《Life Sciences in Space Research》：Simulated Microgravity Induces a Time-Dependent Shift from Autophagy to Apoptosis in Osteoblasts, validated by TSPO, ATG12, and BNIP3L expression in vivo
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微重力环境下成骨细胞自噬-凋亡互作的双相动态规律及关键调控蛋白研究，揭示早期自噬激活与后期凋亡激活的时序关联及TSPO/ATG12/BNip3L介导的分子机制。
作者：杨敖 | 彭波 | 蓝腾 | 陈毅 | 张世峰 | 杨飞 | 夏雅怡 | 耿斌
兰州大学第二医院骨科，中国甘肃省兰州市730000
摘要
最新研究表明，微重力引起的成骨细胞功能障碍是导致太空飞行相关骨质流失的关键因素。本研究利用旋转细胞培养系统（RCCS）模拟微重力环境，探讨了MC3T3-E1成骨细胞中自噬与凋亡相互作用的时间动态变化。研究发现，自噬反应呈现出双相特征：在培养第3天，自噬通量增强（LC3-II/Beclin-1上调，p62降解），具有细胞保护作用并减少凋亡；随后在培养第5天，自噬活性受到抑制，同时凋亡显著增加（caspase-3活性升高）和线粒体功能障碍出现。到第10天，细胞出现广泛碎片化。蛋白质组学分析发现TSPO、ATG12和BNip3L是这种表型转变的重要调控因子。通过小鼠后肢卸载实验，Western blot和免疫组化验证了这些蛋白质在骨组织中的上调。我们推测，早期微重力暴露通过ATG12介导的囊泡扩张触发补偿性自噬，而长期微重力压力则伴随TSPO相关的活性氧（ROS）积累和BNip3L介导的自噬相关通路改变，从而促进凋亡。我们的发现揭示了模拟微重力环境下自噬-凋亡调控的双相时间模式，为未来治疗太空飞行相关骨质减少提供了潜在的时间敏感靶点。
引言
随着航空航天技术的不断进步，载人航天飞行的数量和频率持续增加。1961年至2020年间，共有562名宇航员完成了1,265次载人航天任务，其中女性宇航员的比例也在逐渐增加（Smith MG和BASNER，2020）。长期处于微重力环境中的宇航员面临的骨骼健康问题已成为航空航天医学的重要挑战。研究表明，微重力下骨稳态失衡主要表现为骨形成效率降低，而成骨细胞（负责骨形成的关键细胞）的成骨功能受损被认为是导致宇航员骨质流失的核心机制（CARMELIET和BOUILLON，1999；SAXENA等，2007）。然而，关于微重力如何影响成骨细胞在分子层面的功能仍存在许多未知之处。
近年来，细胞自噬与凋亡之间的相互作用在细胞应对环境压力和损伤的过程中发挥了关键作用（MUKHOPADHYAY等，2014）。自噬是一种高度保守的细胞自我降解和回收机制，可维持细胞内稳态以应对早期环境压力（REHMAN等，2021）。凋亡作为程序性细胞死亡的最终阶段，在持续细胞压力下发生，用于清除受损细胞（DECATHELINEAU和HENSON，2003）。自噬与凋亡之间的动态平衡对于理解微重力下成骨细胞的成骨能力下降和适应性反应具有重要意义。然而，以往的研究主要集中在微重力下成骨细胞自噬或凋亡的孤立观察，且分析仅限于单一时间点，未能系统探讨微重力诱导的自噬-凋亡动态的时间变化。
本研究采用MC3T3-E1成骨细胞模型，并利用旋转细胞培养系统（RCCS）模拟微重力环境。RCCS通过旋转容器消除气泡后实现细胞悬浮生长，利用离心力抵消地球重力，使细胞在类似太空环境的微重力条件下生长（MITTEREGGER等，1999）。时间进程分析（第1、3、5和10天）显示，微重力下的成骨细胞自噬与凋亡存在双相相互作用：第1天自噬通量增强，表现为自噬标志物LC3-II和Beclin-1上调及p62降解，同时凋亡受到抑制（与早期自噬的细胞保护作用一致（CHANG等，2017；LI等，2019）；随着微重力暴露延长至第5天，自噬活性受到抑制，凋亡标志物显著增加；继续培养至第10天，细胞死亡加速，表现为存活率急剧下降、细胞大量解体和从微载体上脱落。
由于发现RCCS培养的成骨细胞在第5天表现出明显的自噬抑制和凋亡增强，我们选择这一时间点，通过蛋白质组学分析和公共骨质疏松症（OP）数据库的转录组数据挖掘，研究与微重力诱导的骨质疏松症相关的关键基因及其分子调控机制。这些生物信息学研究聚焦于线粒体自噬机制，旨在为临床诊断、预防和治疗微重力诱导的骨质疏松症提供新的参考。研究发现TSPO（转运蛋白）、ATG12（自噬相关基因12）和BNip3L是调控微重力诱导自噬抑制的关键蛋白。后续使用小鼠后肢卸载实验验证了这些蛋白质在模拟微重力骨质疏松症模型中的上调。基于这些发现，我们推测微重力相关的骨质疏松症涉及自噬抑制向凋亡转变的时间依赖性过程，为未来治疗提供了潜在的时间敏感靶点。
细胞培养与扩增
MC3T3-E1细胞（从兰州大学实验动物中心购买的C57新生小鼠中分离获得）被重新悬浮在含有10%胎牛血清（SEOU BIOLOGY）和1%青霉素/链霉素（Beyotime）的MEM培养基（GIBCO）中。细胞以5×10^4个细胞/平方厘米的密度接种到细胞培养瓶中，并在37°C、5%二氧化碳环境中培养。培养基每48小时更换一次。
系统配置
RCCS-4D生物反应器（CYNTHECON）配备了5/50/150毫升的圆柱形容器
微重力培养细胞的形态变化
在10天的培养期间，通过保持恒定的微载体浓度和初始细胞接种密度，定量监测了细胞的增殖和形态变化。细胞密度随时间增加，从第1天到第5天逐渐升高。值得注意的是，第3天开始出现微载体聚集现象，可能与细胞增殖加速有关；第5天时，聚集区域内的细胞死亡变得明显。
讨论
本研究利用旋转细胞培养系统（RCCS）在模拟微重力条件下连续培养MC3T3-E1（前成骨细胞）10天，并在第1、3、5和10天进行采样，以研究自噬与凋亡之间的动态相互作用。蛋白质组学分析与公共数据库筛选结合，确定了ATG12、TSPO和BNip3L是微重力诱导成骨细胞自噬抑制的关键调控因子。
结论
通过对微重力条件下MC3T3-E1成骨细胞的分析，本研究发现了与成骨细胞功能障碍相关的关键蛋白ATG12、TSPO和BNip3L。研究发现，自噬与凋亡的调控呈现双相模式：最初（第1-3天），自噬增强，通过清除受损成分帮助细胞存活；第5天，由于持续的压力，自噬受到抑制，同时凋亡被激活，导致线粒体功能障碍。
未引用的参考文献
(IRIONDO等，2023；FISCHER等，2019；MAHEMUTI等，2023；GATLIFF等，2017)
CRediT作者贡献声明
杨敖：撰写 – 审稿与编辑；撰写 – 初稿；数据整理。
彭波：撰写 – 初稿；方法学设计。
蓝腾：撰写 – 审稿与编辑；撰写 – 初稿；数据整理。
陈毅：撰写 – 审稿与编辑；撰写 – 初稿。
张世峰：撰写 – 审稿与编辑；撰写 – 初稿；方法学设计。
杨飞：撰写 – 审稿与编辑；撰写 – 初稿；方法学设计。
夏雅怡：撰写 – 初稿；监督。
耿斌：撰写 –
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
