一种基于磁分散固相萃取与高效液相色谱联用的分析方法，用于监测接受髋关节骨折手术患者的阿哌沙班血浆浓度

《Journal of Chromatography B》：An analytical method based on magnetic dispersive solid phase extraction combined with high performance liquid chromatography for monitoring of apixaban plasma concentration in patients undergoing hip fracture surgery

apixaban 测定，磁分散固相萃取，HPLC-MS/MS，髋骨折，血浆检测

　　

阿里·莫赫比（Ali Mohebbi）、沙米姆·谢米拉尼（Shamim Shemirani）、埃利耶·加德丹（Elliyeh Ghadrdan）、萨米拉·瓦利亚里（Samira Valiyari）、赛义德·亚里普尔（Saeid Yaripour）

伊朗德黑兰卡拉兹米大学（Kharazmi University）化学系分析化学教研室，邮编15719–14911

摘要

如今，作为一种新型的直接口服抗凝剂，阿哌沙班（apixaban）在髋部骨折手术患者中的使用频率显著增加，用于治疗和预防血栓栓塞疾病。监测人体血浆中的阿哌沙班浓度有助于预防手术可能带来的临床不良反应。本文开发并验证了一种基于磁分散固相萃取技术的分析方法，该方法采用Fe₃O₄@碳纳米洋葱（carbon nano–onion）@分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer）作为选择性强的纳米吸附剂，结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC–MS/MS）技术，用于检测接受髋部骨折手术患者的血浆样本中的阿哌沙班含量。具体操作中，通过涡流搅拌将磁性颗粒分散到稀释的血浆溶液中；萃取后利用外部磁铁去除吸附剂颗粒，并通过涡流作用用乙腈洗脱目标分析物；随后在磁场作用下去除液相并蒸发；最后将残留物溶解在流动相中并注入分析仪器进行定量分析。该方法在最佳条件下表现出良好的精密度（相对标准偏差≤6.4%）、低检测限（0.22 ng/mL^?1）和定量限（0.73 ng/mL^?1），以及较高的萃取回收率（86%）。由于缺乏条件，本研究未使用稳定的同位素标记内标。该方法已成功应用于三例髋部骨折患者的血浆样本，但还需进一步的大规模临床验证。结果显示，这些患者血浆中的阿哌沙班浓度范围为129.7–198.3 ng/mL^?1。

引言

髋部骨折是一种常见的骨科损伤，尤其在老年人中，通常由跌倒或外伤引起[1]。随着人口老龄化，髋部骨折患者数量持续增加。这种损伤会严重影响患者的生活质量和身体功能，属于致残的十大原因之一。约一半的患者无法独立行走，四分之一的患者需要长期药物治疗[2],[3]。及时进行手术是治疗髋部骨折的最佳方法。然而，接受骨折相关手术的患者面临较高的静脉血栓栓塞风险[4]。因此，术后应采取药物治疗以降低血栓栓塞事件的风险并预防中风[5]。医生通常会开具直接口服抗凝剂（DOACs），如阿哌沙班、利伐沙班（rivaroxaban）、艾多沙班（edoxaban）和达比加群（dabigatran）[6]。然而，目前尚无抗凝剂能够在不增加出血风险的情况下有效预防血栓形成[7]。DOACs起效迅速，给药后4小时内即可达到峰值血浆浓度[8]。阿哌沙班是一种广泛使用的DOAC，属于因子Xa的选择性抑制剂；该因子在人体凝血过程中起关键作用[9]。它既能抑制游离态也能抑制结合在血栓上的因子Xa及凝血酶原酶的活性，从而阻止血栓的生成[10]。阿哌沙班通过胃肠道吸收，生物利用度约为55%，主要在小肠远端和升结肠部位吸收[11]。其代谢主要通过肝脏中的细胞色素P450（CYP）3A4/5酶完成，随后通过胆汁和肾脏途径排出[12]。由于DOACs在固定剂量下的药代动力学和药效学特性较为稳定，通常无需常规监测。但在某些特殊临床情况下（如肥胖或体重过轻的患者、正在接受恶性肿瘤治疗的癌症患者、肾功能或肝功能异常者、手术期间、活动性出血、溶栓治疗期间、患者依从性评估困难或患者昏迷时），监测这些指标可能对临床管理有帮助[13],[14],[15]。目前尚不清楚DOACs的血浆浓度与出血或血栓栓塞事件之间的确切关系，需进一步研究。美国血液学会建议阿哌沙班的血浆浓度治疗范围为41–230 ng/mL^?1[16]。传统的凝血功能检测方法（如凝血酶原时间PT和活化部分凝血活酶时间APTT）存在对不同抗凝剂区分度低的问题[17]，且PT和APTT的灵敏度不足、剂量响应非线性，可能导致高浓度抗凝剂仅导致轻微的凝血时间延长。因此，需要高效液相色谱-串联质谱（HPLC–MS/MS）等互补技术来弥补这些缺陷。该技术因高灵敏度而在生物液体中的药物分析中备受青睐[18],[19]。

由于生物液体的复杂性及其中药物浓度较低，需要开发有效的样品预处理方法来提高分析物的浓度[20]。样品预处理过程中必须同时去除基质干扰并富集目标化合物[21]。固相萃取（SPE）因其自动化程度高、操作简便且吸附剂种类多样而广泛应用于生物样品处理[22]。然而，SPE也存在一些缺点，如吸附剂预处理耗时繁琐、卡盘堵塞等问题[23]。近年来，出现了多种改进型SPE技术，如搅拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction）、分散固相萃取（dispersive solid phase extraction）和磁分散固相萃取（MDSPE）[24],[25],[26]。MDSPE通过将磁性吸附剂直接加入样品溶液中并机械搅拌实现高效萃取[27]；分离磁性颗粒后用合适溶剂洗脱。该方法简化了流程、减少了溶剂用量并提高了效率，兼具环保优势。与其他基于吸附剂的方法类似，吸附剂的性质对MDSPE的效果至关重要[28],[29]。碳纳米洋葱（CNO）作为具有高比表面积的碳基纳米材料，是理想的吸附剂候选者[30]；但使用CNO时可能存在干扰化合物的共萃取现象，影响检测选择性。通过将CNO与分子印迹聚合物（MIPs）结合可克服这些问题。MIPs具有针对特定模板分子设计的特殊孔结构，从而实现选择性萃取并提升萃取效率。

本研究旨在开发一种基于Fe₃O₄@CNO@MIP复合材料的MDSPE方法，结合HPLC–MS/MS技术用于检测患者血浆中的阿哌沙班。该复合材料具有高比表面积、优异的选择性和磁性，具有快速、经济、环保及高效提取等优点。

材料

阿哌沙班标准粉末购自美国马萨诸塞州伯灵顿的Merck–Millipore公司。所用试剂包括HPLC级水、乙腈（ACN）、冰醋酸、甲酸、甲醇（纯度99.9%）、乙醇（99.5%）、丙酮（99%）、氢氧化钠（NaCl，99.8%）、壳聚糖（CS，99%）、盐酸（37%，w/w）、氨水（NH₄OH，25% w/w）、硫酸锌（ZnSO₄，99.5%）、七水合硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O，99.5%）、六水合氯化铁（FeCl₃·6H₂O）等。

Fe₃O₄@CNO@MIP的表征

采用FTIR、SEM和EDX对复合材料进行了分析。图2a显示了其FTIR光谱：3453、2917、1644和1078 cm^?1处的峰分别对应NH和OH基团的伸缩振动、C–H键以及C–O–C键的振动；564 cm^?1处的吸收峰证实了复合材料中的Fe–O键存在；1153和1262 cm^?1处的峰与EGDMA分子的伸缩振动相关。

结论

本研究开发了一种结合HPLC–MS/MS的MDSPE方法，用于检测接受髋部骨折手术患者血浆中的阿哌沙班。合成了Fe₃O₄@CNO@MIP复合材料，并将其作为吸附剂用于MDSPE过程。MIP在复合材料结构中的存在为阿哌沙班提供了特异性结合位点，从而实现了对其的选择性萃取。

作者贡献声明

阿里·莫赫比（Ali Mohebbi）：负责初稿撰写及方法学设计。沙米姆·谢米拉尼（Shamim Shemirani）：负责方法验证和数据分析。埃利耶·加德丹（Elliyeh Ghadrdan）：负责文章修订和编辑。萨米拉·瓦利亚里（Samira Valiyari）：负责文章修订和编辑及数据管理。赛义德·亚里普尔（Saeid Yaripour）：负责文章修订和编辑、项目监督、数据管理及概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢伊朗阿尔博兹医科大学（Alborz University of Medical Sciences）的研究与技术办公室的支持。本研究获得了该校伦理委员会的批准（批准代码IR.ABZUMS.REC.1402.312）。