综述：评估氮吸收：植物研究中的方法与应用

《Applications in Plant Sciences》：Evaluating nitrogen uptake: Methods and applications for plant research

　　摘要

氮是植物生长和发育所必需的营养素，对许多生理和生物功能至关重要。由于对氮的需求量很大，农业生产系统通常会在农田中施用大量的氮肥。然而，过度施肥在经济和环境方面都可能带来危害。了解植物从环境中吸收氮的机制对于优化植物生长和农业生产至关重要。在过去的几十年里，研究人员使用了多种方法来量化氮的吸收量，包括使用氮同位素、通过随时间测量溶液中的氮含量减少来评估吸收情况、使用分隔室或琼脂糖块来针对特定的根区，以及最近的小规模技术如纳米级二次离子质谱（nanoSIMS）、微透析和生物标志物。由于玉米对氮的需求量高且在全球粮食和饲料生产中的重要性，许多研究都是针对玉米进行的；不过这些技术也可以应用于任何植物系统。本综述将探讨这些方法的应用，强调它们的优点和局限性。通过研究现有的方法，我们旨在为推进氮吸收研究提供见解，最终支持可持续的氮管理并提高作物生产效率。

植物需要17种营养素，这些营养素可以分为两大类：大量元素（需要大量）和微量元素（需要少量）。氮与钾和磷一起，是三种主要的大量元素之一。氮通常是限制植物生长的最关键营养素，因此其施用量通常比其他任何营养素都要多（Hale等人，2013年）。从1960年到2021年，氮肥的施用量增加了四倍（FAO，2023年）。然而，合成氮肥的过度使用对环境有害，会导致水体和土壤酸化、海洋生态系统富营养化、生物多样性丧失、温室气体排放以及臭氧层破坏（Motavalli等人，2008年）。氮肥价格昂贵，占玉米生产成本的33-44%（Boline，2025年）。尽管投入如此之多，植物在一年中通常只能吸收施用氮的不到50%（Raun和Johnson，1999年；Oenema等人，2009年）。提高我们对氮吸收的理解有助于开发氮利用效率更高的作物，并制定更精确的施肥策略，从而减少合成氮肥使用带来的环境和经济负担。

植物可以吸收无机和有机形式的氮（Yao等人，2020年）。主要的无机氮形式是硝酸盐（NO3?）和铵（NH4+）。有机氮来源包括尿素、氨基酸、蛋白质、核酸和肽。在农业土壤中，溶解的无机氮通常更容易被植物吸收（Jones等人，2005年；Moran-Zuloaga等人，2015年）。虽然铵是植物吸收效率最高的氮形式（Abrol，1990年；Courty等人，2015年），但由于硝酸盐的流动性更强且更易被吸收，因此其吸收量通常更多（Miller和Cramer，2004年）。当植物根部遇到氮时，这种大量元素会通过专门的转运蛋白被吸收（Garnett等人，2013年；Gu等人，2013年；Yu等人，2019年）。这些转运蛋白通常对氮的类型和浓度具有特异性。在玉米中，硝酸盐的吸收通过两个主要系统进行。其中一个系统称为高亲和力转运系统（HATS），当根部暴露于低浓度硝酸盐（<250 μM）时起作用，包括属于硝酸盐转运蛋白（NRT）家族的NRT2转运蛋白，它们对硝酸盐具有高亲和力但吸收速率较低。该系统可以进一步分为组成型（cHATS）和诱导型（iHATS）（Crawford和Glass，1998年），分别代表始终表达的转运蛋白和在检测到低硝酸盐浓度时才被激活的转运蛋白。另一个系统是低亲和力转运系统（LATS），在较高浓度的硝酸盐（>250 μM）下起作用，包括属于硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族（NPF）的转运蛋白，它们对硝酸盐的亲和力较低但吸收速率较高（Abrol，1990年；Glass，2009年）。对于铵的吸收，目前只描述了HATS系统，尽管也可能存在铵的LATS系统（Chiasson等人，2014年）。这些系统共同作用，以在不同环境下优化硝酸盐的吸收。在多种有机氮形式中，氨基酸在植物吸收方面的研究最为广泛（N?sholm等人，2009年；Yao等人，2020年）。氨基酸转运蛋白根据其序列相似性和吸收特性分为两个家族：氨基酸/生长素渗透酶（AAAP）家族（也称为氨基酸转运蛋白家族（ATF）和氨基酸-多胺-有机阳离子（APC）家族（Yao等人，2020年）。与无机氮形式类似，氨基酸转运蛋白也可以分为HATS和LATS两类。尽管已经鉴定并分析了多种氨基酸转运蛋白，但它们的具体作用机制仍不完全清楚。与不同的转运系统存在相关，外部氮的可用性会影响植物的氮吸收速率（Warncke和Barber，1973年；Hole等人，1990年；Raman等人，1995年；Garnett等人，2013年）。由于这些转运系统对外部氮浓度的敏感性，通常在变化的外部氮可用性背景下分析氮的吸收。此外，经历过氮缺乏期后重新补充氮的植物，在短时间内会表现出更高的氮吸收速率（Hole等人，1990年；Siddiqi等人，1990年；Kronzucker等人，1995年；Gazzarrini等人，1999年；Dechorgnat等人，2019年）。因此，在重新施用氮之前先让植物经历一段时间的氮缺乏也是常见的做法，以诱导氮的吸收。尽管对氮转运系统的基本原理有了一定的了解，但由于其复杂性和变异性，氮吸收仍然是植物-营养素相互作用领域中研究不足的部分。氮吸收在多个尺度上存在很大差异，从由物种、基因型或生长条件驱动的整株植物差异，到受根龄或根区等因素影响的根级差异（Reidenbach和Horst，1997年；Sorgonà等人，2011年）。尽管存在这种变异性，大多数研究仍集中在易于分析的水培幼苗上。这种有限的关注范围导致我们对不同物种、环境和植物发育阶段的氮吸收理解存在空白。此外，许多研究未能将氮转运蛋白的基因表达与氮吸收联系起来。这里描述的方法通常用于一般的吸收测量，但也可以通过使用氮突变体或将吸收研究与转录组研究相结合来填补这一知识空白。本综述中描述的方法各有优缺点（表1和表2），但它们都旨在提高我们对植物系统中氮吸收的理解。继续改进现有测量方法并开发新方法对于推进植物营养学知识和后续农业生产力的提高至关重要。

表1. 微尺度氮吸收测量方法的优点和缺点

方法 | 优点 | 缺点 |
|------|------|------|
| 15N示踪剂 | - 可区分氮来源 | - 可能存在根部的氮流失影响测量结果 |
| | - 高精度 | - 同位素分馏可能导致低估 |
| | - 设备和劳动力需求低 | - 需要同位素比质谱（IRMS）；结果可能延迟 |
| 13N示踪剂 | - 可实现实时测量 | - 半衰期短，需要专用设备和快速实验 |
| | - 高精度 | - 需要昂贵设备 |
| | - 无法测量淹没根部根部的实时吸收 | - 只能测量净吸收量，不包括流失量 |
| | - 对切割的根部敏感 | - |
| 琼脂 | - 可测量特定根区的氮吸收 | - 需要昂贵的设备 |
| | - 可提供近乎即时的结果 | - 无法进行多次连续测量 |
| 分隔室 | - 允许原位测量 | - 需要年轻且侧根较少的根部 |
| | - 可针对特定根区 | - 可能存在示踪剂泄漏 |
| | - 需要定制的分隔室 | - |
| nanoSIMS | - 提供亚细胞水平上15N位置的高精度可视化 | - 需要昂贵的设备 |
| | - 样品制备复杂 | - 通量低 |
| 微透析 | - 原位且破坏性小 | - 能捕捉氮可用性的时间变化 |
| | - 可区分氮的形式 | - 需要额外的方法来测量吸收 |
| 分别收获 | - 不需要操作植物或环境 | - 直接测量氮含量 |
| | - 破坏性较强 | - 时间和空间分辨率低 |
| 高光谱成像 | - 非破坏性，无需操作植物即可重复测量 | - 依赖于叶绿素含量估计氮含量 |
| | - 可实现大规模/高通量表型分析 | - 对环境条件敏感 |
| 荧光传感 | - 非破坏性，无需操作植物即可重复测量 | - 依赖于叶绿素含量估计氮含量 |
| | - 可实现大规模/高通量表型分析 | - 敏感于环境条件 |
| 计算氮吸收和动力学 | - 可使用多种动力学和非动力学方法计算氮吸收 | - 动力学方法需要测试多种底物浓度 |

表2. 宏尺度氮吸收测量方法的优点和缺点

方法 | 优点 | 缺点 |
|------|------|------|
| 顺序收获 | - 不需要操作植物或环境 | - 需要昂贵的设备 |
| | - 直接测量氮含量 | - 破坏性强 |
| | - 时间和空间分辨率低 | - 比其他宏尺度方法更费力 |
| 高光谱成像 | - 非破坏性，无需操作植物即可重复测量 | - 依赖于叶绿素含量估计氮含量 |
| | - 可实现大规模/高通量表型分析 | - 对环境条件敏感 |
| 荧光传感 | - 非破坏性，无需操作植物即可重复测量 | - 依赖于叶绿素含量估计氮含量 |
| | - 可实现大规模/高通量表型分析 | - 敏感于环境条件 |
| 计算氮吸收和动力学 | - 可使用多种动力学和非动力学方法计算氮吸收 | - 动力学方法需要测试多种底物浓度 |

氮吸收的计算可以通过多种动力学和非动力学方法进行。动力学方法需要测试多种底物浓度，而非动力学方法则不需要。非动力学方法的例子包括上述的宏尺度方法，如比较植物中氮含量的变化，或使用遥感技术。其他方法包括使用同位素标记的氮来追踪氮的移动或从高浓度下的最大吸收量，或在单浓度下测量水培溶液中的氮消耗。这些方法有助于在不改变浓度的情况下估算植物的总吸收量。然而，它们提供的关于氮吸收机制调节的信息较少。另一方面，动力学模型有助于分析不同外部氮浓度对转运蛋白活性的影响。动力学研究对于了解转运蛋白的特性非常重要，因为不同的转运系统在低或高浓度下有不同的功能。了解作物及其转运蛋白在特定氮浓度下的功能对于制定施肥策略尤为重要。例如，表达更多HATS转运蛋白的植物可能只需要少量的肥料，而表达更多LATS转运蛋白的植物可能需要更高水平的肥料才能达到最佳生长状态。在选育过程中，也可以考虑这些特性，以选择在特定氮条件下表现更好的植物。历史上，植物根部对氮离子的吸收动力学一直使用Michaelis-Menten酶-底物饱和动力学模型进行建模。该模型最初由Epstein和Hagen（1952年）用于模拟根部营养吸收，其公式如下：

其中In表示营养素的吸收或流入速率，Imax表示最大吸收速率，C表示溶液中的外部氮浓度，Cmin表示吸收所需的最小浓度，Km表示转运蛋白和离子的结合亲和力。简而言之，随着溶液中氮浓度（C）的增加，营养素的吸收速率（In）也会增加，直到达到一个平台值（Imax），此时转运蛋白的结合位点已饱和。Km表示转运蛋白和离子之间的结合亲和力，等于半饱和浓度（1/2Imax）（Griffiths和York，2020年）。为了确定Imax和Km，需要计算在不同浓度下的吸收速率。建议至少在10个不同的浓度下进行计算，这些浓度范围是从预期Km的10分之一到10倍（Engels等人，2000年）。然而，这个过程需要大量的时间和资源。因此，更常见的方法是使用非常高的氮浓度来确定最大吸收速率。这个模型对我们理解营养运输系统非常重要，它导致了两个独立运输系统（HATS和LATS）的发现，这两个系统分别在高浓度和低浓度下发挥作用（Epstein和Hagen，1952年）。尽管这个模型仍然适用于基本计算和广泛的应用，但它可能不足以进行运输器活性的深入分析。该模型假设整个运输系统的吸收可以用一个方程来表示；然而，这种假设可能会掩盖个别运输器对氮浓度响应的独特特性。因此，Griffiths和York（2020年）提出了两种替代模型：一种是在细胞水平上使用的porter-diffusion模型，另一种是在宏观尺度上使用的flow-force解释模型（Le Deunff等人，2016年）。这些模型提供了对特定运输机制的更多见解，并更好地捕捉了氮运输器的动态行为。

全面理解植物与氮的关系需要高效且准确的方法来测量植物的氮吸收。现有的方法包括宏观尺度的方法，如监测整个植物或种群随时间变化的氮状态，以及针对单个根或特定氮运输器的微观尺度技术。虽然本综述将重点介绍微观尺度方法，但了解宏观尺度方法及其如何增进我们对农业系统中氮吸收的理解也是重要的。宏观尺度方法可以是破坏性的或非破坏性的。一种破坏性的宏观尺度方法是顺序收获，即在两个不同的时间点收获植物，并比较这两个时间点之间的生物量氮含量（Engels等人，2000年）。如果氮含量随时间显著增加，表明在那个生长期间氮吸收量很高；而氮含量差异微不足道则可能表明吸收量有限或已经饱和。虽然这种方法不需要对植物或环境进行任何操作，但其结果在时间和空间上的分辨率较低。此外，由于它是破坏性的，因此必须在不同的植物之间进行比较，这增加了解释的复杂性和变异性。该方法可以修改以包括对植物或环境的操作。然而，改变土壤条件可能会使区分氮吸收差异是由于植物自身的吸收还是由于氮可用性的变化变得困难。非破坏性的宏观尺度方法的例子包括高光谱成像或荧光传感，通过无人机等成像设备可以检测作物冠层的叶绿素含量，并将其作为叶片氮含量的代理指标。高光谱成像测量特定波长的反射光，而荧光传感器测量包括叶绿素在内的化合物吸收和重新发射的光。氮对叶绿素的产生至关重要，因此叶绿素含量通常与叶片氮含量有很好的相关性（Delloye等人，2018年）。尽管如此，包括生长阶段、品种、水分和其他营养缺乏在内的多个变量也可能影响叶绿素含量，从而限制了这些方法的准确性和可比性。此外，这些方法无法检测由于叶绿素饱和导致的过度施肥（Mu?oz-Huerta等人，2013年）。尽管存在这些限制，但对植物或环境的最小化操作有利于在大规模和时间跨度上研究氮吸收。每种测量氮吸收的方法都在成本、精度、实际应用性和对植物系统的干扰方面存在权衡。宏观尺度方法提供了关于实际氮吸收的信息，但无法揭示特定吸收机制的细节（表2）。相比之下，微观尺度方法可能揭示特定根、特定根区域或特定运输器的氮吸收细节，但其结果可能不能直接代表整个植物或在实际环境中的氮吸收（表1）。尽管有这个限制，研究氮吸收的微观机制可以导致有针对性的解决方案，例如培育具有更高效氮吸收系统的植物。一旦开发出这样的植物，就可以使用宏观尺度技术在更现实的农业环境中验证结果。

**微观尺度氮吸收方法**

**15N示踪剂方法**

测量氮吸收最常见的方法之一是使用稳定同位素15N作为示踪剂。氮在环境中通常以14N的形式存在，但稳定同位素15N也以非常低的水平自然存在，大约占总氮的0.36%。当14N被15N替换后，只要15N的量足够多，使得自然背景水平可以忽略不计，就可以测量根吸收的15N量。这种方法的常见应用是将根（无论是切下的还是完整的）放入含有至少一种15N标记氮源（如15NO3?或15NH4+）的溶液中，并让植物在规定的时间内吸收氮。这个时间长度可能因植物种类、氮浓度或要分析15N含量的根类型或区域而异。这个时间长度必须足够长，以便根吸收可测量的氮量，同时又足够短，以最小化根部的任何外排，并且不会改变运输器对处理溶液的反应。根的15N吸收研究使用的时间长度从10分钟（Garnett等人，2013年）到30分钟（Wang和Tsay，2011年；Ishaya和Rasmussen，2024a年），甚至2小时（Rao等人，1997年）不等。在所有情况下，根都必须从吸收溶液中取出并彻底冲洗，以去除根表面和胞外空间中的多余示踪剂。冲洗溶液可以是任何不含15N示踪剂的溶液。一些报告使用蒸馏水（Rao等人，1997年），而其他报告使用CaSO4来帮助保持膜完整性（Minorsky和Spanswick，1989年；Engels等人，2000年；Wang和Tsay，2011年）。冲洗溶液还可以含有比吸收溶液中高得多浓度（10-100倍）的未标记氮形式（Engels等人，2000年）。在其他报告中，使用多次冲洗或多种冲洗溶液，通常首先用KNO3冲洗以释放表皮上的标记物，然后用水冲洗（Garnett等人，2013年；Ishaya和Rasmussen，2024a年）。需要注意的是，对于一些温度敏感的植物（如玉米），洗涤溶液的温度显著降低可能会导致营养物质渗入洗涤溶液中（Minorsky和Spanswick，1989年）。冲洗后，根组织样本可以干燥、研磨并分析其15N含量。15N含量的分析通常使用同位素质谱法（IRMS）进行。简而言之，IRMS首先燃烧样本，然后用电子轰击分子使其离子化。离子随后通过磁铁，磁铁会将较轻的离子拉得比较重的离子更近，从而按重量分离离子。然后可以计算不同离子的比例（14N:15N）（Sharp，2017年）。IRMS通常与元素分析仪结合使用，以测量样本的总氮含量。结合这些测量结果，可以计算样本的总15N含量。根据15N含量的测量结果，可以使用Michaelis-Menten方程计算吸收速率（In）或单个根的总氮吸收量（Imax），并在多个浓度下计算结合亲和力（Km）（Bassirirad，2000年；Ishaya和Rasmussen，2024b年）。这种方法还可以提供关于在不同吸收溶液（每种溶液含有不同的标记氮源，例如铵、硝酸盐、氨基酸等）下氮源偏好的见解。在这种情况下，可以通过比较不同样本中标记氮源的吸收速率来确定偏好来源。然而，这种方法对于原位研究效果较差，因为氮在植物吸收之前可能会发生生物地球化学变化。例如，铵可能被氧化为硝酸盐，或者氨基酸可能分解为无机氮的形式。因此，植物吸收的15N可能不反映最初施加的形式。还可以将15N以气体形式施用于研究植物对氮的吸收，例如已经证明玉米的地上根与固氮细菌有关（Van Deynze等人，2018年）。15N示踪剂还允许追踪植物内部的氮同化过程。这要求供给15N的根保持完整并且受到最小的干扰。在根部供给后，可以从植物的空间分离区域（例如根、茎或叶）收集组织样本并测量其15N含量。保持采样位置的一致性很重要，因为15N富集程度在不同组织和同一组织内部可能会有所不同。15N富集的组织样本应与未处理植物的样本进行比较，以考虑任何存在的背景15N。特别是要为植物提供足够的15N足够长的时间，因为在远离根部的地方收集样本，或者在生物量较大的植物中，15N在植物内部移动时可能会被显著稀释。此外，15N含量可能受到氮损失过程的影响，例如从根部重新释放到吸收溶液中，或者在叶片中通过挥发损失。另外，应该考虑到15N在生物系统中的行为可能并不总是与14N完全相同（Carlisle等人，2014年），因为15N会受到同位素分馏的影响，即较轻的14N同位素比较重的15N同位素更易被选择。为了考虑到这种可能性，拥有几个14N对照样本并在吸收后比较总氮含量可能是有益的，以查看是否发生了分馏。因此，15N示踪剂方法可以提供吸收和同化的直接证据，但它也受到实验因素的干扰。

**完整根系与切下根系的15N吸收**

为了测量15N吸收，最好在15N供给期间根仍然附着在植物上，以获得最生理相关的结果。当根从植物上切下时，营养吸收可能会受到干扰（Engels等人，2000年；Falkengren-Grerup等人，2000年；Brackin等人，2015年）。尽管切下根的吸收可能不能直接代表实际情况，但这些测量对于某些目的仍然有用，例如比较不同根类型、基因型或表征特定膜结合氮运输器的活性（Garnett等人，2013年；Gu等人，2013年；Ishaya和Rasmussen，2024b年）。另一方面，完整的根系提供的结果更接近实际情况，但也可能受到几个因素的影响，这些因素也会影响吸收结果的准确性。例如，通常使用水培植物的完整根，但它们的根发育和营养吸收不能代表土壤种植的植物。如果在田间种植植物，那么在从土壤中挖掘植物进行测试时，根可能会受损，任何菌根连接也会断裂，进一步降低了实际应用的可行性。为了避免这种情况，可以在rhizobox或允许轻松接触根部的装置中种植植物，同时尽量减少干扰。需要注意的是，在这些条件下生长的植物可能与田间种植的植物具有不同的根结构，并且由于受控的生长条件，营养可用性可能会有所不同，这可能会影响氮吸收速率。为了避免这些缺点，也可以在未受干扰的田间种植的植物上进行15N吸收研究。虽然这更多地关注氮的同化而不是特定根的吸收，但它减少了根部的损伤，同时保持了自然生长条件。为了测量野外生长植物的15N吸收情况，可以将15N直接撒在土壤表面（Vos等人，1993年；Gardner和Drinkwater，2009年），或者将其倒入植物附近的沟槽中（Ishaya和Rasmussen，2024b年），然后测量植物内部的积累量。这种方法对植物或其根系造成的损害极小或没有损害，但难以直接控制可供植物根系吸收的15N浓度。此外，由于改变了土壤中的15N含量，这可能会影响在同一块田地里进行的后续实验。另一种方法是使用13N示踪剂。

13N示踪剂方法涉及使用放射性同位素13N。当13N发生正电子衰变时，会向相反方向发射两个γ射线（Kiyomiya等人，2001年）。这些射线可以通过液体闪烁计数器进行测量（尽管这种方法无法实现实时分析），或者使用由日本Hamamatsu Photonics公司和Takasaki Ion Accelerators for Advanced Radiation Application（TIARA）团队开发的正电子发射示踪成像系统（PETIS）进行测量（Matsunami等人，1999年；Kiyomiya等人，2001年）。PETIS利用闪烁相机检测γ射线，能够实时观察二维空间中元素的移动情况（Kiyomiya等人，2001年）。另一种分析方法是正电子发射断层扫描（PET）成像技术，可以在短时间内对活体对象内的放射性标记分子（如13N）进行非破坏性的空间和动态测量（Kronzucker等人，1995年；Komarov和Tai，2022年）。正电子（包括13N）是通过回旋加速器产生的。由于13N的半衰期很短（9.97分钟），因此需要使用当地的回旋加速器。13N通常是通过H2O的质子辐照产生的，主要生成硝酸盐（13NO3?）。如果需要，可以使用Kronzucker等人（1995年）描述的化学方法将其转化为铵盐（13NH4+）。使用13N示踪剂测量氮吸收通常是在水培条件下生长的幼苗的完整根系上进行的。根系先在未标记的营养液中生长，然后在测量前立即转移到含有13N的溶液中。Kiyomiya等人（2001年）使用PETIS探测器研究了水稻根系中对13NH4+的吸收和移动情况。他们将一株植物放入一个不含铵盐的吸收溶液中，并将装有溶液的袋子放在两个PETIS探测器之间，探测器分别对准植物的基部或叶片（图1）。随后向吸收溶液中加入13NH4+，探测器记录60分钟内的γ射线发射情况。之后将植物从溶液中取出，冲洗根系以去除多余的13NH4+，并将植物放入Bioimaging Analyzer System（BAS-1500成像系统；富士胶片公司，日本东京）中进行10到20分钟的成像。

简化的13N吸收实验装置示意图显示：植物被放置在含有13N的吸收溶液中，位于两个正电子发射示踪成像系统（PETIS）探测器之间，这两个探测器可以测量植物基部的13N吸收情况。13N示踪剂方法还可以用于计算总氮吸收量、实时吸收速率以及氮在植物内部的迁移路径。为了测量总氮吸收量，将植物置于含有13N的溶液中一段时间后取出，用普通14N溶液清洗以去除表面残留的13N，然后计算根系中的13N含量。如Kiyomiya等人（2001年）所述，可以使用闪烁成像技术实时测量氮吸收速率。还可以生成热图来显示13N在植物内部的迁移路径及其浓度。结果也可以以数值形式呈现，从而绘制出放射性随时间的变化曲线。尽管许多使用13N进行吸收研究的工作是在20多年前完成的，但最近的文章（Mincke等人，2021年；Komarov和Tai，2022年）指出，由于PET成像技术在临床研究中的普及，它在植物研究中的前景十分广阔。预计PET设备将变得更加普遍，从而更易于在植物研究中使用。然而，获取当地回旋加速器来生产13N仍将是这些分析的限制因素。

另一种测量氮吸收的方法是通过消耗法。消耗法通过监测吸收溶液中氮浓度的变化来测量氮的吸收情况。初始氮浓度与最终氮浓度之间的差异归因于根系的净吸收量。这些测量数据可用于计算净氮吸收速率和总氮吸收能力。虽然这种方法不需要使用标记的氮示踪剂，但可以使用15N来进一步确定氮在植物内部的迁移情况。Jia等人（2023年）使用这种方法研究了玉米幼苗的氮吸收速率。幼苗在含有硝酸盐的营养液中生长，实验前96小时处于氮饥饿状态。然后将完整的根系放入含有硝酸盐的吸收溶液中。在不同时间点采集根系和溶液样本，记录根系的新鲜重量，并使用硫酸-水杨酸法（Cataldo等人，1975年）在410纳米波长下测量溶液中的NO3?含量。该方法通过硝酸盐与水杨酸在硫酸中的反应生成硝基水杨酸，后者与碱（如NaOH）混合后会变成黄色，通过测量OD410值进行定量。在这项研究中，每个根系仅在采集时采样一次（Zhao和Wang，2017年）。或者，也可以对同一根系在不同时间点反复测量溶液中的氮含量。例如，Sorgonà等人（2011年）将根系暴露在含有50 μM KNO3?的营养液中，每10分钟采集100 μL溶液样本，持续60分钟，并使用紫外-可见光（UV-Vis）分光光度计在210纳米波长下测量硝酸盐浓度。UV-Vis分光光度计的工作原理是将紫外光到可见光范围内的光照射到样品上并测量吸收的光量（Agilent Technologies，2025年）。由于硝酸盐在210纳米波长处有强吸收，因此可以通过这种方法对其进行定量（Maguire等人，2022年）。还开发了一种名为RhizoFlux的高通量表型分析平台，可以同时分析多种离子的吸收动力学（Griffiths等人，2021年）。RhizoFlux利用消耗法，多个植物分别生长在独立的水培室中，通过离子色谱法测量特定营养素的净吸收速率。利用RhizoFlux，研究人员能够同时量化不同营养素的吸收速率，这更符合植物在野外同时接触多种营养素的情况。然而，RhizoFlux无法完全模拟野外复杂的根系-土壤相互作用，因此结果应谨慎解释。消耗法可以应用于整个根系、单个根系或根系的特定区域。对于大型根系（如树木），由于难以在实验室环境中培养，也可以在现场进行消耗法研究。

除了使用同位素氮源测量吸收外，还可以通过消耗法来测量吸收情况。消耗法通过监测吸收溶液中氮浓度随时间的变化来测量氮的吸收量。初始氮浓度与最终氮浓度之间的差异反映了根系的净吸收量。这些测量数据可用于计算净氮吸收速率和总氮吸收能力。虽然这种方法不需要标记的氮示踪剂，但可以使用15N来进一步确定氮在植物内部的迁移情况。Jia等人（2023年）使用这种方法研究了玉米幼苗的氮吸收速率。幼苗在含有硝酸盐的营养液中生长，实验前96小时处于氮饥饿状态。然后将完整的根系放入含有硝酸盐的吸收溶液中。在不同时间点采集根系和溶液样本，记录根系的新鲜重量，并使用硫酸-水杨酸法测量溶液中的NO3?含量。如Kiyomiya等人（2001年）所述，可以使用闪烁成像技术实时测量氮吸收速率。还可以生成热图来显示氮在植物内部的迁移路径及其浓度。结果也可以以数值形式呈现，从而绘制出放射性随时间的变化曲线。尽管许多使用13N的研究是在20多年前进行的，但最近的文章（Mincke等人，2021年；Komarov和Tai，2022年）指出，由于PET成像技术在临床研究中的普及，它在植物研究中的前景十分广阔。预计PET设备将更加普及，因此在植物研究中将更加普遍和易于使用。然而，获取当地回旋加速器来生产13N仍将是这些分析的限制因素。

另一种替代方法是通过消耗法测量吸收情况。这种方法通过监测吸收溶液中氮浓度的变化来测量氮的吸收量。初始氮浓度与最终氮浓度之间的差异反映了根系的净吸收量。这些测量数据可用于计算净氮吸收速率和总氮吸收能力。虽然这种方法不需要标记的氮示踪剂，但可以使用15N来进一步确定氮在植物内部的迁移情况。Jia等人（2023年）使用这种方法研究了玉米幼苗的氮吸收速率。幼苗在含有硝酸盐的营养液中生长，实验前96小时处于氮饥饿状态。然后将完整的根系放入含有硝酸盐的吸收溶液中。在不同时间点采集根系和溶液样本，记录根系的新鲜重量，并使用硫酸-水杨酸法（Cataldo等人，1975年）在410纳米波长下测量溶液中的NO3?含量。这种方法每次仅对每个根系采集一次样本（Zhao和Wang，2017年）。或者，也可以对同一根系在不同时间点重复测量溶液中的氮含量。例如，Sorgonà等人（2011年）将根系暴露在含有50 μM KNO3?的营养液中，每10分钟采集100 μL溶液样本，持续60分钟，并使用紫外-可见光（UV-Vis）分光光度计在210纳米波长下测量硝酸盐浓度。UV-Vis分光光度计的工作原理是将紫外光到可见光范围内的光照射到样品上并测量吸收的光量（Agilent Technologies，2025年）。由于硝酸盐在210纳米波长处有强吸收，因此可以通过这种方法进行定量（Maguire等人，2022年）。还开发了一种名为RhizoFlux的高通量表型分析平台，可以同时分析多种离子的吸收动力学（Griffiths等人，2021年）。RhizoFlux利用消耗法，多个植物分别生长在独立的水培室中，通过离子色谱法测量特定营养素的净吸收速率。利用RhizoFlux，研究人员能够同时量化不同营养素的吸收速率，这更符合植物在野外同时接触多种营养素的情况。然而，RhizoFlux无法完全模拟野外复杂的根系-土壤相互作用，因此结果应谨慎解释。消耗法可以应用于整个根系、单个根系或单个根系的特定区域。对于大型根系（如树木），由于难以在实验室环境中培养，也可以在现场进行消耗法研究。McFarlane和Yanai（2006年）研究了多种不同的消耗法变体，用于测量成熟树木完整根系的氮吸收情况。消耗法有多种变体（见下文“琼脂块法”和“分隔容器法”），可以根据需要进行调整。

琼脂块法是一种消耗法的变体，通过测量外源施加到根系的琼脂块中的氮消耗量来进行测量。将标记或未标记的氮溶解在琼脂混合物中并使其凝固。然后将已知大小和体积的琼脂块直接施加到感兴趣的根系或根系区域。琼脂块作用一段时间后，将其从根系上取下并煮沸溶解，然后量化溶液中剩余的氮含量（Reidenbach和Horst，1997年）。使用氮示踪剂可以获得类似的信息，并且还可以确定植物内部的同化模式。还应设置对照组，在整个吸收实验期间，将不含氮的琼脂块留在实验位置而不与根系接触。可能会发生挥发、沉淀或淋溶等反应，导致琼脂中的氮含量随时间减少（Engels等人，2000年）。Reidenbach和Horst（1997年）使用这种方法测量了在营养液和根箱中生长的玉米植物不同根区的NO3?吸收情况。为了测量水培植物的吸收情况，玉米植物在含有1 mM硝酸盐的溶液中生长12天后，再放入不含硝酸盐的溶液中2天。然后用含有1 mM硝酸盐的琼脂块覆盖主根。8小时后，取出琼脂块，煮沸溶解，然后离心并测定上清液中的NO3?含量。根据琼脂块的消耗量和相应根段的表面积计算硝酸盐吸收速率。根箱中生长的根系的吸收情况也采用类似方法测量。可接触的根系（沿观察玻璃生长的根系）用含有1 mM硝酸盐的琼脂块覆盖6小时。6小时后，取出琼脂块并按照前述方法测定NO3?含量。

分隔容器法是消耗法的另一种变体，与琼脂块法类似，也可以测量特定根区的氮吸收情况。与琼脂块法不同，这种方法测量的是根系的三维截面的吸收情况，而不仅仅是二维表面的吸收情况。简而言之，一个带有多个隔间的容器通过小孔连接，容器内填充土壤或营养液。根系穿过每个隔间的孔洞，从而穿过所有隔间（图2）。每个孔洞用凡士林或硅胶等物质密封，以防止吸收液在隔间之间流动。然后可以通过测量选定隔间中的营养液消耗量（Sorgonà等人，2011年）或向一个隔间施加示踪剂并测量植物内部的积累量（Drew和Saker，1986年）来测量根系的吸收情况。这种方法通常用于水培生长的幼苗。Sorgonà等人（2011年）通过将7天大的玉米幼苗的主根放入一个有五个2 × 2厘米隔间的容器中，测量了沿玉米主根轴的硝酸盐吸收的空间变异性。根系穿过每个隔间的3毫米孔洞，并用硅胶密封。接下来，根系用含有50 μM KNO3的通气营养液预处理0、4、6、8和24小时。在吸收实验开始时，将营养液替换为相同的溶液，并在60分钟内每10分钟采集一次样本（100 μL），然后用紫外-可见光（UV-Vis）分光光度计在210纳米波长下测量NO3?浓度。这种方法也可以在野外进行，例如将根系培养在袋子或托盘中，或者轻轻挖掘土壤表面的根系（McFarlane和Yanai，2006年）。

如图2所示，这是一个潜在的分隔室装置示意图，根系穿过分隔室之间的开口。然后密封这些开口，每个隔间可以填充所需的吸收溶液。

如上所述，像15N这样的稳定同位素有助于监测整个组织的氮吸收或迁移模式。这些技术适用于整个根系或整个植物的信息分析，并允许进行较大规模的高通量分析；然而，它们缺乏研究微观细胞或亚细胞水平过程所需的详细空间信息。这就是像二次离子质谱（SIMS）这样的技术发挥作用的地方。SIMS可以成像组织内的离子分布，包括区分不同的同位素（如15N和14N）。SIMS分析是在高真空环境下进行的，其中一束离子轰击表面，使表面产生二次离子（即被散射的离子）。质量略有不同的二次离子会有不同的反应，从而形成不同的散射模式（Moore等人，2012年）。当这束离子扫描过组织（例如一片叶子）时，每个位置的散射情况都会被记录下来，从而形成特定离子分布的图像。如果在散射中检测到15N，就可以确定该离子在叶子上的空间位置。SIMS有两种类型：静态SIMS和动态SIMS。简而言之，静态SIMS使用较低的能量，可以识别大分子（质量从1到超过10,000 Da），因为低能量束流不会破坏化合物的结构（而高能量束流会将化合物分解成更小的成分），但会牺牲空间分辨率。相比之下，动态SIMS使用高能量的离子束轰击表面，这种方法在纳米尺度上非常精确（因此可用于纳米SIMS），但只能用于氮等小分子或原子离子（Moore等人，2012年）。对纳米尺度表面离子反应的分析称为纳米SIMS，其分辨率可以达到50 nm（对于负离子）和150 nm（对于正离子）（Moore等人，2012年；Kopittke等人，2020年）。负离子和正离子检测之间的空间分辨率差异与离子束能量有关，因为使用铯束产生负离子，而使用氧束产生正离子。氧束的能量高于铯束，它们会引发更广泛的二次正离子散射，需要进一步过滤，从而降低了分辨率。由于这种高分辨率，纳米SIMS已被用于研究根际中的氮（和碳）动态（Jones等人，2013年）、特定土壤类型的有机物分解（Kopittke等人，2018年）、菌根根尖处真菌与根细胞之间的氮和碳交换（Mayerhofer等人，2021年），以及由植物微生物（Schmidt等人，2023年）或内生或叶相关微生物群落（Tarquinio等人，2018年；Sher等人，2024年）分解的氮的模式。由于纳米SIMS分析是在高真空下进行的，因此去除样品中的水分非常重要（Moore等人，2012年）。为此，通常先将样品冷冻然后脱水，或者将样品固定、脱水并嵌入树脂中（Moore等人，2012年；Jones等人，2013年）。虽然纳米SIMS在提供这种精细尺度过程的信息方面具有巨大潜力，但其准备过程和所需时间限制了该技术在大样本量中的应用，如上述其他技术中使用的那样。当然，选择哪种技术取决于所要解决的研究问题。

微透析在神经生物学中得到了广泛应用（Bungay等人，1990年；Saylor和Lunte，2015年），但最近也被用于土壤采样（Inselsbacher等人，2011年，2014年；Oyewole等人，2014年）。微透析的具体应用取决于它与哪种分析技术的结合，但它可以用来监测不同生态系统中的养分模式、有机和无机氮的模式、靠近植物根部的情况，或者比较不同类型的土壤（见下文其他示例）。该方法依赖于离子从土壤穿过半透膜，沿着浓度梯度进入采样管。收集到的含有土壤来源离子的溶液可以使用比色反应或超高效液相色谱（UPLC）等方法进行分子定量分析。UPLC能够分离多种小分子和离子，而比色方法基于反应，只能定量参与反应的分子。UPLC还配备了高精度检测器，提供了比色方法更高的定量准确性；此外，它是一种微创方法，只去除溶解的化合物而不影响周围土壤中的水分。需要注意的是，微透析并不直接测量植物对氮的吸收，而是测量土壤中可利用的氮含量——类似于上述的耗尽法，但具有更高的空间分辨率。这可以提供关于田间养分浓度、移动性和周转率的见解，并且几乎是实时的。在土壤中，该方法已被证明能够测量痕量金属、氯化物、氮和低分子量有机阴离子（Miró和Frenzel，2003年；Miró等人，2005年；Rosende等人，2013年；Cocovi-Solberg等人，2014年）；当与三维微计算机断层扫描（microCT）成像结合使用时，可以提供关于具有已知土壤结构或距离根部的位置的养分信息（Brackin等人，2017年）。尽管它不直接测量植物对氮的吸收，但它可以与上述的吸收方法结合使用，以获得更全面的植物-氮关系概述。

尽管几十年来已经在许多植物系统中研究了氮的吸收，但仍然存在一些关键的知识空白，有机会改进我们对植物氮吸收的理解。了解目前使用的方法可以帮助研究人员为他们的实验问题选择最佳方法（图3），从而进一步加深我们对植物-氮相互作用的理解。需要对现有的氮吸收测量方法进行全面比较，以验证其准确性，并识别不准确之处，最终改进这些方法。未来的研究应该重点比较基于精度的技术（如PET成像）与更可扩展和实用的方法（例如耗尽法）。平衡精度、可扩展性和实际应用的相关性对于推进我们对氮吸收及其对可持续农业的实际影响的理解是必要的。图3在图查看器中打开

决策树用于根据实验目标确定最佳的氮吸收测量方法。还应研究方法之间的差异。标准化关键变量，如暴露于吸收溶液的时间长度、氮浓度、冲洗协议以及是否包含CaSO4，将有助于更容易地比较不同研究的结果。这将提供对特定作物以及不同作物之间氮吸收的更全面理解。此外，其中一些变量仍需要进一步研究。例如，某些去除15N示踪剂的冲洗步骤可能会在细胞外空间或根表面留下未吸收的氮，或者可能引发显著的流出。需要更多的研究来确定平衡这些权衡的最佳冲洗协议，并评估冲洗是否足以清除细胞外空间中的示踪剂，同时限制显著的流出。最近研究玉米氮吸收机制的努力越来越多地集中在氮转运蛋白上（Quaggiotti等人，2004年；Trevisan等人，2008年；Gu等人，2013年；Garnett等人，2013年，2015年；Dechorgnat等人，2019年），然而转运蛋白水平的吸收动力学仍然知之甚少（Griffiths和York，2020年）。虽然许多在玉米中进行的研究已经确定了氮转运蛋白基因表达与吸收速率之间的关系（Quaggiotti等人，2004年；Trevisan等人，2008年；Garnett等人，2013年，2015年；Lupini等人，2016年），但它们尚未研究Imax或Km等运输动力学参数。将吸收测量技术与转录组数据和机器学习相结合可以加强这种关系，从而更好地理解氮吸收机制。此外，尚未研究转录本丰度与转运蛋白密度之间的关系（Griffiths和York，2020年）。尽管预测较高的转录本丰度会导致较高的转运蛋白密度，从而提高吸收水平，但这尚未得到证实。除了氮转运蛋白的基因表达外，根系结构也在氮吸收中起作用。因此，一个同时考虑根系结构和转运蛋白动态的物理模型将是有益的，并且比单独的动力学建模提供更多信息。在更大范围内，使用响应氮的基因作为生物标志物来确定植物的氮状态已经显示出前景。Yang等人（2011年）证明了一组响应氮的基因的表达谱与植物的氮状态成正比。作者能够利用这些生物标志基因在田间生长的植物中非破坏性地监测氮状态。这种方法可能有助于弥合基于实验室的研究和基于田间研究之间的差距。生物标志物检测也可能是一种有用的预测技术，适用于种子选择和育种或评估中期氮状态。然而，这种方法尚未被广泛采用。需要注意的是，本综述中描述的微尺度测量技术是在理想化的实验室条件下确定氮吸收速率的。最终目标是为了更好地理解并在田间环境中最终提高氮吸收。未来的研究可能会设计出针对特定作物的氮吸收系统，考虑环境变量，如氮的可用性、降水量和光照。需要研究来弥合实验室和田间条件之间的差距，评估这些环境下的氮吸收差异。这可能涉及整合宏观技术或开发新的方法来测量现实田间情景中的氮动态。这样的进步对于提高农业中的氮利用效率和支持可持续作物生产至关重要。

E.P.撰写了初稿。A.R.和E.E.S.获得了资金支持。所有作者共同构思了研究主题，修订了手稿，并批准了最终版本的手稿。

这项工作得到了皇家学会（国际交流基金IES\R1\211169给A.R.和E.E.S.）和国家科学基金会（奖项编号2109189给E.E.S.）的支持。

在准备这篇综述时没有使用任何原始数据集。