POx–螯合物共轭物的一种新方法及其与含氨基POx系统的抗菌活性比较

《Polymer Chemistry》：A novel approach to POx–chelate conjugates and a comparison of their antibacterial activity with POx systems containing amino groups

　　

这项研究提出了一种制备抗菌聚(2-噁唑啉)基(POx)与螯合剂共轭物的新颖合成策略。通过微波辅助阳离子开环聚合(CROP)合成了2-乙基-2-噁唑啉和2-[N-Boc-5-氨基戊基]-2-噁唑啉的明确无规共聚物。脱保护后，该共聚物与二乙烯三胺五乙酸(DTPA)共轭。这项工作展示了一条简化且高效的通往抗菌POx共轭物的路线，其中氨基在聚合后获得并直接与螯合剂偶联。无需对聚合物进行聚合后修饰即可在取代基中生成氨基。对共轭POx及其氨基改性前体进行了全面表征，包括结构分析和物理化学性质。评估了初步抗菌活性和细胞毒性，包括细菌膜测定和显微成像。两种系统均对常用代表革兰氏阴性菌株大肠杆菌(E. coli)表现出活性；然而，它们通过不同的机制作用：共轭物可能通过阳离子螯合作用，而其氨基改性前体通过阳离子聚合物介导的相互作用。重要的是，两种聚合物均与人成纤维细胞具有细胞相容性。总体而言，这项研究为设计聚合抗菌剂建立了一个多功能平台，为未来的生物医学应用提供了可调节的离子螯合功能。

**研究背景与问题提出**
全球感染性疾病因微生物高效传播与繁殖构成重大公共卫生负担，亟需开发新型抗菌系统。聚(2-噁唑啉)(POx)类聚合物因其优异的生物相容性、低免疫原性及结构可调性而在抗菌材料设计中备受关注。传统POx抗菌策略多依赖氨基的阳离子性质破坏细菌膜，但研究人员前期发现含螯合基团的POx系统可通过螯合二价阳离子（Ca²⁺、Mg²⁺）破坏革兰氏阴性菌外膜脂多糖(LPS)层，提供了一种替代机制。然而，此前构建POx-螯合剂共轭物需通过聚合后硫醇-点击化学引入氨基，步骤繁琐。本研究旨在开发一条简化合成路线：直接通过Boc保护单体的阳离子开环聚合(CROP)，脱保护后获得氨基，再与螯合剂偶联，避免聚合后修饰；同时系统比较该共轭物(POx–DTPA)与含氨基前体(POx–NH₂)的抗菌活性与机制差异。

**研究内容、结论与意义**
研究人员通过微波辅助CROP合成了2-乙基-2-噁唑啉(EtOx)与2-[N-Boc-5-氨基戊基]-2-噁唑啉(PentNHBocOx)的无规共聚物(POx–Boc)，脱保护获得POx–NH₂，再与二乙烯三胺五乙酸(DTPA)偶联得到POx–DTPA。结构表征确认了完整性与成功共轭，离子螯合实验证明POx–DTPA可100%螯合Ca²⁺和Mg²⁺。以大肠杆菌(E. coli) TOP10菌株为模型，抗菌实验发现：POx–DTPA的最小抑菌浓度(MIC)为0.15 mg mL^?1，显著低于POx–NH₂的1 mg mL^?1；外膜通透性实验(NPN探针)显示POx–DTPA引起的外膜损伤更强，且钙饱和后活性丧失，证实其通过螯合二价阳离子发挥作用；内膜通透性实验(台盼蓝流式)表明两种聚合物均能损伤内膜。细胞毒性实验显示两者在抗菌浓度范围内对人皮肤成纤维细胞(PDFs)无明显毒性。该研究发表在《Polymer Chemistry》。重要意义在于建立了一个结构可调的离子螯合型POx抗菌平台，为未来生物医学应用提供了简化的合成策略和机制理解。

**关键技术方法**
(1) **微波辅助阳离子开环聚合(CROP)**：以甲基4-硝基苯磺酸酯为引发剂、正丙胺为终止剂，在微波反应器中140°C一步合成POx–Boc无规共聚物，通过核磁共振(1H NMR)监测转化率。
(2) **脱保护与离子交换**：三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)脱Boc保护，再用Amberlyst A-21离子交换树脂去除TFA阴离子，获得POx–NH₂。
(3) **DTPA偶联**：以三嗪衍生物DMTMM为偶联剂，在pH 8.5水溶液中将DTPA连接至POx–NH₃⁺TFA^?，透析纯化得POx–DTPA。
(4) **表征技术**：使用尺寸排阻色谱-多角度激光光散射(SEC-MALLS)测定绝对摩尔质量与分散度(?)；¹³C NMR确认完全取代。
(5) **离子螯合验证**：络合滴定（铬黑T和紫尿酸铵指示剂）及扫描电子显微镜-能量色散X射线能谱(SEM-EDX)元素映射。
(6) **抗菌与细胞毒性评估**：微量肉汤稀释法测定MIC；外膜通透性用NPN荧光探针；内膜通透性用台盼蓝染色流式细胞术；细菌形态用SEM；细胞毒性用Alamar Blue法。样本来源：E. coli TOP10菌株；原代真皮成纤维细胞(PDFs)购自美国模式培养物保藏中心(ATCC, Cat. No. PCS-201-010?)。

**研究结果**
**Synthesis and characterization of the copolymer precursor (POx–Boc) and its deprotection**
通过微波辅助CROP合成了目标组成为70?:?30（EtOx?:?PentNHBocOx）的无规共聚物POx–Boc，SEC-MALLS测得绝对摩尔质量为15?000 g mol^?1，分散度? = 1.45；脱保护后获得POx–NH₂（Mn = 13?000 g mol^?1，? = 1.15）。1H NMR确认Boc基团完全去除（δ = 1.45 ppm信号消失），聚合物链未降解。

**Synthesis of POx–DTPA and the ion-trapping study**
利用DMTMM将DTPA偶联至POx–NH₃⁺TFA^?，¹³C NMR显示氨基碳位移（42.08→42.03 ppm）及酰胺/羧酸碳特征峰，证实30 mol%氨基全部被DTPA取代。络合滴定表明POx–DTPA可100%螯合等摩尔Ca²⁺和Mg²⁺；SEM-EDX元素映射显示Ca、Mg离子均匀分布在共轭物表面，而空白POx–DTPA无对应信号。

**Comparison of antibacterial activity and in vitro cytotoxicity of POx–DTPA and POx–NH₂**
- **MIC测定**：POx–DTPA对E. coli的MIC为0.15 mg mL^?1，钙饱和后（POx–DTPA-Ca）升至1.25 mg mL^?1；POx–NH₂的MIC为1 mg mL^?1。
- **内膜(IM)通透性（台盼蓝流式）**：POx–DTPA和POx–NH₂处理均使E. coli荧光强度向Triton X-100阳性对照偏移，表明两者均导致IM损伤且程度相近。
- **外膜(OM)通透性（NPN荧光）**：POx–DTPA处理后的NPN荧光强度略高于POx–NH₂，而钙饱和的POx–DTPA-Ca荧光与未处理对照相当，表明POx–DTPA通过螯合二价阳离子破坏OM，POx–NH₂则通过阳离子介导作用。
- **SEM形态观察**：两种聚合物处理2 h后，E. coli细胞完全碎裂，仅见碎片，证实强杀菌活性和严重膜破坏。
- **细胞毒性**：POx–DTPA和POx–NH₂在0.1和1 mg mL^?1浓度下处理人皮肤成纤维细胞24–72 h，细胞活力均保持在80%以上，显示良好细胞相容性。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出：POx–DTPA与POx–NH₂均能破坏E. coli内膜，但前者的外膜损伤更强且依赖于离子螯合机制（钙饱和后活性丧失）；后者则通过阳离子-膜静电作用。两种膜靶向差异为设计特异性抗菌聚合物提供了依据。细胞毒性数据支持其生物医学潜力。结论部分（翻译）：本研究展示了一条通过功能单体直接CROP、脱保护及DTPA偶联制备POx-螯合物共轭物的高效路线，简化了生物活性聚合物平台的构建。结构表征证实了聚合物完整性与成功共轭，所得POx–DTPA能有效螯合稳定细菌膜所需二价阳离子。以E. coli为模型的微生物实验表明，共轭物及其氨基前体均能高效破坏内膜，且POx–DTPA引起的外膜损伤略强。两种聚合物均显示低细胞毒性，突显其作为多功能抗菌材料的潜力。该POx系统兼具结构可调性与单体组成及功能化可控性，可精确调控理化和生物学性质。本平台为未来优化奠定了坚实基础，而非最终结构。这些发现确立了POx基共轭物作为一种通用且可调谐的抗菌材料平台。