阐明TDP-43的线粒体定位信号M3的构象动态，并利用分子对接和模拟技术寻找潜在的结合剂

《Computational Biology and Chemistry》：Elucidating the conformational dynamics of the mitochondrial localization signal, M3, of TDP-43 and accessing potential binders using molecular docking and simulation

该研究通过虚拟筛选评估2115种FDA批准的小分子与TDP-43 M3区域的结合能力，发现维生素D3（胆钙化醇）能有效结合，并通过分子动力学模拟验证其结合稳定性，为抑制TDP-43异常 mitochondrial定位提供新策略。

　　

拉姆库马尔·巴拉吉（Ramkumar Balaji）|希曼舒·乔希（Himanshu Joshi）|巴斯安特·K·帕特尔（Basant K Patel）

印度海得拉巴印度理工学院生物技术系，坎迪（Kandi），桑加雷迪（Sangareddy），特伦甘纳邦 – 502284，印度

摘要

RNA/DNA结合蛋白TDP-43在线粒体中的异常定位与肌萎缩侧索硬化症（ALS）有关，这可能影响线粒体动态并导致神经元毒性。此前已有报道指出可以抑制TDP-43在细胞质中的聚集，但其对TDP-43在线粒体中异常定位的影响仍有待研究。研究发现TDP-43中的三个内部肽序列（M1、M3和M5）能够促进其在线粒体中的定位。携带这些序列的肽能够阻止TDP-43进入线粒体，并缓解TDP-43对神经元造成的毒性。在本研究中，我们通过虚拟筛选方法评估了2,115种FDA批准的小分子与TDP-43的M3区域（氨基酸序列：146-150）结合的潜力。M3区域属于RNA识别基序-1（RRM-1），因此我们对TDP-43的RRM结构域在显式溶剂水中的两种不同起始构象进行了多原子模拟，以了解目标M3区域的动态特性。模拟轨迹分析表明，M3区域相对于RRM1-2结构域的其他部分较为刚性且不易被访问。通过虚拟筛选发现的胆钙化醇（维生素D3）能够在多种对接策略下与M3区域结合，尽管在大多数构象中该区域的可访问性较差。在四个一微秒的MD模拟中，维生素D3始终稳定地与M3区域结合。综上所述，我们的研究提出维生素D3可能作为TDP-43 M3区域的潜在结合剂，从而抑制其在线粒体中的异常定位。

引言

神经退行性疾病是一类重要的神经系统疾病，其特征是细胞在有丝分裂后死亡。在生理条件下，这些细胞能够抵抗有丝分裂信号并保持长期存活和持续功能。长期的细胞应激会导致神经元损伤，进而引发细胞凋亡和神经退行性变。蛋白质错误折叠和聚集是导致这种长期细胞应激的重要原因。特定蛋白质的基因突变或蛋白质折叠机制的突变会导致蛋白质错误折叠，进而引发线粒体功能障碍、炎症等问题，最终增加活性氧（ROS）的产生并导致细胞凋亡（Gandhi等人，2019年）。基因突变发生在不同的大脑区域，根据受影响的细胞类型，会导致不同的神经退行性疾病。阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症（ALS）是主要的神经退行性疾病。肌萎缩侧索硬化症是一种影响运动神经元的疾病，其表现因受影响的运动神经元类型和身体部位而异，临床症状从肢体萎缩到反射亢进、舌肌萎缩或言语功能障碍不等（Taylor等人，2016年）。已有研究表明，多种蛋白质和遗传因素与ALS有关，包括超氧化物歧化酶（SOD1）、TAR-DNA结合蛋白（TDP-43）、融合蛋白（FUS）和视神经蛋白（OPTN）等基因的突变（Kiernan等人，2011年；Neumann等人，2006年）。

TDP-43是一种由414个氨基酸组成的DNA/RNA结合蛋白，包含三个主要结构域：N端结构域、两个保守的RNA识别基序（RRM-1和RRM-2），它们串联排列但由一个短连接区分隔；以及C端结构域，该结构域包含无序区域。这三个结构域还包含其他具有生理功能的区域，如N端结构域的核定位信号（NLS）和RRM2结构域的核输出信号（NES），随后是富含谷氨酰胺/天冬酰胺（Q/N）的区域，以及C端结构域的富含甘氨酸的区域。TDP-43全长中散布着多个用于线粒体定位的内部基序（M1-M6），这些基序由疏水性氨基酸组成。然而，只有N端结构域的M1、RRM1结构域的M3和C端结构域的M5这三个基序被认为足以促进TDP-43在线粒体中的定位并增强其毒性（Prasad等人，2019年；Wang等人，2016年）。据报道，在ALS/FTLD患者的样本中，TDP-43以泛素化或过度磷酸化的形式存在于细胞质中（Neumann等人，2006年）。外源引入或过表达的野生型（WT）或突变型TDP-43在细胞质中的聚集会在ALS的各种细胞模型中增强毒性（Armakola等人，2011年；Ash等人，2010年；Cascella等人，2022年）。

已有研究显示，ALS患者的脊髓运动神经元中存在TDP-43的线粒体定位，抑制TDP-43的线粒体定位可以降低HEK293细胞的毒性。然而，在线粒体内，TDP-43能够稳定编码电子传递链（ETC）蛋白的RNA转录本（Izumikawa等人，2017年）。因此，TDP-43在细胞质和线粒体中与RNA的相互作用方式决定了其致病性。此外，在过表达TDP-43的HEK293T细胞中，线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放会触发与ALS相关的过度炎症反应（Yu等人，2020年）。

我们之前的研究还发现，删除一个与线粒体依赖性凋亡途径相关的基因（YBH3）、周期蛋白C（CNC1）和一个与线粒体分裂相关的蛋白（DNM1）可以在酵母模型中缓解TDP-43的毒性（Bharathi等人，2021年）。此外，在抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸的存在下，TDP-43的25千道尔顿片段在酵母中的毒性得到减轻，这表明氧化应激可能在毒性增强中起作用（Bajpai等人，2024年）。这些研究表明，TDP-43的线粒体导入及其相关的氧化应激可能是治疗相关神经退行性疾病的潜在靶点。

化学合成或生物提取的小分子以及其他生物分子（如肽和反义寡核苷酸ASO）已被广泛用于筛选，以靶向TDP-43及其他在各种蛋白质病中发现的蛋白质的聚集。携带M1、M3和M5序列的肽抑制剂PM1、PM3和PM5已被证明可以通过与线粒体导入复合体结合来竞争性地抑制TDP-43的线粒体定位（Wang等人，2016年）。我们实验室之前的研究还发现了小分子抑制剂AIM4和EGCG，它们通过生化测定和计算机模拟技术抑制了TDP-43的聚集（Girdhar等人，2020年；Meshram等人，2024年）。这些抑制剂对TDP-43在线粒体中的定位的影响仍有待进一步研究，它们在更高动物模型中的治疗效果也尚未确定。因此，直接针对TDP-43在线粒体中定位的抑制剂筛选也是必要的。

基于结构的虚拟药物筛选被广泛用作传统实验室药物筛选的替代方法。这种计算技术减少了实验室中测试的药物数量，从而降低了成本和劳动强度（Gao等人，2023年）。分子对接是虚拟药物筛选中的一种方法，用于模拟大分子之间的相互作用以及小分子与大分子之间的相互作用。基于原子间相互作用的物理原理开发的数学模型为另一种有价值的虚拟药物筛选技术——分子动力学（MD）模拟奠定了基础（Hollingsworth和Dror，2018年）。MD模拟用于采样生物分子（如蛋白质）在不同环境条件下与其他分子相互作用时的构象变化（Hollingsworth和Dror，2018年）。

在本研究中，我们旨在评估FDA批准的小分子与TDP-43 RRM1结构域中的M3信号序列的结合能力，从而提出可能被重新利用来抑制TDP-43在线粒体中定位的小分子。我们对2,115种FDA批准的小分子进行了虚拟筛选。为了了解目标M3区域的动态特性，我们在显式溶剂存在下对TDP-43的RRM结构域进行了全原子MD模拟。使用AutoDock Vina对M3区域进行了虚拟筛选，并使用AutoDock 4.2对得分最高的分子进行了盲对接，结果显示只有四种分子能够与M3区域结合。进一步对这四种分子与全长TDP-43模型进行筛选后，发现只有胆钙化醇/维生素D3（ZINC ID：ZINC4474460）和阿托坎德（Atacand，ZINC ID：ZINC3782818）能够与M3区域结合。通过使用多种起始构象的全原子MD模拟进一步评估了维生素D3与M3区域的结合稳定性。

先前有研究表明，维生素D3可以在帕金森病（PD）和阿尔茨海默病（AD）的小鼠模型中减轻氧化应激和神经炎症（Calvello等人，2017年；Lin等人，2022年；Mehrabadi和Sadr，2020年）。然而，尽管这些患者的维生素D3血清水平较低，口服补充维生素D3并未改善ALS患者的运动功能障碍（Trojsi等人，2020年）。尽管如此，仍建议ALS患者补充维生素D3，因为动物模型和临床研究中有报告显示维生素D3可以改善认知和运动功能。这种差异可能归因于补充维生素D3的时间以及潜在的基因型和环境因素。因此，我们提出维生素D3可能作为TDP-43 M3区域的潜在结合剂，其抑制TDP-43在线粒体中的定位并降低其毒性的潜力值得进一步研究。结合之前关于细菌蛋白和CDK9抑制的研究，当前的研究结果进一步证明了计算建模在指导疾病相关蛋白调节剂发现方面的多功能性（Shahraki等人，2024年；Taghizadeh等人，2024年；Taghizadeh等人，2022年）

部分摘要

RRM1-2结构域的分子动力学模拟及M3区域动态研究

使用Groningen机器化学模拟（GROMACS）软件进行了全原子MD模拟，该软件基于GNU通用公共许可证。在150 mM NaCl的显式溶液中，对RRM1-2无辅基结构（PDB ID：4BS2 – 氨基酸序列：102-269）进行了三次各持续1微秒的模拟。蛋白质的拓扑结构是使用CHARMM36-july2022力场通过内置的pdb2gmx命令生成的。复合体被溶解在一个十二面体盒子中

在显式水溶剂中对RRM1-2结构域进行的全原子MD模拟表明，M3区域相对较为刚性，波动较小且溶剂可及性较低

RRM结构域的每个串联结构域都具有β1-α1-β2-β3-α1-β4-β5的架构。TDP-43的线粒体定位信号M3位于RRM1结构域的β3区域（图S1a）。RRM结构域无辅基结构的三次模拟在起始原子速度上有所不同，但在构象上保持一致。在模拟过程中，无辅基结构与其溶液NMR结构存在偏差

结论

先前有研究指出，TDP-43在哺乳动物ALS细胞模型中的异常线粒体定位会增加其毒性。肽抑制剂抑制这种导入可以挽救细胞免受TDP-43的毒性，因此TDP-43的线粒体导入可能是一种潜在的治疗干预措施。在本研究中，使用不同的初始种子速度对RRM1-2溶液的NMR结构进行了独立平衡模拟

CRediT作者贡献声明

巴斯安特·K·帕特尔（Basant K Patel）：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，概念构思。希曼舒·乔希（Himanshu Joshi）：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，研究，概念构思。拉姆库马尔·巴拉吉（Ramkumar Balaji）：撰写 – 审稿与编辑，撰写原始草稿，研究。

利益冲突声明

所有作者声明不存在利益冲突

致谢

我们感谢印度海得拉巴印度理工学院在研究基础设施和支持方面的支持，该学院由印度教育部资助。RB感谢印度政府的总理研究奖学金（PMRF）。希曼舒·乔希感谢印度政府的SERB提供的研究资助（SRG/2022/002109）和DST Inspire奖学金（IFA20-PH-256）。我们感谢印度海得拉巴印度理工学院的NSM PARAM Seva提供的超级计算资源。巴斯安特·K·帕特尔感谢印度政府的SERB提供的研究资助（SERB/CRG/2021/006856）。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突