纳米孔电穿孔：表观遗传编辑领域中的新型递送方法

《Small》：Nanopore Electroporation: A New Delivery Method Within the Field of Epigenetic Editing

　　**摘要**

表观遗传修饰影响基因表达，并与2型糖尿病（T2D）的发生有关，但要确定因果关系，需要针对特定基因进行调控。基于CRISPR-dCas9的工具提供了这种可能性，然而β细胞极难转染，且缺乏高效的非病毒性递送方法。在这里，我们开发了一种纳米孔介导的电穿孔技术，将CRISPR干扰（CRISPRi）系统递送到克隆的INS1 β细胞中，实现了胰岛素表达的靶向下调。细胞被接种在纳米孔基底上，下方的溶液中含有CRISPRi质粒。轻微的电脉冲在膜上生成了短暂的纳米级孔洞，使得质粒能够通过电泳进入细胞质，同时保持了高细胞活力。CRISPRi系统由转录抑制因子Krueppel相关Box结构域（KRAB）与失活的Cas9（dCas9）融合而成，并通过单个引导RNA（sgRNA）引导至胰岛素-1基因（Ins1）的转录起始位点。转染后，Ins1表达显著降低，证明了这种技术在难以转染的细胞类型中的有效性。这种纳米孔电穿孔方法为在胰腺β细胞中递送基于CRISPR-dCas9的表观遗传编辑工具提供了一个稳健、安全且高效的平台。通过实现精确的基因调控，它为研究表观遗传因素对T2D的贡献以及其他具有挑战性的细胞系统开辟了新的途径。

**1 引言**

全球范围内，患有与年龄相关的复杂疾病（包括T2D）的人数正在迅速增加[1]。T2D的特点是由于胰腺β细胞胰岛素分泌受损以及靶组织（如肝脏、脂肪组织和骨骼肌）的胰岛素抵抗导致长期血糖水平升高。在非糖尿病患者中，胰腺β细胞会在进食后分泌胰岛素。然而，在T2D患者的β细胞中发现了分子缺陷，这导致β细胞对血糖升高的反应不足，进而影响胰岛素分泌[2-4]。遗传、表观遗传和环境因素共同促进了T2D的发展[5, 6]。表观遗传机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA[7]。这些因素塑造了遗传物质的3D结构并调节细胞特异性的基因表达。由于表观遗传改变在复杂疾病中起着重要作用，它们可能成为潜在的新治疗靶点[8]。例如，我们发现T2D患者或高风险人群的组织中存在表观遗传修饰[9-17]，包括导致T2D特征的胰岛素分泌受损的胰腺岛变化[13-15, 18-21]。然而，目前尚不清楚是疾病相关的表观遗传修饰导致了疾病，还是疾病导致了观察到的表观遗传标记的变化[5, 13]。为了识别对疾病发展有因果效应的表观遗传变化，可以使用表观遗传编辑技术在特定基因组区域沉积或去除表观遗传修饰，并分析这是否改变了基因表达并影响了细胞过程。这可以在体外和体内稳定地进行[22-24]。CRISPR-dCas9系统已成为一种有前景的表观遗传编辑方法[25, 26]。它依赖于递送一个sgRNA来靶向感兴趣的基因组区域，以及与人工转录因子或表观遗传酶（如DNA甲基转移酶（DNMTs）和Ten Eleven Translocation酶（TETs）的催化结构域融合的失活Cas9蛋白（dCas9）[27]。CRISPR干扰（CRISPRi）利用与抑制因子（例如非催化性的转录抑制因子Krueppel相关Box结构域（KRAB）融合的dCas9来下调目标基因[29]。表观遗传编辑为纠正疾病状态下的不利表观遗传特征提供了可能性。通过使用CRISPRi系统调节选定候选基因的表达，可以为研究表观遗传因素对T2D的机制机制提供途径。

**2 结果**

2.1 确定200纳米孔径和28伏电压为CRISPRi系统递送的最佳参数

在本研究中，我们使用了两种质粒的组合：一种3.5 kbp的质粒编码针对大鼠胰岛素启动子转录起始位点（TSS）附近序列的sgRNA，另一种8 kbp的质粒编码dCas9-KRAB（图S1和S2），通过CRISPRi下调INS1 β细胞中的Ins1表达。由于dCas9-KRAB质粒比我们之前研究中使用的质粒大得多[53]，我们首先进行了电压和孔径优化，以实现高转染效率同时保持高细胞活力。根据我们之前的研究[53]，使用纳米孔或纳米棒转染GFP编码的pMAX质粒到INS1 β细胞时，对转染效率和细胞活力有不同的影响。纳米孔比纳米棒更温和，48小时后细胞数量更多，这对于本研究中需要时间让转染质粒对胰岛素基因表达产生影响的应用至关重要。因此，我们选择了使用纳米孔。此前我们还发现纳米孔表面化学性质对转染效率有显著影响[54]，其中氧化铝表面获得了最佳结果。因此，本研究中使用的纳米孔具有氧化铝涂层。图2A和B显示的孔径是制造商提供的标称孔径，即未进行氧化铝涂层之前的孔径。为了优化孔径和电压，我们使用了较大的dCas9-KRAB质粒。Cas9-KRAB质粒用DNA插入染料YOYO-1染色，以便转染后立即进行流式细胞术分析荧光（见图2C中的门控）。使用200纳米孔径的纳米孔导致转染后立即的细胞死亡较少（图2A），而48小时后的细胞数量更多（图2B），相比之下300纳米孔则不然。施加22伏电压的脉冲与200纳米孔径结合使用时，细胞数量略高于28伏脉冲。然而，28伏脉冲下转染的β细胞比例显著更高，因此选择了200纳米孔径和28伏电压。

2.2 使用纳米孔电穿孔成功将CRISPRi系统递送到INS1 β细胞中

为了评估质粒是否在INS1 β细胞中停留足够长的时间以进行转录和翻译，我们在转染dCas9-KRAB质粒和大小与sgRNA质粒相似的GFP编码质粒pMAX后48小时分析了GFP表达。当同时注射这两种质粒时，约24%的INS1 β细胞在48小时后呈GFP阳性，这意味着24%的INS1 β细胞接收、转录并翻译了pMAX质粒（图3）。同时注射这两种质粒的目的是为了模拟CRISPRi系统中包含的质粒大小，即用于下调胰岛素的dCas9-KRAB+sgRNA质粒。sgRNA质粒被替换为pMAX质粒，以便使用流式细胞术可靠地检测GFP信号。图3：在图查看器或PowerPoint中打开

转染dCas9-KRAB和pMAX质粒后48小时的GFP表达情况。GFP报告基因位于pMAX质粒上，该质粒的大小与用于下调胰岛素表达的sgRNA质粒相同。柱状散点图显示了：(A) 转染的活细胞百分比（平均值±标准误差）和(B) 死细胞百分比（平均值±标准误差）。n = 4，***p < 0.001，*p < 0.05，t检验。(C) 显示了一个实验中细胞死亡和GFP表达的筛选结果。所有图表的x轴代表前向散射信号面积，y轴代表DAPI荧光强度信号（DAPI-A）和GFP荧光强度信号（GFP-A）的面积。有关完整的筛选策略，请参见图S4。

2.3 使用纳米孔电穿孔技术下调INS1 β细胞中的Ins1基因表达

随后，使用CRISPRi系统（dCas9-KRAB和sgRNA质粒的组合）对INS1 β细胞进行转染，以下调Ins1基因表达。设置了两个对照组：(i) 未处理的细胞；(ii) 仅含有效应因子骨架质粒（dCas9-无效应结构域（NED）的细胞以及sgRNA质粒。后者在所有方面都模拟了dCas9-KRAB+sgRNA质粒，除了dCas9-NED质粒不编码转录调节因子。图4A展示了所有实验的平均相对表达水平（n = 19，每个实验重复三次），通过定量聚合酶链反应（qPCR）进行分析，结果显示转染了dCas9-KRAB+sgRNA的INS1 β细胞的Ins1基因表达显著下调（p = 0.03）。此外，我们还检测到转染了dCas9-KRAB质粒+sgRNA的INS1 β细胞的Ins1基因表达有降低的趋势（p = 0.06）。图4B将每个实验中的dCas9-NED+sgRNA和dCas9-KRAB+sgRNA进行了配对比较，结果显示在大多数实验中（四个实验除外），CRISPRi处理后的Ins1基因相对表达水平均低于对照组。这些结果共同证明了纳米孔电穿孔技术能够成功实现CRISPRi介导的INS1 β细胞中Ins1基因的表达下调。

3 讨论

在本研究中，使用纳米孔电穿孔技术将CRISPRi系统转染到INS1 β细胞中，成功实现了Ins1基因的表达下调。这项研究展示了使用纳米孔电穿孔技术对难以转染的细胞类型进行表观遗传编辑的可行性，为分析表观遗传变化在疾病发展中的致病作用奠定了基础。实验中向细胞内注射了两种大小显著不同的质粒：sgRNA和dCas9-KRAB。由于dCas9-KRAB质粒的体积远大于我们之前使用的质粒，因此首先需要对一些转染参数进行优化，测试了四种电压和两种孔径的组合。使用小孔和低电压时，转染效率最低，这可能是由于电泳力不足以将大质粒拉过纳米孔。在给定电压下，200纳米孔的转染细胞百分比较低，但细胞存活率和细胞数量较高，相比之下300纳米孔的效果更好。由于200纳米和300纳米孔的孔隙率相同，两种孔材料的电阻和孔内的电场也相似。然而，孔径本身也会影响转染效率和细胞存活率：一方面，较大的孔径可以减少机械阻碍，从而更容易传递质粒；另一方面，较大的孔径可能导致纳米电穿孔后细胞膜恢复更加困难，进而可能导致细胞死亡。总体而言，所有处理过的样本在转染后48小时的细胞数量均低于对照组，这可能是由于纳米孔电穿孔本身或质粒的细胞毒性所致。在之前的研究中，我们排除了细胞增殖作为细胞数量减少的可能原因，而是观察到转染后细胞从基底上脱落的现象[54]。结果表明，传递到细胞内的质粒数量与细胞脱落之间存在正相关关系，这引发了质粒细胞毒性的问题。这一现象得到了支持，因为纳米孔电穿孔方法已被证明具有最小侵入性，并能保持高细胞活力[42, 56]，而大质粒则具有细胞毒性[57]。质粒的细胞毒性也可能导致使用较大孔径转染的细胞活力降低，因为较大的孔径可能使质粒更容易传递。我们实验的一个缺点是无法使用流式细胞术来评估同时转染了两种质粒的细胞数量。这是因为dCas9-KRAB质粒没有荧光报告基因，且用不同的嵌入染料对两种质粒进行染色是不可靠的，因为染料在混合时可能会无差别地结合到两种质粒上。因此，我们用含有GFP报告基因的质粒替换了sgRNA质粒。结果显示25%的细胞表达了GFP。由于dCas9-KRAB质粒没有荧光报告基因，这些细胞中dCas9-KRAB质粒的转染情况未知。然而，根据使用纳米吸管而非纳米孔的类似电穿孔系统的实验结果[43]，细胞不太可能只转染了一种质粒。此外，另一项研究表明同时使用较小质粒时大质粒的传递效率更高[58]。鉴于我们观察到dCas9-KRAB质粒的即时转染效率为25%，且与dCas9-KRAB和pMAX质粒共转染后有25%的细胞表达了GFP，我们推测在我们的实验中大约25%的细胞受到了CRISPRi系统的影响。25%的效率低于其他研究中报道的效率，后者对于GFP质粒、大蛋白质[38, 47, 48]和GFP RNA[39]的转染效率约为80%。我们认为这是由于克隆β细胞的难以转染特性以及dCas9-KRAB质粒相对于这些研究中使用的载体的较大体积所致。在我们之前的研究中，使用3.5 kbp的GFP质粒转染克隆β细胞时，转染效率为50%–60%[54]。由于dCas9-KRAB质粒的体积较大（8 kbp，直径≥100 nm[59]），我们预计其传递效率会更低。相比之下，使用纳米孔电穿孔转染CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNPs）的遗传编辑效率在25%–35%之间[38, 39, 48]。需要注意的是，dCas9-KRAB质粒的体积远大于RNPs（直径约12 nm）。综合这些因素，孔径大小和克隆β细胞的难以转染特性可以解释25%的转染效率。据我们所知，纳米孔电穿孔技术尚未被用于CRISPRi系统的基因表达修饰。我们展示了CRISPRi转染后Ins-1基因表达的显著下调，这表明sgRNA靶向了正确的位点，KRAB对Ins1表达产生了预期的效果，从而证实了CRISPRi系统的有效性。虽然平均相对表达量的差异（图4）较为微小，但约有25%的细胞被转染，因此大多数细胞会表达正常水平的胰岛素mRNA，表明实际效果更为显著。此外，研究发现sgRNA在基因组中的位置在使用CRISPRi和CRISPRoff系统时是一个重要因素[60, 61]，因此测试针对其他位点的sgRNA可能会实现更强的下调效果。由于胰岛素在β细胞中含量极高[62]，可能难以观察到CRISPRi对该基因表达的显著影响。因此，也可以考虑研究表达水平较低的基因，并评估CRISPRi的相对效果是否会更明显。未来的实验还可以评估CRISPRi在其他细胞类型中的纳米孔电穿孔效果以及其对其他基因的调控作用。虽然本研究中使用的CRISPRi系统利用转录因子来下调基因表达，但未来的研究也可以测试纳米孔电穿孔技术是否可用于结合DNMTs或TETs等因子进行表观遗传编辑，从而改变sgRNA靶向位点的DNA甲基化[27, 28]。总之，这项研究为表观遗传机制的因果研究开辟了新的可能性，提供了一种广泛适用的、非病毒性的CRISPR-dCas9系统传递策略，适用于难以转染的细胞。

4 材料与方法

4.1 纳米孔制备和纳米孔电穿孔装置组装

使用轨道蚀刻聚碳酸酯（PC）膜（it4ip，比利时Louvain-la-Neuve）作为纳米孔制备的基底材料。在轨道蚀刻过程中，首先用高能离子照射薄膜，形成线性损伤轨迹。这些轨迹比周围聚合物更具化学反应性，可以通过蚀刻条件选择性地蚀刻成孔洞，孔洞的大小和形状由蚀刻条件决定。纳米孔膜通过原子层沉积（ALD，美国马萨诸塞州剑桥市Savannah, Cambridge Nanotech）涂覆氧化铝。为了在PC膜上形成约12纳米厚的氧化铝层，采用了130个周期的0.15秒三甲基铝（TMAl）和水脉冲交替脉冲，脉冲间隔时间为30秒，温度为90°C。PC膜厚度为25微米，孔径分别为200纳米和300纳米。两种孔径的膜孔隙率均为约0.6%，即200纳米孔为2E7个孔/平方厘米，300纳米孔为9E6个孔/平方厘米。纳米孔电穿孔装置由粘贴在塑料圆筒（高1厘米，内径4毫米）上的纳米孔基底组成，使用双面胶带（3 8153LE (300LSE) 双层粘合剂转移）制成储液池（见图1A）。

4.2 细胞培养

本研究使用了产生胰岛素的INS1 β细胞（832/13 INS-1），其群体倍增数为21–60[63]。INS1 β细胞在RPMI-1640培养基中培养，培养基中添加了10%的热灭活胎牛血清（FBS，巴西来源，Gibco，美国马萨诸塞州Waltham，ThermoFisher Scientific）、1%青霉素-链霉素（PenStrep，Sigma Aldrich，美国马萨诸塞州Burlington）、2.2%的补充剂（包含50%的100 mM丙酮酸溶液和50%的200 mM谷氨酰胺溶液，Gibco，ThermoFisher Scientific）以及176 ppm的2-巯基乙醇。细胞培养条件为37°C和5%的二氧化碳环境，当细胞密度达到80%–100%时进行传代。传代前，先用1×Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS，VWR，美国宾夕法尼亚州Radnor）洗涤细胞，然后用胰蛋白酶-EDTA（Gibco，ThermoFisher Scientific）处理3分钟，再悬浮在完全培养基中。悬浮液随后在700 g下离心3分钟，沉淀物重新悬浮在完全培养基中，大约25%的克隆β细胞可以重新接种到新的培养瓶中。

4.3 质粒

本研究中使用了四种不同的质粒：(i) 编码sgRNA的质粒（Addgene MLM3636 #43860；MLM3636由Keith Joung提供（Addgene质粒#43860；http://n2t.net/addgene:43860；RRID: Addgene_43860）（见图S1）；(ii) 编码带有人工转录因子KRAB的dCas9的质粒（见图S2）；(iii) 编码dCas9但不含效应结构域NED的质粒（见图S5）（Addgene pMLM3705 #47754）[52, 64]；(iv) pMAX质粒（编码GFP，由隆德干细胞中心的Cell & Gene Therapy Core制备）（见图S6）。sgRNA与Ins1基因转录起始位点附近的DNA序列匹配，并引导dCas9定位到该位置。dCas9会结合到DNA上，与其连接的效应结构域KRAB会下调Ins1的转录。NED质粒被用作对照，因为它提供了一个与含有KRAB的系统完全相同的系统，但无法修改基因表达水平。

4.4 sgRNA的设计与序列
sgRNA是使用CRISPOR [65]软件设计的。其序列为CTTGCCGTTTGGCCCATTA AGG，靶向大鼠Ins1基因的TSS附近区域。按照先前的描述，使用以下引物对将sgRNA克隆到MLM3636载体（质粒#43860，Addgene，美国马萨诸塞州沃特敦）中（正义引物（序列5′-3′）：ACACCGCTTTGCCGTTTGGCCCATTAG，反义引物（序列5′-3′）：AAAACTAATGGGCCAAACGGCAAAGCG）[52]。

4.5 INS1 β细胞的纳米孔电穿孔
根据传代协议重新悬浮INS1 β细胞后，将细胞悬液在含有DAPI（最终浓度0.01 μg/ml）的DPBS中稀释10倍，然后使用MACSQuant分析仪（Miltenyi Biotech，德国伯格施格拉德巴赫）通过流式细胞术测定细胞浓度和活力，同时使用MACSQuant运行缓冲液、储存液和洗涤液。

4.5.1 载体
为了优化纳米孔电穿孔效果，将dCas9-KRAB质粒（0.2 μg/μl，溶于MilliQ水中）用插入染料YOYO-1碘化物（Invitrogen，ThermoFisher）进行染色。将YOYO-1染料的1 mm储备液稀释至100 μm，加入到质粒溶液中，最终比例为1:250（YOYO-1分子：碱基对），之后将溶液置于50°C下孵育2小时。为了进一步评估质粒是否被转录，同时转染了KRAB和pMAX质粒，总浓度为400 ng/μl（每种质粒200 ng/μl）。这里使用pMAX质粒代替sgRNA质粒，因为其含有GFP报告基因，便于分析。在转染sgRNA+dCas9-KRAB或sgRNA+dCas9-NED时，使用sgRNA质粒和dCas9质粒的混合物作为载体溶液。总DNA浓度为400 ng/μl，每种质粒200 ng/μl。在纳米孔电穿孔实验中，将35,000个INS1 β细胞接种到100 μl的完全培养基中。随后将装置放入含有完全培养基的24孔板中，并以200 g的离心力离心1分钟，以促进INS1 β细胞与纳米孔基底之间的良好密封。在进行电穿孔之前，从每个装置中移除70 μL的细胞培养基。

4.6 纳米孔电穿孔过程
纳米孔电穿孔装置包括两个电极：一个镀金玻璃片（100 nm Au厚度，Platypus Technologies，美国威斯康星州菲奇堡）和一根直径为0.5 mm的铂丝；一个信号发生器（TGP110，Aim and Thurlby Thandar Instruments，英国亨廷登）和一个放大器（WMA-300，Falco Systems BV，荷兰卡特维克安泽）用于产生电脉冲；以及一个示波器用于观察信号。将装置放置在含有15 μL质粒溶液的滴液上（滴液位于金电极上），然后将上方的铂电极插入装置中的细胞培养基中，电极间距为0.5 mm。接着施加一系列方形电脉冲（宽度200 μs，电压28 V，频率40 Hz），持续40秒，之后再次将装置放下并重新施加另一组脉冲，持续40秒。处理完成后，将装置放入含有细胞培养基的滴液中，以冲洗纳米孔基底下的质粒溶液。对三个重复实验的INS1 β细胞进行纳米孔电穿孔后，通过轻轻上下吸移细胞悬液进行后续分析。在电压和孔径优化实验中，使用流式细胞术分析每个样本一半体积的细胞溶液，以确定即时转染效率（YOYO-1荧光）、细胞活力（DAPI荧光；分析前向细胞溶液中加入DAPI，最终浓度为0.01 μg/mL）和细胞浓度。随后将每个样本的8000个细胞接种到48孔板中，并培养48小时，然后通过胰蛋白酶处理（用DPBS冲洗细胞并加入50 μL胰蛋白酶3分钟，再加入250 μL完全培养基）进行重悬。使用流式细胞术评估细胞计数。每个样本类型进行三次实验。在评估GFP表达和Ins1基因表达影响的实验中，电穿孔后通过吸移细胞悬液直接将其重新接种到48孔板中并培养48小时，24小时后更换培养基。48小时后，用DPBS冲洗细胞并进行胰蛋白酶处理。对于表达GFP的实验，使用流式细胞术分析细胞GFP荧光。进行了三次GFP表达实验，每次实验重复三次。在基因表达实验中，将细胞溶液转移到Eppendorf管中，然后以300 g的离心力离心5分钟，去除上清液，将沉淀物冷冻在?80°C待后续的qPCR分析。共进行了19次独立实验，每次样本重复三次。

4.7 RNA提取、cDNA制备和qPCR
使用RNeasy Micro试剂盒（Qiagen，荷兰芬洛）从纳米孔转染的INS1 β细胞中提取总RNA，并使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（ThermoFisher Scientific）将其转化为互补DNA（cDNA）。在384孔板和Applied Biosystems QuantStudio 7 Flex实时PCR系统（ThermoFisher Scientific）中，按照默认参数进行定量PCR（qPCR）。使用TaqMan检测方法测量大鼠Ins1（Rn02121433_g1）和大鼠Hprt1（RN01527840_m1）的mRNA表达水平，后者作为内源性对照用于标准化Ins1 mRNA的表达水平。TaqMan检测试剂和qPCR试剂均购自ThermoFisher Scientific。相对表达量通过特定方法[55]计算。

4.8 统计分析
对于用YOYO-1染色的注射KRAB质粒，直接从流式细胞术软件中提取每个样本的细胞百分比和细胞计数。计算每个重复实验的平均值，然后将所有实验（n = 3）的平均值绘制成带有标准误差（S.E.）的条形图。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验（***p < 0.001，**p<0.01，*p<0.05）评估统计显著性。对于GFP表达实验，进行t检验（***p < 0.001，**p<0.01，*p<0.05）（n = 4）。这些结果的统计分析在R软件中进行。qPCR数据分析结果显示为相对表达量，并以内源性对照（Hprt1）进行标准化。相对表达量通过特定方法[55]计算。qPCR数据以平均值±标准误差（S.E.）的形式呈现，共评估了19个样本对（n = 19）。使用GraphPad软件进行统计分析，并应用Wilcoxon配对符号秩检验（非参数检验）评估qPCR数据的统计显著性。

致谢
本研究得到了ERC CoG项目NanoPokers（682206）、瑞典研究委员会（VR）、瑞典战略研究基金会（ITM17和Dnr IRC15-0067）、诺和诺德基金会、斯科讷地区、战略研究领域Exodiab（Dnr 2009-1039）、Crafoord基金会、NanoLund和瑞典糖尿病基金会的资助。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向相应作者索取。