且超灵敏的蛋白检测，具有在即时传染病诊断中的潜在应用。

Au@SiO₂ NP的优化以实现通过MEF的超亮DAO报告

我们首先证明，将AO与DAP复合显著增强了水溶液中的AO荧光，而将AO与随机DAP序列（Scr-DAO）混合则几乎没有变化，这一点通过荧光发射光谱和540 nm处的峰值强度得到了证实（图2A–C）。DAO复合体在475 nm和540 nm处显示出特征性的激发和发射最大值。其荧光在365 nm紫外（UV）灯下容易观察到，与AO明显不同

结论

我们开发了一种空间工程化的CRISPR-Cas12a生物传感平台，将N蛋白检测从传统的溶液相反应转化为表面限定的纳米级过程。通过在Au₄₀@SiO₂ NPs上精调的MEF场中共定位CRISPR-Cas12a机制和明亮的报告基底（DAO），该平台将等离子体荧光放大与局部转切割集成在一个一体化的系统中。DAO复合体提供了超亮的“开启状态”信号

CRediT作者贡献声明

韩晓阳：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理。陈宏：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理。林青英·凯瑟琳：方法学。杨沫：监督，资金获取。常一增：方法学。查静静：验证。黄秀红·德克斯特·王：撰写——审稿与编辑，监督，概念化。尹博涵：撰写——审稿与编辑，监督，概念化

未引用的参考文献

Lamers和Haagmans，2022年；Medina和García-Sastre，2011年；Yang和Rothman，2004年；Zhu和Zhao，2023年；Mayer和Hafner，2011年；Hutter和Fendler，2004年；Li等人，2021年；Ramirez等人，2025年。

数据可用性

数据将应要求提供。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（32501158）、中国海洋大学的启动资金（862401013154和862401013155）、青岛海洋科学技术中心海洋药物与生物制品实验室（编号：LMDBCXRC202401和LMDBCXRC202402）、山东省泰山学者青年专家计划（tsqn202306102和tsqn202312105）、山东省海外优秀青年学者计划（2024HWYQ-042和