利用全外显子测序技术识别糖尿病肾病患者中的新型基因组变异：一项初步研究

《Frontiers in Endocrinology》：Identification of novel genomic variants in diabetic nephropathy patients using whole-exome sequencing: a pilot investigation

　　摘要
背景：2型糖尿病（T2D）对医疗系统来说是一个挑战。这是一种代谢性疾病，其特征是血糖升高，如果控制不当，会导致严重的并发症。这些并发症包括糖尿病肾病（DN）、神经病变、视网膜病变以及心血管疾病（CVDs）。T2D由遗传、环境和生活方式的风险因素引起。因此，区分T2D的遗传风险位点和那些特别容易导致DN的风险位点至关重要，这可能有助于在临床验证这些标记后进行个性化的风险评估和提供有根据的遗传咨询。本初步研究的目的是使用全外显子测序（WES）来检测与DN相关的候选基因。

方法：我们研究了26名（8名女性和18名男性）临床诊断为DN的患者中特定基因变异与DN之间的关系。我们使用Illumina NovaSeq 6000平台进行了WES。数据通过一系列生物信息学工具进行分析，包括FASTQC、Trimmomatic、Ensemble、Bowtie2、GATK、SAMtools、Python Comut、T2Diacod、StringDB、Gene Ontology和KEGG。

结果：THADA、NOTCH4和TNXB基因符合全基因组阈值，并显示出最小的T2D关联。特定于DN的基因包括SP2、CDH3和ARFGEF2，它们达到了提示性的DN阈值，但低于T2D的显著性水平。共享基因INSR、HLA-DQB1和CRHR1显示出可能与T2D和DN相关的关联，使它们成为DN的关键候选基因。这些基因变异可能影响的通路和生物过程包括炎症通路、脂质和葡萄糖代谢、PI3K-Akt信号通路、胰岛素信号通路等。此外，我们在SRCAP、PHKG2、TNFRSF6B和PBX2基因中发现了潜在的新错义变异。

结论：我们的探索性研究发现了SRCAP、PHKG2、TNFRSF6B和PBX2基因中的候选新变异，这些变异可能与DN有关。这些结果表明这些基因可能参与了DN的发展。然而，需要通过大规模队列和功能性蛋白质研究进一步验证这些变异作为潜在生物标志物的临床效用。

1 引言
糖尿病（DM）是一种以血糖升高为特征的代谢性疾病，在沙特阿拉伯王国（KSA）和全球范围内都是一个医疗问题（1, 2）。糖尿病的类型包括1型糖尿病（T1D），这是由于T淋巴细胞对胰腺β细胞的自身免疫破坏引起的（3）。第二种是2型糖尿病（T2D），由胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能受损引起（4）。第三种是妊娠糖尿病，发生在妊娠的第二晚期或第三早期，同样伴有胰岛素抵抗和胰腺β细胞功能缺陷（5）。还有一种是青年成熟期糖尿病（MODY），这是一种常染色体显性遗传病，具有正常的β细胞功能，但某些基因（如肝细胞核因子（HNF）和葡萄糖激酶（GCK）发生突变（6）。此外，还有新生儿糖尿病，由ABCC8或KCNJ11基因突变引起，导致胰腺发育异常和胰腺β细胞改变（7）。糖尿病的诊断标准是空腹血浆血糖水平≥126 mg/dL、血红蛋白A1C（HbA1c）水平≥6.5%、随机血浆血糖≥200 mg/dL，或75克2小时口服葡萄糖耐量试验中血浆血糖水平≥200 mg/dL（8）。糖尿病对患者及其家庭有社会经济影响，因为它有非常严重的并发症，如糖尿病肾病（DN）、糖尿病视网膜病变、糖尿病神经病变、糖尿病足和心血管疾病（CVDs）（9）。DN或糖尿病肾病（DKD）是最重要的糖尿病并发症之一，也是终末期肾病（ESRD）的重要原因（10）。通常，DN在早期表现为高滤过和蛋白尿；随后肾功能逐渐恶化（10）。患有肾病的糖尿病患者死亡率是没有肾病的糖尿病患者的约30倍（10）。此外，许多DN患者在发展为ESRD之前就因心血管并发症而死亡（10）。早期DN的筛查是通过每年检测尿中的白蛋白/肌酐比率来进行的，诊断则通过尿液中白蛋白分泌的反复增加来确认（11）。全基因组关联研究和疾病关联预测的研究扩大了我们对与糖尿病、CVDs、癌症等疾病相关的风险位点的理解（12–15）——例如，Salem等人（16）报告称COL4A3错义突变（rs55703767 G>T (Asp326Tyr)会导致T1D患者的Alport综合征（16）。此外，Jin等人（17）报告称TRIM27和HLA-A基因可能是T1D韩国患者的DN候选基因。此外，含有FERM结构域的3（FRMD3）rs1888747 SNP与不同人群中的DN相关（18–20）。此外，产生血管紧张素II的ACE基因的多态性也被报道与DN相关（21, 22）。在这项初步研究中，我们使用全外显子测序（WES）调查了沙特人群中T2D患者的DN相关基因。识别和表征新的DN风险位点将有助于预测或检测易感个体或人群，从而帮助预防和治疗DN。

2 材料与方法
2.1 研究人群
本研究获得了西北地区武装部队医院研究伦理委员会的伦理批准（批准编号R & RE C2016-115）。病例（表1）来自塔布克市King Khaled医院的门诊部，均为患有糖尿病肾病（DN）的患者（26例，18名男性和8名女性）（23），年龄在40至60岁之间。他们是KSA的公民。纳入标准包括诊断为DN、血清肌酐升高、估计的肾小球滤过率（eGFR）增加或蛋白尿。我们排除了有其他糖尿病并发症或任何重大慢性疾病（如恶性肿瘤或心血管疾病）的患者。血液化学和血液学检查是常规临床程序的一部分。所有方法均按照相关指南和规定进行。所有受试者在采集血液样本前都提供了知情同意。通过标准问卷记录了社会人口统计特征（如年龄、性别和生活方式）。

表1
特征
N = 26
年龄（岁）：63（59, 66）
年龄组：
>60岁：16（61.53%）
40–60岁：10（38.46%）
性别：
女性：8（30.76%）
男性：18（69.23%）
T2D持续时间（年）：9.00（7.00, 10.00）
空腹血糖：156（145, 160）
HBA1c（%）：7.40（7.05, 7.50）
HBA1c组：
糖尿病：24（90.30%）
对照糖尿病：2（7.69%）
体重指数（BMI）（kg/m2）：27.68（22.24, 30.05）
BMI组：
正常：10（38.46%）
肥胖：6（23.07%）
超重：10（38.46%）
甘油三酯（mg/dL）：
<150 mg/dL：2（7.70%）
≥150 mg/dL：24（92.30%）
总胆固醇（mg/dL）：
<200 mg/dL：12（46.15%）
>200 mg/dL：14（53.84%）
HDL-C（mg/dL）：
<40 mg/dL：15（57.69%）
≥40 mg/dL：11（42.30%）
LDL-C（mg/dL）：
>190 mg/dL：13（50%）
160–190 mg/dL：10（38.46%）
100–160 mg/dL：0（3.11%）
VLDL（mg/dL）：
>40 mg/dL：10（38.46%）
5–40 mg/dL：16（61.53%）
肌酐（mg/dL）：2.50（1.90, 2.60）
胆红素（mg/dL）：1（0, 2）
AST（U/L）：30（20, 40）
ALT（U/L）：42（37, 48）
ALP（U/L）：97（73, 110）
估计的肾小球滤过率（eGFR）：
eGFR, mL/min per 1.73 m2：41.0（14.0–59.0）
尿白蛋白排泄（UAE），mg/g：
90.5（35.8–388.7）
30 mg/g：0
>30至300 mg/g：26
动脉高血压，%：90.3
血压：
收缩压（SBP）[mmHg]：150.0 [140.3–162.0]
舒张压（DBP）[mmHg]：87.0 [78.0–92.0]

2.2 样本收集和基因组DNA提取
每位患者和对照组个体都进行了静脉穿刺，抽取3至4毫升的外周血放入EDTA管中。使用DNeasy Blood Kit（Qiagen，德国）按照制造商说明进行基因组DNA提取。纯化后，DNA在-20°C下储存，直到基因分型。

2.3 全外显子测序和文库制备
所有26例病例和1例对照的DNA样本均进行了全外显子测序（WES）。文库制备按照Twist Human Core Exome 2.0 Kit说明书中的协议进行。测序在Illumina NovaSeq 6000平台上进行，生成2 × 250碱基对（bp）的配对末端读段。为了确保能够可靠地检测到变异，特别是与T2D和糖尿病肾病相关的罕见变异，测序深度设置为平均约100X。

2.4 测序数据的质量控制和预处理
首先使用FastQC（24）评估原始测序数据的质量，以识别伪影和整体读段质量。使用Trimmomatic（25）处理并移除低质量读段和接头序列。为了仅保留高质量数据用于后续分析，应用了严格的质量截止标准，保留Q-score >30的读段，而低于此阈值的读段被过滤掉。保留的高质量读段（每个样本约35至40百万个配对末端读段）再次使用FastQC进行分析，以确认所有技术伪影已被移除，从而确保用于研究DN相关基因变异的数据集的可靠性。这些高质量读段被映射到从Ensembl下载的人类参考基因组组装GRCh38.p14上。使用Bowtie2（27）将读段与参考基因组对齐。

2.5 变异调用和过滤
为了确保可靠的识别并减少假阳性，使用了两个独立的变异调用工具GATK（28）和SAMtools（29）对所有样本进行变异识别。这种交叉验证策略对于确保可靠的变异调用至关重要。
变异调用流程包括：
GATK流程：使用HaplotypeCaller（v4.3）同时识别SNPs和小INDELs。根据GATK最佳实践进行种系短变异发现后，我们对原始调用集进行了严格的过滤。对于SNPs，要求QD >2.0、FS <60.0、MQ >40.0和SOR <3.0；对于INDELs，阈值设定为QD >2.0和ReadPosRankSum >-20.0。
SAMtools流程：使用mpileup和bcftools调用分别识别SNPs和小INDELs，生成单独的变异调用格式（VCF）文件。只有同时被GATK和SAMtools识别的变异被保留下来进行进一步分析，这显著提高了变异集的可靠性。识别的变异主要分为SNPs和插入/缺失（INDELs）。分析了这些保留变异类的分布和特征，以确定与T2D和DN病例最相关的类型。共生成了26个变异谱型（26例DN病例和1例健康对照）。为了下游分析，通过排除与健康对照样本共享的所有变异，创建了一个统一的变异谱型，以突出DN队列中的疾病特异性遗传差异。

2.5 变异注释和影响预测
进行变异注释和功能分类，以优先考虑生物学上重要的变化。使用SNPEff程序对过滤后的VCF文件进行注释，该程序根据预测的影响将变异分为四个功能类别（30）。这些类别包括高影响（预测具有重大功能影响，通常导致功能丧失，如移码或无义变异）、中等影响（预测具有显著的非破坏性功能影响，如非同义错义突变）、低影响（预测主要是非破坏性或无害的，如同义突变）和修饰影响（预测具有非编码或最小影响，如内含区变异）。这种初步分类提供了可能改变蛋白质的事件的一般概念。为了进一步细化非同义编码SNPs的功能影响（属于中等影响类别），使用了SIFT（31）和PolyPhen-2（Polymorphism Phenotyping v2）工具（32）。将SnpEff影响类别与SIFT和PolyPhen-2得分相结合，采用了一种稳健的策略来优先考虑可能与T2D和DN相关的变异。
为了寻找DN中的可能新变异，我们将变异与广泛的公共基因组数据库进行了比对。如果候选变异存在于dbSNP、gnomAD（包括非芬兰欧洲、非洲和中东亚队列）、1000 Genome或ClinVar中，我们将其分类为“现有”。所有不在这些主要数据库中的变异被标记为“新”。为了评估携带候选变异的基因的进化约束，我们使用了gnomAD v4.1。具体来说，使用了pLoF（预测的功能丧失不耐受）得分来评估预测的功能丧失等位基因的缺失，得分>0.9表示对杂合子破坏的显著不耐受。

2.6 将WES发现与已知的T2D和DN关联联系起来
为了将WES识别的基因变异与我们的DN队列中的已知T2D和DN关联联系起来，我们将它们与来自2型糖尿病知识门户（T2DKP）（33）的T2D和DN的基因水平关联数据进行了映射。我们使用双向散点图可视化关联强度，其中轴分别代表T2D和DN的负对数P值（-log10P）。关键基因根据其重要性进行了分类和颜色编码：2型糖尿病（T2D）的全基因组阈值（-log10P ≥ 7.3）和糖尿病肾病（DN）的提示性阈值（-log10P ≥ 2.5），使我们能够快速识别出仅与T2D相关的患者变异基因（红色）、仅与DN相关的基因（蓝色）、同时与两者相关的基因（紫色）或两者都不相关的基因（灰色）。2.7 功能富集和通路分析为了将识别的遗传发现置于生物学背景中，我们进行了详细的功能注释和通路分析，特别关注携带高影响和中等影响变异的基因。我们使用StringDB来识别蛋白质-蛋白质相互作用基因，这有助于构建分子网络并推断携带变异的基因之间的功能关系。此外，使用Gene Ontology（GO）数据库和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库评估了突变基因的功能重要性，并利用StringDB分析工具在GO和KEGG以及Reactome类别中进行这种功能富集分析。这些综合数据库根据基因在关键细胞功能和代谢通路中的已知作用对基因进行分类，从而识别出受影响最显著的生物过程和通路，将我们的遗传变异与已知的疾病机制联系起来。为了控制多次统计测试中I型错误的膨胀，我们应用了Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）校正。只有经过FDR校正的p值（p < 0.05）的通路和生物过程被认为是统计学上显著的，确保了DN队列中识别出的分子特征的稳健性。2.8 统计考虑和敏感性分析由于这是一项针对区域队列中罕见和新颖变异的探索性研究，传统的常见变异关联（GWAS）功效计算不适用。因此，进行了敏感性分析以定义研究设计的发现限。样本量为26名患者（52个独立等位基因），平均目标覆盖深度为100X，该研究在变异检测方面具有很高的技术敏感性。这种配置提供了超过95%的功效，能够检测到至少一名携带次要等位基因频率（MAF）≥5.6%的变异者。此外，100X的深度确保了对超罕见和新颖变异的高信心调用（MAF < 1%），最小化了假阴性结果。这种敏感性水平对于旨在识别研究不足人群中的高影响候选基因的初步调查来说是科学上合适的。3 结果3.1 研究人群的临床特征研究队列包括26名2型糖尿病患者（T2D），其特征是年龄较大、男性占多数、疾病持续时间较长以及显著的多方面代谢紊乱。表1总结了这些临床特征，描绘了一个心血管和肾脏并发症高风险人群的详细情况。参与者的中位年龄为63岁（四分位数范围[IQR]：59, 66岁），其中近三分之二（62%）超过60岁，突显了该队列的老年人口特征。此外，大多数为男性（69%），这通常与特定的心血管代谢风险模式相关。患者患T2D的中位时间为9.0年（IQR：7.0, 10.0年），表明他们的病情具有慢性。虽然中位体重指数（BMI）为27.68 kg/m2（IQR：22.24, 30.05），表明超重状态，但体重类别的分布不均：38%超重，23%肥胖，表明大多数人（61%）体重超标。血糖控制指标显示广泛的未控制糖尿病。中位糖化血红蛋白（HbA1c）为7.40%（IQR：7.05, 7.50），中位空腹血糖为156 mg/dL（IQR：145, 160）。值得注意的是，92%的参与者根据其HbA1c水平被归类为患有明显的糖尿病，表明长期血糖控制失败。血脂异常几乎是普遍的，形成了高度致动脉粥样硬化的脂质环境。中位甘油三酯水平显著升高，为210 mg/dL（IQR：189, 242），92%的队列超过了临床阈值≥150 mg/dL。总胆固醇在100%的患者中≥130 mg/dL。中位低密度脂蛋白（LDL）胆固醇较高，为190 mg/dL（IQR：167, 216），其中一半（50%）的患者表现出非常高的水平（>200 mg/dL）。相反，保护性高密度脂蛋白（HDL）胆固醇通常较低，中位数为34 mg/dL（IQR：29, 48），54%的患者的水平<40 mg/dL。这些脂质发现共同表明了严重的代谢紊乱，远超简单的高血糖。除了血糖和脂质异常外，该队列还表现出靶器官损伤的迹象。中位肌酐水平升高，为2.50 mg/dL（IQR：1.90, 2.60），暗示了肾功能受损，这是慢性T2D的已知并发症。此外，中位肝酶（ALT：42 U/L，AST：30 U/L）升高，表明肝脏受到一定程度的影响，可能与普遍的代谢综合征有关。最后，观察到的中位血压读数（收缩压（SBP）：132 mmHg，舒张压（DBP）：139 mmHg）升高，为已经复杂的临床情况增加了高血压负担。本质上，本研究中的代表性患者是一名63岁的男性，患有近十年的T2D，表现为血糖控制不佳、显著的腹部肥胖（超重/肥胖）以及严重的多组分血脂异常，同时还有一些肾脏和肝脏功能障碍的初步证据。3.2 识别出的变异及其分类全外显子测序（WES）在糖尿病肾病（DN）队列中总共识别出9,404个变异（补充文件S1），其中绝大多数是单核苷酸多态性（SNPs）（8,725个）和插入/缺失（INDELs）（679个）（1A）。识别出的变异的总体转换/颠换（Ts/Tv）比为2.4308，证实了WES数据的质量，并符合人类外显子研究的预期范围。将SNPs映射到相应的染色体上（图1）显示了非均匀的分布，反映了T2D及其并发症背后的复杂遗传结构，既有局部“热点”也有稀疏区域。变异数量最多（4,472个SNPs）出现在染色体1上（图1B），鉴于其与多个糖尿病相关位点的历史关联，这一点值得注意。从功能上讲，主要的变异类别是错义变异、3′ UTR变异和同义变异（图1C），而碱基替换图详细显示了特定碱基变化的频率（图1D）。图1 比较沙特人群中糖尿病肾病与对照样本的识别变异概况。（A）变异概况：该图显示了研究中识别的变异总数。在糖尿病肾病中发现了9,404个变异，其中8,725个是SNPs，679个是INDELs。（B）变异的染色体分布：该图显示了识别出的遗传变异（SNPs和INDELs）在不同染色体上的分布情况。在这个图中，染色体1包含的变异数量最多。我们在图中叠加了变异的影响。高影响变异（例如，移码或终止获得变异）主要位于染色体19上（33个变异），其次是染色体1（29个变异）。中等影响变异，如错义变异，在染色体1上最为丰富，染色体7和11也有相当数量。低影响变异在染色体19上最为频繁（95个变异），而染色体1上的数量最少（41个变异）。预测对蛋白质功能影响很小或没有影响的修饰变异在染色体1、7和11上普遍存在。（C）变异分类：该图显示了使用SNPEFF程序识别的变异的功能分类。主要类别包括错义变异、3′ UTR变异和同义变异，这些变异都有潜力改变蛋白质结构和功能。（D）碱基替换图：该图展示了数据集中不同类型核苷酸替换（如转换和颠换）的频率。每种类型的碱基替换的发生次数以水平条表示，x轴代表特定碱基替换的计数。根据使用SNPEff影响标准预测的基因功能影响，进一步对变异进行了分类（图1B）。高影响变异（例如，移码或终止获得变异）在染色体19上最为频繁（33个变异），其次是染色体1（29个变异）。中等影响变异（例如，错义变异）在染色体1上最为丰富，染色体7和11也有相当数量。相反，低影响变异在染色体19上的数量最多（95个变异），而在染色体1上的数量最少（41个变异）。大多数剩余的SNPs被分类为修饰变异，其最高浓度出现在染色体1、7和11上。3.3 基因关联强度的双向分析双向分析成功地将我们WES数据中的98个基因映射到T2DKP关联列表（图2A），揭示了T2D和DN之间的部分遗传重叠。虽然大多数基因的关联强度较低，但分析识别出了不同的簇。T2D特异性基因（红色），如THADA（-log10P = 95.5）、NOTCH4（-log10P = 24.8）和TNXB（-log10P = 24.9），达到了全基因组阈值，但与DN的关联很小。DN特异性基因（蓝色），包括SP2（-log10P = 3.6）、CDH3（-log10P = 3.2）和ARFGEF2（-log10P = 3.1），达到了提示性DN阈值，但低于T2D的显著性。共享基因（紫色），如INSR（T2D：-log10P = 23.9，DN：-log10P = 3.1）、HLA-DQB1（T2D：-log10P = 17.6，DN：-log10P = 3.0）和CRHR1（T2D：-log10P = 8.0，DN：-log10P = 3.2），与两种表型都有显著或提示性的关联，将它们定位为连接原发性糖尿病与其肾脏并发症的关键候选基因。图2 基因关联强度和WES变异后果的整合分析。（A）基因关联强度：T2D与DN。该图显示了从WES队列映射到T2DKP数据集的98个基因的T2D（-log10P）关联在X轴上，DN（-log10P）关联在Y轴上。显著性阈值区分了仅T2D（红色）、仅DN（蓝色）和共享（紫色）的关联。（B）变异后果。条形图显示了WES队列中相关基因中发现的错义（红色）与其他（蓝色）变异的数量。（C）变异影响。条形图显示了WES队列中相关基因中发现的低（绿色）与中等（橙色）与修饰（紫色）影响变异的数量。为了分类与T2D、DN或两者相关的基因中的变异的功能重要性，我们根据后果（图2B）和影响（图2C）对它们进行了分类。大多数变异被分类为“其他”（例如，内含子，5′ UTR），并赋予了修饰影响，其中RTEL1（n = 53）和THADA（n = 49）的数量最多，表明调节变异起着重要作用。然而，在ATP8B3（n = 6）、PHKG2（n = 6）、INSR（n = 2）、RE XO1（n = 2）、PBX2（n = 1）和TNFRSF6B（n = 1）中检测到了关键的错义变异。这些具有错义变化的基因被分类为具有中等影响，而同义RE XO1变异被分类为低影响，这强调了尽管非编码变化普遍存在，但在关键疾病相关基因中存在功能相关的蛋白质改变变异。3.4 DN中优先考虑的新编码变异WES报告了我们的T2D病例中的五个新突变（表2）。基于计算机预测的有害效应，对糖尿病神经病变队列中识别出的新错义变异进行了优先排序，突出了五个关键基因（表3）。所有变异都被分类为对结果蛋白具有中等影响。具体来说，SRCAP（p.D2345A）和PBX2（p.D365A）被SIFT预测为有害，而PolyPhen预测为可能有害或良性。值得注意的是，SRCAP和PBX2中的变异发生在pLI得分为1.00的基因中。这一最大基因级限制表明这些位点属于人类基因组很少容忍功能丧失（LoF）等位基因的类别，通常表明破坏性变异——包括错义变化——可能具有显著的表型后果。TNFRSF6B（p.T262P）中的变异也被SIFT预测为有害，而PHKG2（p.V57A）尽管被SIFT容忍，但被PolyPhen评为可能有害。这两个基因的pLI得分为0.00，表明它们在人群中通常能够容忍变异。虽然这些变异在搜索的数据库中是新的，但根据初步证据，它们目前仍然是未知意义的变异（VUS）。根据ACMG标准，所有这些被优先考虑的新变异都属于PM2类别（在gnomAD人群数据库中的频率极低）。表2显示了与这些变异相关的通路或过程以及相关基因的FDR值（假阳性率）。

| 通路或过程 | 术语 | IDEnriched基因 | 类别 | FDR | 对压力的响应 |
|---------|-------|-----------|------|---------|
| GO:0006950 | PLIN3, CYBA, ALOX15, FASN, SHMT2, SIRT6, TFRC, IL5RA, LDLR, MAP4K1 | GO过程 | 4.29 × 10-2 | 炎症反应 |
| GO:0006954 | CYBA, ALOX15, FASN, TFRC, IL5R | GO过程 | 4.73 × 10-2 | 成纤维细胞生长因子受体信号通路 |
| GO:0008543 | FGFR3 | GO过程 | 6.95 × 10-6 | 代谢过程的正向调控 |
| GO:0009893 | CYBA, INSR, EEF2, SIRT6, FGFR3, ALPL, TFRC, LDLR, PHKG2 | GO过程 | 1.84 × 10-2 | 脂质代谢过程的调控 |
| GO:0019216 | SIRT6, FGFR3, LDLR | GO过程 | 4.80 × 10-2 | 含磷酸化合物的代谢过程 |
| GO:0006796 | ALOX15, INSR, FGFR3, ALPL, PHKG2 | GO过程 | 1.15 × 10-2 | 骨矿化 |
| GO:0030282 | ALOX15, FGFR3 | GO过程 | 1.40 × 10-3 | 葡萄糖稳态 |
| GO:0042593 | CYBA, INSR, SIRT6 | GO过程 | 6.40 × 10-3 | MAPK级联的调控 |
| GO:0043408 | ALOX15, INSR, FGFR3, MAP4K1 | GO过程 | 1.95 × 10-5 | MAPK信号通路 |
| hsa04010 | INSR, FGFR3 | KEGG | 9.28 × 10-8 | Ras信号通路 |
| hsa04014 | INSR, FGFR3 | KEGG | 3.22 × 10-14 | HIF-1信号通路 |
| hsa04066 | INSR, TFRK | KEGG | 2.04 × 10-5 | PI3K-Akt信号通路 |
| hsa04151 | INSR, FGFR3 | KEGG | 3.07 × 10-7 | AMPK信号通路 |
| hsa04152 | INSR, FASN, EEF2 | KEGG | 3.83 × 10-5 | JAK-STAT信号通路 |
| hsa04630 | IL5RA | KEGG | 2.02 × 10-2 | 胰岛素信号通路 |
| hsa04910 | INSR, FASN, PHKG2 | KEGG | 2.53 × 10-10 | 膜转运 |
| HSA-19999 | PLIN3, TFRC, LDLR | Reactome | 1.88 × 10-2 | 栅栏蛋白介导的内吞作用 |

该表总结了功能富集分析中识别出的主要GO（Gene Ontology）术语、KEGG（Kegg Pathway Database）术语和Reactome术语，突出了这些基因与代谢失调、应激反应和炎症等核心通路之间的遗传联系。

表3列出了在DN（糖尿病肾病）病例中识别出的优先考虑的新错义变异。

3.5 功能富集分析
对携带高影响和中等影响变异的基因进行的功能富集分析（表3）显示，这些基因与糖尿病肾病（DN）的关键病理机制存在强烈的遗传关联。最富集的术语集中在代谢失调和应激反应相关通路，特别是胰岛素信号通路（KEGG: hsa04910）和葡萄糖稳态（GO: 0042593），这证实了基本葡萄糖控制的遗传紊乱。此外，AMPK信号通路（KEGG: hsa04152）、脂质代谢过程调控（GO: 0019216）以及炎症反应相关术语（GO: 0006954）的富集表明，遗传变异在驱动慢性炎症、脂毒性及能量感知障碍中起着重要作用。分析还强调了对于细胞应激和结构完整性至关重要的通路，包括HIF-1信号通路（KEGG: hsa04066）、含磷酸化合物的代谢过程（GO: 0006796）和骨矿化（GO: 0030282），这表明遗传变异可能影响细胞对缺氧的反应及其管理必需矿物质和磷酸盐的能力。INSR和FGFR3等基因在主要的信号转导级联中频繁出现，包括MAPK和PI3K-Akt信号通路。

4 讨论
2型糖尿病（T2D）是由遗传和环境风险因素相互作用引起的（34）。DN是DM的严重并发症之一。在这项初步研究中，我们检查了Tabuk人群中T2D患者的基因变异与DN之间的关联。

4.1 糖尿病肾病患者的基因变异
CRHR1（促肾上腺皮质激素释放激素受体1）基因显示出变异（图2）。我们的结果表明，该基因与T2D和DN有潜在关联。CRHR1增强胰岛素的葡萄糖刺激分泌（35, 36）。CRHR1基因变异可能导致高皮质醇血症，进而导致血清素功能障碍和抑郁，这些都会增加血糖、胰岛素抵抗和内脏肥胖，这些都是T2D的特征（36）。
HLA-DQB1（主要组织相容性复合体，II类，DQ beta 1）也显示出可能与DM和DN相关的基因变异（图2）。它是免疫系统的重要组成部分。HLA-DQB1基因的多态性与自身免疫疾病（如T1D、多发性硬化症、乳糜泻（37）和肾功能（38）有关。这一结果与Jin等人2023年在韩国人群中进行的研究一致，该研究报道HLA-DQB1基因变异参与了DN的发病机制。
ZGPAT（锌指CCCH型及G-补丁结构域含有）基因也显示出变异（图2），可能与T2D和DN有关（图2）。它是一种转录因子，可能调节许多基因的转录（39）。结果显示INSR基因存在变异，可能与T2D和DN有关（图2）。INSR基因编码胰岛素受体，这是一种跨膜蛋白，对胰岛素信号通路至关重要，而胰岛素信号通路是葡萄糖稳态的重要组成部分（40）。INSR基因的变异可能导致胰岛素抵抗和高血糖（41）。据报道，该基因与新生儿高胰岛素血症性低血糖和家族性DM有关（42）。此外，INSR（和MTOR）的多态性与中国东北汉族人群中的T2D和DN有关（43）。
我们还发现了CDH3基因的变异（图2）。它编码cadherin 3（也称为P-cadherin）。Cadherins是上皮组织中的跨膜蛋白，参与细胞-细胞粘附、连接形成和组织完整性的维持；它们在食道、肾小管和肠道等组织中表达（44）。我们提出CDH3基因变异可能在DM的高血糖条件下促进DN的发展。
ARFGEF2基因（编码ARFGEF2蛋白，也称为BIG2蛋白）也显示出变异（图2）。这种蛋白是一种鸟苷核苷酸交换因子（GEF），可激活ADP-核糖基化因子（ARFs），对内体结构的完整性很重要（46）。
我们的结果还显示ARFRP1基因存在变异（图2）。该基因编码ARF相关蛋白1（ARFRP1）。这种蛋白和另一种蛋白（GOPC）对于胰腺β细胞在葡萄糖刺激下的胰岛素分泌是必需的（47）。SP2转录因子也显示出变异（图2）。Sp2调节细胞的不同功能，例如细胞分裂、增殖、分化和死亡（48）。据认为SP2在肾脏生长和分化中起作用，并与肾脏功能相关（49）。有研究表明，SP2的过表达可以激活胰岛素信号通路，改善胰岛素抵抗并减少神经元的氧化应激（48）。因此，SP2被提出作为糖尿病脑病的生物学靶点（48）。SP2在胰岛素抵抗和T2D中的作用仍有待未来研究。
结果还显示ATP8B3基因存在变异（图2）。该基因编码氨基磷脂转运蛋白（50），属于P型阳离子转运ATP酶家族，特别是氨基磷脂转运ATP酶亚家族（50）。该基因在DN发展中的作用需要进一步研究。
PHKG2（磷酸化酶激酶催化亚单位γ2）基因也显示出变异。这种酶在糖原分解的激活中起作用。PHKG2基因的变异与肝糖原贮积病IX型（GSD）有关（51）。
THADA基因也显示出变异（图2）。该基因编码甲状腺腺瘤相关蛋白。这一结果与先前的研究一致，表明THADA与T2D的发展有关（52, 53）。THADA通过调节胰腺β细胞功能和凋亡参与T2D，并且有人建议针对THADA的表达或活性是预防和治疗T2D的策略（54）。
NOTCH4（神经发生位点notch同源物4）也表现出基因变异（图2）。该基因编码NOTCH4蛋白。据提出，这种蛋白调节PI3K/AKT依赖的胰岛素信号通路，并与T2D的发展有关（55）。我们的结果与Liu等人的研究一致（56），他们报告NOTCH4基因与中国人群中DN的易感性有关。
此外，RNF5（编码环指蛋白5）也显示出变异（图2）。RNF5是一种保守的E3泛素连接酶，参与通过内质网相关降解途径清除错误折叠的蛋白质（57）。此外，RNF5负调节内质网应激（57），内质网应激是T2D发展的重要因素（58），RNF5基因在DN中的作用需要进一步研究。
TNXB基因也显示出变异（图2）。它编码tenascin-X（TNX），这是一种在心脏、肺和肾脏等多种器官中广泛表达的大分子ECM糖蛋白（59, 60）。TNX的功能障碍与结缔组织疾病有关（60）。TNXB基因变异据报道会导致单肾缺失（59）；然而，其在DN中的作用需要进一步研究。
SLC44A4（溶质载体家族44成员4）基因也发生了变异。该基因编码胆碱转运蛋白4。SLC44A4基因与透明细胞肾细胞癌的阶段显著相关（61）。
我们的结果表明AGER基因存在变异（图2）。该基因编码晚期糖基化终产物（AGE）受体。这是一种跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族，在胰腺β细胞、白细胞、神经细胞、肝脏和大脑中表达（62）。它作为清除剂并介导细胞内信号传导（63）。AGER基因的SNP与DM和DM并发症有关（63, 64）。在高血糖条件下，它在基因转录水平上释放不同的促炎因子（63），这可能促进DN的发展。这一结果与之前在中国人群中进行的研究一致（56）。
CLK2基因也表现出变异（图2）。该基因编码一种蛋白激酶，催化含ser/thr和tyr的底物的磷酸化，称为Cdc2样激酶2（CLK2）。CLK2参与脂肪酸的代谢调节（65）。CLK2还抑制糖异生基因的表达，并被胰岛素/Akt信号激活（65）。
JARID2基因也显示出变异。该基因对于胚胎期胰腺β细胞的晚期分化是必需的（66），ARID2促进肿瘤细胞中的糖酵解和脂质代谢。然而，其在DM和DN中的确切作用需要进一步研究。
此外，RTEL1基因（编码调节端粒延长的解旋酶）也表现出基因变异（图2）。RTEL1基因变异可能与肾纤维化有关（67）。
REXO1（RNA外切酶1同源物）基因也在我们的样本中发生了变异（图2）。它是基因调控的辅因子，可能与糖尿病有关（68）。然而，其确切作用尚未明确。
ALKBH4基因也显示出变异（图2）。该基因编码alkB同源物4，赖氨酸去甲基酶。这种蛋白具有多种功能，例如调节细胞分裂和细胞迁移过程中的肌动蛋白-肌球蛋白动态；它还参与转录（69）。
SRCAP基因也出现了新的错义变异（表3）。SRCAP编码SNF2相关CREBBP激活蛋白（70）。SRCAP基因突变导致骨骼成熟延迟、表达语言问题、面部特征异常和多囊肾（70, 71）。SRCAP基因在DN中的可能作用仍有待研究。
TNFRSF6B（肿瘤坏死因子受体超家族成员6b）基因也显示出错义变异（图2，表2）。该基因也称为DcR3（诱饵受体3）（72）。据报道，该基因与BMI、T2D（73）、T1D（自身免疫疾病）（74）和CKD（75）有关。
PBX2基因显示出一个新的错义变异（图2，表3）。PBX蛋白是保守的转录因子，属于三氨基酸环扩展（TALE）同源结构域蛋白超家族（76）。它们在早期胚胎发育中的器官发育中起重要作用（76），其在DM和DN中的潜在作用尚不清楚。

4.2 DN患者代谢通路中的基因变异
我们的结果表明，胰岛素信号通路存在基因变异（表2）。胰岛素信号通路中的基因变异与T2D有关（77）。据报道，高血糖会损害肾小球中的胰岛素信号通路，促进促凋亡环境，从而导致DN（78）。
我们还在DN病例中发现了参与葡萄糖代谢的基因变异（表3）。这些结果与研究一致，这些研究表明葡萄糖代谢通路中的基因变异会导致高血糖（79）。高血糖通过ROCK1介导的DRP1诱导线粒体裂变，从而损害肾小球细胞（80）。
结果还显示DN病例中氧化应激通路存在变异（表2）。这一结果与研究一致，这些研究报道了氧化应激在DN中的作用（81, 82）。
我们还发现了脂质代谢和炎症通路中的基因变异（表2）。据报道，脂毒性及低度全身性慢性炎症与糖尿病肾病（DN）有关（83）。研究结果表明，HIF-1α信号通路受到基因变异的影响（表2）。这些结果可能与一项研究结果一致，该研究指出HIF-1α通过血红素加氧酶-1介导的线粒体动态调控来防止DN中的肾小管损伤（84）。此外，我们的研究还发现了AMPK和MAPK通路中的基因变异（表1）。AMPK通路被认为是一个控制糖尿病及其并发症的目标（85），而MAPK通路的激活被认为与DN有关，针对MAPK通路可能是治疗DN的有效方法（86）。此外，DN中的基因变异还影响了膜转运（表2）。这一结果与一项研究结果高度一致，该研究指出膜转运与上皮-间质转化（EMT）的发生有关，而EMT与肾小球纤维化相关——例如，转化生长因子β在DN中诱导了EMT（87）。

4.3 区分与DN相关的候选变异与一般2型糖尿病（T2D）风险
在糖尿病基因组学中，一个主要挑战是区分导致原发性代谢疾病（T2D）的变异和那些使患者易患微血管并发症（如糖尿病肾病DN）的变异。作为一项探索性初步研究，我们的重点是在临床确诊的DN患者群体中识别基因组变异。虽然某些变异可能也存在于更广泛的T2D患者中，但多个因素表明我们的发现与肾脏表型高度相关。优先考虑的候选基因包括SP2、CDH3和ARFGEF2，在我们的DN分析中显示出显著的关联性，但在大规模的T2D全基因组关联研究（GWAS）中通常不被认为是主要风险因素。这表明这些基因可能在DN中具有特定的作用。此外，功能富集分析将这些变异映射到PI3K-Akt和AMPK信号通路。与影响胰岛素分泌的通用T2D变异不同，这些通路对足细胞健康和预防肾纤维化至关重要。

通过对比全球数据库并使用对照组个体，我们最大限度地减少了人群特异性背景噪声。虽然要明确区分T2D和DN风险需要更大的纵向研究队列，包括没有肾并发症的T2D患者，但这些候选标记为理解沙特人群中DN的独特基因组特征提供了生物学上的合理依据。

本研究的局限性包括样本量有限、为单中心研究，以及未纳入T2D和DN发病年龄的信息。早发性T2D与DN风险增加、肾功能下降和终末期肾病（ESRD）风险增加有关（88）。另一个局限性是，我们的研究没有仅将T2D作为对照组；由于这是一项针对已确诊DN的探索性初步研究，因此主要挑战仍然是明确区分导致T2D的通用遗传变异和那些特异性导致肾并发症的变异。尽管我们的功能分析指向了与肾脏相关的通路，但目前的研究设计未能在统计上将T2D的代谢背景与DN特异性风险区分开来。需要更大样本量和不同种族人群的进一步研究。此外，还需要进行蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质功能研究，以验证这些基因变异的影响（89-91）。之后，这些基因变异可以用于遗传咨询，以预测和早期检测DN，从而帮助制定预防和治疗策略。

5 结论
总之，在这项初步研究中，我们对糖尿病肾病（DN）患者进行了全外显子组测序（WES）。结果表明，THADA、NOTCH4和TNXB基因达到了全基因组关联阈值，并显示出较低的2型糖尿病（T2D）关联性。与DN相关的基因SP2、CDH3和ARFGEF2达到了提示性关联阈值，但低于T2D的显著性水平。INSR、HLA-DQB1和CRHR1基因可能与T2D和DN有关，使其成为DN发展的潜在候选基因。我们还检测到了SRCAP、PHKG2、TNFRSF6B和PBX2基因中的新发错义变异。这些基因变异可能影响的通路和生物过程包括炎症通路、脂质和葡萄糖代谢、PI3K-Akt信号通路、胰岛素信号通路以及AMPK信号通路。这些结果需要在未来的病例对照研究、基因组研究和蛋白质功能研究中进一步验证。之后，这些基因位点可以用于DN的预测、预防和治疗。