《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》：Anticancer, antimicrobial, and probiotic properties of bacterial strains derived from edible snails Cornu aspersum and Eobania vermiculata gut microbiota
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为开发新型益生菌资源，研究人员从食用陆生蜗牛（庭园蜗牛Cornu aspersum和巧克力带蜗牛Eobania vermiculata）的肠道微生物组中，分离并鉴定出两株具有潜在益生功能的细菌：木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和海氏肠球菌（Enterococcus hirae）。研究表明，这两株菌不仅具有良好的耐酸、耐胆盐等益生特性，还对多种病原菌表现出抗菌活性，并可通过诱导凋亡对结肠癌细胞（Caco-2）产生抗癌效果，为开发新一代益生菌（NGPs）和功能食品提供了有价值的候选菌株。
在我们身边，看似普通的庭园蜗牛和巧克力带蜗牛，其小小的躯体内可能蕴藏着巨大的生物医学“宝藏”。陆地蜗牛是生态系统中重要的一员，它们独特的肠道微生物群落对其生理、生态及环境适应至关重要。近年来，随着对微生物组研究的深入，研究人员开始从各种非常规来源——包括昆虫、海洋生物乃至蜗牛——中寻找具有特殊功能的细菌，以开发新一代益生菌（Next-Generation Probiotics, NGPs）或生物活性物质。这些NGPs被寄予厚望，有望用于治疗胃肠道疾病、调节免疫，甚至对抗癌症。那么，从可食用蜗牛的肠道中，能否找到这样的“宝藏菌株”呢？
为了回答这个问题，一项发表在《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》上的研究，对两种常见的食用陆生蜗牛——庭园蜗牛（Cornu aspersum）和巧克力带蜗牛（Eobania vermiculata）的肠道菌群进行了深入探索。研究人员不仅系统描绘了这两种蜗牛肠道微生物的组成图谱，更从中成功分离出两株具有显著益生、抗菌及抗癌潜力的细菌，为开发新型生物制剂和功能产品打开了新思路。
为开展这项研究，作者主要运用了以下几个关键技术方法：首先，从埃及吉萨采集的蜗牛粪便样本中，通过培养法分离纯化细菌。其次，利用16S rRNA基因测序技术对分离菌株进行分子鉴定，并对蜗牛肠道样本进行高通量测序，以分析其微生物群落结构（包括α和β多样性分析）。再者，通过一系列体外实验评估分离菌株的安全性（如溶血、DNA酶活性检测和抗生素敏感性试验）和益生特性（如耐酸性、耐胆盐性、表面疏水性、自凝聚性及抗菌活性）。最后，采用MTT法检测菌株的无细胞上清液对结肠腺癌细胞（Caco-2）的细胞毒性，并通过细胞形态学观察和免疫组织化学法检测凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，以评估其抗癌活性及可能机制。此外，还使用酚硫酸法对菌株产胞外多糖（Exopolysaccharide, EPS）的能力进行了定量。
研究结果
3.1 利用16S rRNA基因NGS（新一代测序）进行蜗牛肠道菌群分析
通过对两种蜗牛肠道菌群的高通量测序分析发现，两者的微生物组成存在显著差异。在门（Phylum）水平上，变形菌门（Pseudomonadota）、拟杆菌门（Bacteroidota）和放线菌门（Actinomycetota）是主导类群，但在两种蜗牛中的相对丰度不同。加权UniFrac主坐标分析（PCoA）显示，两种蜗牛的肠道菌群显著分离。此外，在C. aspersum的肠道中发现了更多样化的细菌属，其中包含许多已知具有益生、生物修复或纤维素降解功能的菌属，如假单胞菌属（Pseudomonas）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）等。
3.2 细菌分离株的分子鉴定
从蜗牛肠道菌群中成功分离出两株细菌，经16S rRNA基因测序鉴定，分别为木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus, S. xylosus）和海氏肠球菌（Enterococcus hirae, E. hirae）。
3.3 分离菌株无DNA酶及溶血活性
安全性评估显示，E. hirae和S. xylosus均不产生DNA酶，且无溶血活性，表明这两株菌不具备这些常见的致病性特征。
3.4 评估E. hirae和S. xylosus对Caco-2细胞的细胞毒作用
MTT细胞活力实验表明，两株菌的无细胞上清液（CFS）对结肠癌细胞Caco-2均具有剂量依赖性的细胞毒性，能显著抑制细胞存活。其中，E. hirae的半数抑制浓度（IC50）低于S. xylosus，显示出更强的细胞毒性。
3.5 形态学凋亡评估
用IC50浓度的菌株CFS处理Caco-2细胞后，经H&E染色观察，发现细胞出现了明显的凋亡形态学特征，如细胞缩小、核染色质固缩（核固缩）、核碎裂和膜起泡等。其中，E. hirae处理组的变化更为显著。
3.6 IC50处理对Caspase-3表达的影响（免疫组化检测）
免疫组化结果显示，未经处理的对照组细胞不表达Caspase-3蛋白。而经E. hirae和S. xylosus的CFS处理后，Caco-2细胞中均出现了棕褐色的Caspase-3阳性染色，表明凋亡通路被激活。E. hirae处理组的细胞凋亡指数显著高于S. xylosus处理组。
3.7 测定两株菌的EPS（胞外多糖）产量
采用酚硫酸法测定，两株菌均能产生EPS，其中E. hirae的产量略高于S. xylosus。
3.8 分离菌株的抗菌药耐药性谱
抗生素敏感性试验显示，两株菌对万古霉素、左氧氟沙星、庆大霉素、氯霉素和阿莫西林/克拉维酸均敏感，对四环星表现为中介，未发现多重耐药性，符合益生菌的安全性要求。
3.9 E. hirae和S. xylosus对胆盐和酸性条件的耐受性
两株菌在pH 2.5的酸性条件下孵育3小时后，活菌数仍能保持在106CFU/mL以上，表现出良好的胃酸耐受性。在含有0.3%和0.7%胆盐的培养基中，两株菌的生长曲线与不含胆盐的对照组无显著差异，表明其能耐受肠道胆盐环境。
3.10 E. hirae和S. xylosus的抗菌活性
通过琼脂覆盖法检测，两株菌对多种参考病原菌，包括金黄色葡萄球菌（S. aureus）、大肠杆菌（E. coli）、伤寒沙门氏菌（S. typhi）和铜绿假单胞菌（Ps. aeruginosa）均表现出不同程度的抑制活性，其中E. hirae的抗菌活性总体更强。
3.11 分离菌的表面疏水性和自凝聚性
细胞表面疏水性测定显示，E. hirae的疏水性高于S. xylosus。自凝聚实验表明，两株菌在24小时内均表现出较高的自凝聚能力，这是益生菌在肠道定植的有利特性。
研究结论与意义
本研究首次系统地揭示了C. aspersum和E. vermiculata这两种食用陆生蜗牛的肠道微生物组多样性，并证实了它们作为有益细菌储存库的潜力。尽管生活在相似农业环境中，两种蜗牛的肠道菌群结构存在显著差异，这可能与宿主特异性有关。研究最大的亮点在于，从该特殊生境中成功分离并鉴定出两株具有多方面益生特性的细菌：E. hirae和S. xylosus。
这两株菌不仅通过了安全性测试（无溶血、无DNA酶活性、无有害抗生素耐药性），更展现出卓越的益生菌“天赋”：它们能顽强地存活于模拟胃液（低pH）和肠道（胆盐）的恶劣环境中；能够有效抑制多种常见病原菌的生长；更重要的是，它们分泌的代谢产物能诱导人结肠癌细胞发生凋亡，展现出潜在的抗癌活性，其中E. hirae的效果更为突出。此外，它们良好的表面疏水性和自凝聚性，暗示其具有在肠道黏膜定植的潜力。
该研究的重要意义在于，它将目光投向了蜗牛这一非常规但潜力巨大的微生物资源库。研究成果不仅拓展了我们对无脊椎动物，特别是软体动物肠道微生物生态功能的认知，更重要的是为开发新一代益生菌、功能性食品添加剂或具有抗菌、抗癌活性的生物制剂提供了全新的、高质量的候选菌株。尤其是E. hirae，作为一种已被研究报道具有免疫调节功能的NGPs候选菌，本研究进一步丰富了其作为多功能益生菌的证据。当然，这些有希望的体外结果仍需后续的动物体内实验和临床试验来验证其有效性与安全性，并需要进一步解析其活性物质（如细菌素、EPS等）的具体成分和作用机制。但毫无疑问，这项研究为从自然界“小众”生物中挖掘“大众健康”解决方案开辟了一条新颖而有趣的途径。
